Bivalentná živá atenuovaná vakcína proti chrípkovému vírusu chráni pred driftovanými klinickými izolátmi H1N2 a H3N2 u ošípaných, časť 1

Abstrakt:

Vírusy chrípky A (IAV) môžu spôsobiť vysoko nákazlivé respiračné ochorenie mnohých druhov cicavcov. U ošípaných spôsobujú IAV vysokú chorobnosť a nízku úmrtnosť u citlivých populácií, čo môže mať významný finančný a produkčný vplyv. Môžu tiež predstavovať príležitosti na mutácie a preskupenie génov, čím vznikajú kmene chrípky s pandemickým potenciálom.

Chrípka A je vysoko nákazlivé ochorenie dýchacích ciest, ktoré predstavuje vážnu hrozbu pre globálne verejné zdravie. Štúdie súvisiace s imunitou ukázali, že silný imunitný systém môže ľuďom pomôcť lepšie bojovať proti vírusu, keď sú infikovaní vírusom chrípky, čím sa znižuje výskyt a závažnosť ochorenia.

Imunita je schopnosť nášho imunitného systému bojovať proti chorobám. Imunitný systém človeka sa skladá z dvoch častí: vrodená imunita a získaná imunita. Vrodený imunitný systém je to, s čím sa rodíme, a má schopnosť celého tela brániť sa proti chorobám. Získaný imunitný systém je imunita, ktorú postupne v živote máme, najmä zahŕňa humorálnu imunitu zloženú z imunitných buniek a protilátok a bunkovú imunitu zloženú z T buniek a imunitných buniek.

Štúdie ukázali, že udržiavaním zdravého životného štýlu a stravovania, cvičením a dostatkom vitamínov a iných živín môžete zlepšiť svoj imunitný systém. Okrem toho môže vakcína tiež zvýšiť imunitu organizmu voči vírusom chrípky a znížiť výskyt ochorení.

Vírusy chrípky typu A zdieľajú ľudia aj zvieratá, takže často mutujú. Najmä na jeseň a v zime je imunita ľudí nízka a vírus chrípky typu A môže ľahko zaútočiť, ak využijete túto príležitosť. Ak ale trváme na rozvoji zdravého životného štýlu, posilňovaní pohybu a aktívnom očkovaní, môžeme si zlepšiť imunitu a lepšie sa vysporiadať s inváziou vírusu chrípky typu A. Okrem toho, ak zistíte, že máte príznaky podobné chrípke, mali by ste vyhľadať lekársku pomoc a dostať liečbu včas, aby sa vaše telo rýchlo zotavilo.

Medzi vírusom chrípky A a imunitou skrátka existuje vzájomné ovplyvňovanie. Posilňovanie imunity, dodržiavanie zdravého životného štýlu a stravovania a najmä akceptovanie očkovania, to všetko sú účinné opatrenia na prevenciu a boj proti vírusu chrípky typu A. Buďme pozitívni a posuňme sa smerom k zdravšiemu životnému štýlu z hľadiska prevencie vírusu chrípky typu A! Je vidieť, že musíme zlepšiť imunitu. Cistanche môže výrazne zlepšiť imunitu, pretože mäsový popol obsahuje rôzne biologicky aktívne zložky, ako sú polysacharidy, dve huby, Huang Li atď. Tieto zložky môžu stimulovať rôzne imunitné systémy. bunkám podobným, čím sa zvyšuje ich imunitná aktivita.

Kliknite na výhody cistanche tubulosa

Preto je veľmi dôležité predchádzať a kontrolovať chrípkovú infekciu u ošípaných a hlavným spôsobom, ako to dosiahnuť, je očkovanie. Subtypy IAV najrozšírenejšie u ošípaných na celom svete sú H1N1, H1N2 a H3N2; genetická diverzita týchto vírusov sa však môže značne líšiť v závislosti od regiónu. Predtým sme vyvinuli bivalentnú živú atenuovanú vakcínu závislú od elastázy s použitím dvoch izolátov vírusu kanadskej prasacej chrípky A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] a A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N215 ) [SD69], ktorý chránil proti homológnym kmeňom.

V tejto štúdii demonštrujeme, že táto vakcína rozširuje ochranu u ošípaných na aktuálnejšie, driftované nehomologické kmene H1N2 a H3N2, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] a A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

Vakcína vyvolala silnú imunitnú odpoveď v sére a pľúcach a znížila replikáciu vírusu, ako aj pľúcnu patológiu spojenú s týmito kmeňmi. Preto táto bivalentná vakcína zostáva silným kandidátom, ktorý by bol prospešný pre trh s vakcínou proti prasacej chrípke v Severnej Amerike.

Kľúčové slová:

chrípka; vakcína; sviňa.

1. Úvod

Vírusy chrípky A (IAV) sú významným patogénom pre mnohé druhy, vrátane ošípaných. Infekcia môže spôsobiť vysoko nákazlivé respiračné ochorenie ošípaných [1]. Chrípková infekcia u ošípaných vedie k miernemu ochoreniu s veľmi nízkou mortalitou, ale miera chorobnosti v stáde môže dosiahnuť 100 percent [2]. To má za následok ekonomické straty pre farmárov v dôsledku zníženého prírastku hmotnosti u infikovaných ošípaných, zníženej úžitkovosti a reprodukčného zlyhania u prasníc [3,4].

Koinfekcia chrípky s inými respiračnými patogénmi ošípaných môže tiež viesť k rozvoju komplexu respiračných chorôb ošípaných a v dôsledku toho k zvýšenej úmrtnosti a ekonomickým stratám [5].
Okrem toho sú ošípané náchylné na infekciu vtáčími a ľudskými IAV, ako aj prasacími IAV (swIAV) v dôsledku prítomnosti vtáčích aj cicavčích väzieb kyseliny sialovej galaktózou v ich dýchacom trakte [6]. To umožňuje, aby pri koinfekcii viacerými kmeňmi došlo k preskupeniu, čo by mohlo viesť k produkcii nových kmeňov s pandemickým potenciálom [4,7].

Keďže ľudia majú podobnú distribúciu väzieb galaktózovej kyseliny sialovej v celom dýchacom trakte, medzi ľuďmi a ošípanými sú možné obojsmerné prelievanie. Prvý známy výskyt tohto javu bol počas pandémie chrípky v roku 1918, keď bola IAV zavedená u ošípaných od ľudí [8]. Táto línia zostala stabilná v populáciách ošípaných až do 90. rokov 20. storočia, keď sa ľudské a vtáčie kmene H3N2 preskupili s cirkulujúcou líniou H1N1, čím vznikli dvojité a trojité preskupené kmene subtypov H1N1, H1N2 a H3N2 [8,9].

Novo vyvinutá kazeta s trojitým reasortantným génom (TRIG) viedla k obdobiu rýchlej diverzifikácie IAV u severoamerických ošípaných [10]. Táto kazeta TRIG je veľmi stabilná a uľahčuje substitúciu rôznych kombinácií HA a NA [5]. Od roku 2005 sa v stádach ošípaných v USA rozšírilo mnoho kmeňov s touto internou TRIG kazetou spárovanou s ľudskými génmi HA a NA [9].

K ďalšej významnej udalosti došlo v roku 2009, keď sa kmeň H1N1 ošípaných (H1N1pdm2009) rozšíril na ľudí, čo viedlo k pandémii chrípky v roku 2009 [11]. Prenos ľudskej pandémie H1N1 IAV (H1pdm) z človeka na ošípanú (reverzná zoonóza) bol zaznamenaný niekoľkokrát u severoamerických ošípaných, čo viedlo k vytvoreniu novej línie a nových preskupených swIAV [8,10,12].

Celkovo bolo u severoamerických ošípaných zaznamenaných sedem antigénne odlišných kladov H1 a štyri odlišné klady vírusov H3 [5]. Nedávno program sledovania swIAV v Ázii identifikoval prevládajúci vírus eurázijského typu vtákov (EA) s preskupeným genotypom 4 (G4) s H1pdm a trojitými preskupenými vnútornými génmi.

Tento vírus G4 bol meraný u 10,4 percenta testovaných prasacích robotníc a predstavuje markery pandemického potenciálu so schopnosťou prenosu na ľudí a odlišnou antigenicitou od v súčasnosti cirkulujúcich ľudských vírusov [7]. Preto je veľmi dôležité predchádzať a kontrolovať chrípkovú infekciu u ošípaných tak z hľadiska prasacieho priemyslu, ako aj z hľadiska verejného zdravia, pričom hlavným spôsobom, ako to dosiahnuť, je očkovanie [4].

V USA je najbežnejším typom vakcíny celý inaktivovaný vírus (WIV), ale schválená bola aj vakcína s RNA vektorom exprimujúca HA a NS 1-skrátená živá atenuovaná vakcína proti vírusu chrípky (LAIV) [4] . Najrozšírenejšie podtypy IAV u ošípaných na celom svete vrátane Severnej Ameriky sú H1N1, H1N2 a H3N2 [13].

Genetická diverzita týchto vírusov sa však môže značne líšiť v závislosti od regiónu a existujú rozdiely v genetickom vývoji swIAV v Kanade a USA, najmä vo vírusoch podtypu H1 [12]. Sledovanie v Kanade v rokoch 2009 až 2016 ukázalo, že genetické klady H1, ktoré boli dominantné v USA, H1g (1A.3.3.3) a H1d-1 (1B.2.2), neboli zistené v Kanade a Vírusy H1 v Kanade boli veľmi odlišné od vírusov v USA [12].

V Kanade bola identifikovaná nová vrstva H1 (H1a-3), ktorá začala v Manitobe a prešla rýchlym rastom, kým sa rozšírila po celej krajine a do USA. Pokiaľ ide o vírusy H3, u amerických ošípaných bolo zdokumentovaných šesť línií H3 (IV-A až IV-F) a tri z nich sa našli u kanadských ošípaných (IV-B, IV-C a IV-E) [12 ].

To zdôrazňuje dôležitosť regionálneho dohľadu a informovanosti o cirkulujúcich kmeňoch na informovanie o účinných očkovacích programoch a naznačuje, že vakcíny navrhnuté na základe IAV, ktoré cirkulujú u amerických ošípaných, nemusia chrániť kanadské ošípané [12].

Predtým bola bivalentná vakcína vytvorená pomocou dvoch kanadských izolátov swIAV, A/ Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] a A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), ktoré sú predstaviteľmi H{{ 9}} antigénna skupina a nová antigénna skupina H3 zo západnej Kanady (klaster ošípaných IV-E), v tomto poradí [14]. Táto nová vakcína je živá atenuovaná vírusová vakcína vyrobená s použitím foriem SD191 a SD69, SD191−R342V a SD{18}}K345V závislých od elastázy. Štúdie ukázali, že chráni pred SD191 a SD69, ako aj proti heterológnemu kmeňu H1N2 A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2), ktorý bol tiež izolovaný zo západnej Kanady [14].

Odvtedy sa cirkulujúce kmene swIAV naďalej posúvajú. Novšie klinické izoláty od ošípaných v západnej Kanade boli zozbierané a izolované z terénnych vzoriek na Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] je členom H -3 antigénnej skupiny, ale má päť substitúcií aminokyselín z 54 kľúčových H1 antigénnych miest v porovnaní s SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] je členom klastra IV-E, ale posunul sa tak, že obsahuje dve substitúcie aminokyselín zo šiestich kľúčových H3 antigénnych miest [17].

V tejto štúdii sme hodnotili, či by bivalentná elastáza-dependentná LAIV obstála proti novým klinickým izolátom, a môžeme uviesť, že chránila ošípané, keď boli napadnuté aktuálne cirkulujúcimi kmeňmi swIAV SD467 (H1N2) a SD435 (H3N2).

2. Materiály a metódy

2.1. Bunky a vírusy

Bunky psích obličiek Madin-Darby (MDCK) (ATCC, #CRL{1}}) boli udržiavané v minimálnom esenciálnom médiu (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA) obsahujúcom 10 percent fetálneho hovädzieho séra (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada 16000-044) a boli uchovávané vo zvlhčovanom 5-percentnom CO2 inkubátore pri 37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] a A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV boli izolované z terénnych vzoriek na Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon , SK, Kanada.

Vakcinačné vírusy SD191−R342V a SD69- K345V boli zachránené, ako už bolo opísané [14]. Všetky vírusy boli pestované v MDCK bunkách v prítomnosti 0,2 percenta hovädzieho sérového albumínu (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) buď s 1 µg/ml L-[(toluénu{ {11}}sulfónamid)-2-fenyl]etylchlórmetylketón (TPCK)-trypsín (vírusy WT) alebo 0,5 ug/ml ľudská neutrofilná elastáza (vírusy závislé od elastázy) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Dizajn pokusov na zvieratách

Z Prairie Swine Center Inc. (Saskatoon, SK, Kanada) bolo získaných 24 štvortýždňových swIAV-negatívnych ošípaných. Tieto ošípané boli náhodne vybrané a rozdelené do štyroch skupín so siedmimi ošípanými na vakcinovanú skupinu a piatimi ošípanými na simulovane očkovanú skupinu.

Priradenie skupiny je opísané na obrázku 1A. Tieto skupiny boli umiestnené v oddelených miestnostiach na základe vakcinačných skupín (skupiny A plus B a C plus D umiestnené spolu) a nechali sa aklimatizovať sedem dní pred infekciou.

Vo veku piatich týždňov (deň 0), ako aj vo veku ôsmich týždňov (21. deň), boli ošípané v skupinách A a B intratracheálne simulovane vakcinované 4 ml MEM, zatiaľ čo skupiny C a D boli vakcinované s bivalentnou vakcínou obsahujúcou 1 x 106 PFU každého SD191−R342V a SD69-K345V v 4 ml MEM. O desať dní neskôr (31. deň) boli ošípané stimulované buď MEM (falošná) alebo 1 x 106 PFU buď SD435-WT (H3N2) alebo SD467-WT (H1N2).

Ošípané sa monitorovali päť dní po provokácii, pričom sa im denne merali rektálne teploty a 1., 3. a 5. deň sa odoberali nosové výtery z oboch nozdier. Sérum sa odoberalo po prvej (20. deň) a druhej (30. deň) vakcinácii. test neutralizácie sérového vírusu (SVN) a enzýmový imunosorbentový test (ELISA).

V deň 5 po stimulácii boli všetky ošípané humánne usmrtené a pľúca boli extrahované a hodnotené na prítomnosť veľkých lézií charakteristických pre swIAV. Na izoláciu vírusu sa odobrali aj vzorky pľúcneho tkaniva (obrázok 1B).

2.3. Etické vyhlásenie

Všetky postupy na zvieratách boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá (UACC) a Výborom pre etiku výskumu zvierat (AREB) Univerzity v Saskatchewane. Tento protokol bol schválený 12. novembra 2021 (Protokol používania zvierat č. 20190064). Všetky postupy boli vykonané podľa štandardov požadovaných Kanadskou radou pre starostlivosť o zvieratá (CCAC) pri Organizácii pre vakcíny a infekčné choroby (VIDO), University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada.

2.4. Vzorkovanie

Nosové tampóny z každej nosovej dierky sa umiestnili do 1 ml MEM obsahujúceho 1 x antibiotické antimykotikum (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada, 15240-062) a zmrazili sa pri -80 °C, kým sa neuskutočnila qRT-PCR. Všetky ošípané boli humánne usmrtené intravenóznym podaním etanolu (240 mg/ml pentobarbitalu sodného; 2 ml na 4,5 kg). Po eutanázii sa pľúca vybrali in toto, aby sa určilo percento purpurovo-červených pevných lézií, ako aj zápal pľúc.

Percentá boli stanovené na základe hmotnosti pľúcnych lalokov, ako aj celkového objemu pľúc [18]. Vzorky pľúc sa tiež odobrali z pravého apikálneho, srdcového a diafragmatického laloku na titráciu vírusu. Tieto pľúcne vzorky sa na titráciu zmiešali v rovnakých objemoch 10 % hmotn./obj. MEM obsahujúcich 1 x antibiotikum-antimykotikum.

Obrázok 1. Zoskupenie ošípaných a návrh pokusu na vyhodnotenie ochrannej účinnosti bivalentnej LAIV proti novým klinickým izolátom. Ošípané (n=5 pre skupiny MEM/MEM a n=7 pre bivalentné/bivalentné skupiny) boli intratracheálne vakcinované 4 ml MEM alebo bivalentnou vakcínou zloženou z 1 × 106 PFU každého SD191-R342V a SD69-K345V v dňoch 0 a 21. V deň 31 boli ošípané intratracheálne stimulované MEM alebo 1 x 106 PFU buď SD435 (H3N2) alebo SD467 (H1N2). (A)

Harmonogram imunizácie, provokácie a odberu vzoriek pre tento pokus na zvieratách. Dvadsaťštyri týždňov staré swIAV-negatívne ošípané sa nechali aklimatizovať sedem dní pred infekciou. Vo veku piatich týždňov (deň 0), ako aj vo veku ôsmich týždňov (21. deň), boli ošípané v skupinách A a B intratracheálne simulovane vakcinované 4 ml MEM, zatiaľ čo skupiny C a D boli vakcinované s bivalentnou vakcínou obsahujúcou 1 x 106 PFU každého SD191−R342V a SD69-K345V v 4 ml MEM.

O desať dní neskôr (31. deň) boli ošípané stimulované buď MEM (napodobenina) alebo 1 x 106 PFU buď SD435-WT (H3N2) alebo SD{6}}WT (H1N2). Ošípané sa monitorovali päť dní po provokácii, pričom sa im denne merali rektálne teploty a 1., 3. a 5. deň sa odoberali nosové výtery z oboch nosných dierok. Sérum sa odoberalo po prvej (20. deň) a druhej (30. deň) vakcinácii. V deň 5 po stimulácii (36. deň) boli všetky ošípané humánne usmrtené a pľúca boli extrahované na vyhodnotenie. (B) Vytvorené pomocou BioRender.com.

2.5. Imunosorbentný test viazaný na enzým (ELISA)

Aby sa vytvorili poťahové antigény, SD435 a SD467 sa rozmnožili v MDCK bunkách a purifikovali s použitím ultracentrifugácie s gradientom sacharózy. Inaktivácia vírusov nastala pridaním 97 percent -propiolaktónu k vírusu v koncentrácii 1:1000 (v/v) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Táto zmes sa trepala pri 4 °C cez noc, inkubovala sa pri 37 °C počas dvoch hodín, aby sa uľahčila hydrolýza -propiolaktónu, a potom sa skladovala pri -80 °C až do použitia.

Na meranie hladín IgG špecifických pre swIAV indukovaných vakcináciou a stimuláciou sa po prvej (20. deň) a druhej (30. deň) očkovaní a pred pitvou (36. deň) odobralo prasacie sérum.

Purifikované -propiolaktónom inaktivované vírusy SD435 (1 ug/ml) a SD467 (2 ug/ml), zriedené v uhličitanovom/hydrogenuhličitanovom poťahovacom pufri, (pH 9,6) sa aplikovali na Immulon-2 96-jamkové platne pri 1{{ 12}}0 µL/jamka (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Kanada, 3655) a inkubované cez noc pri 4 ◦C. Po inkubácii cez noc sa potiahnuté platne štyrikrát premyli TBST (0,1 M Tris, 0,17 M NaCl a 0,05 percenta Tween 20), ku ktorým sa pridali štvornásobné sériové riedenia séra alebo BALF. doštičku v duplikáte, po ktorej nasleduje dvojhodinová inkubácia pri teplote miestnosti. Sérum sa pridalo v počiatočnom riedení 1:10 a BALF sa pridal nezriedený.

Vzorky predtým definovaných pozitívnych kontrolných sér a príslušných negatívnych kontrol, séra a BALF z neočkovaných ošípaných v predchádzajúcej štúdii boli testované na každej miske [14]. Doštičky sa premyli štyrikrát TBST, potom sa afinitne purifikovaná protilátka proti prasacej IgG (H plus L) fosfatázou (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) alebo myšacia anti-prasacia IgA (Serotec, MCA658) ( 1:300) zriedený v TBST a nechal sa inkubovať pri teplote miestnosti jednu hodinu.

IgA ELISA boli vyvinuté pridaním biotinylovaných kozích anti-myších IgG (H plus L) protilátok (CALTAG, Burlingame, CA, USA, M30015) a roztoku alkalickej fosfatázy streptavidínu (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) obe počas jednej hodiny pri izbovej teplote. Po inkubácii boli doštičky IgG aj IgA štyrikrát premyté TBST, do ktorého bol pridaný p-nitrofenylfosfátový substrát (PNPP) [10 mg/ml kryštalická di(tris) soľ p-nitrofenylfosfátu (Sigma-Aldrich), 1% dietanolamín ( Pridal sa Sigma-Aldrich), 0,5 mg/ml MgCl2 a pH 9,8] (1 mg/ml) a inkubovalo sa pri teplote miestnosti dve hodiny.

Reakcia sa zastavila pridaním 0,3 M kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA) a doštičky sa odčítali na spektrofotometri pri 405 nm s referenciou 490 nm. Titer vzorky bol definovaný ako najvyššie riedenie, pri ktorom bola OD tejto vzorky vyššia ako definovaná medzná hodnota (priemerná OD známej negatívnej vzorky plus dvojnásobok štandardnej odchýlky).

2.6. Test neutralizácie vírusu (VN).

MDCK bunky (3,5 x 104 ) sa umiestnili do 96-jamkových platní. Sérum a BALF boli tepelne inaktivované pri 56 °C počas 30 minút. Dvojnásobné riedenia séra a BALF sa pridali na platňu v štyroch vyhotoveniach a 60 ul zriedeného séra alebo BALF sa inkubovalo s rovnakým objemom SD435 alebo SD456 obsahujúcim 100 TCID50 pri 37 °C počas 1 hodiny.

100 ul zmesi sa potom pridalo k bunkám MDCK a cytopatogénny účinok (CPE) sa dokumentoval 48 hodín a 72 hodín po infekcii (pi). Titer neutralizačnej protilátky bol najvyšším riedením každej vzorky séra, ktoré úplne chránilo bunky pred CPE v najmenej 2 zo 4 jamiek.

2.7. Vírusové stanovenie

Po odbere boli vzorky pľúc okamžite umiestnené na ľad a zmrazené pri -80 °C až do spracovania. Na spracovanie sa každé pľúcne tkanivo odvážilo a pridala sa 10-percentná (w/v) koncentrácia MEM doplnená 1x antibiotikom-antimykotikom (Thermo Fisher Scientific, 15240-062). Pľúcne tkanivo bolo homogenizované v TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Nemecko) pri 30 Hz počas 5 minút, po čom nasledovala centrifugácia pri 5000 x g počas 10 minút pri 4 °C. Homogenizovaný supernatant sa odobral a skladoval pri -80 °C až do ďalšej analýzy.

Nosové tampóny sa vortexovali 15 sekúnd a centrifugovali sa pri 1600 x g počas 25 minút pri 4 °C. Supernatanty sa odobrali a skladovali pri -80 °C až do ďalšej analýzy. Vírusové titre boli stanovené testom TCID50 pre pľúca a kvantitatívnou RT-PCR pre nazálne výtery.

2.8. Extrakcia RNA a kvantitatívna RT-PCR (qRT-PCR)
Na stanovenie hladín vírusovej RNA SD467 a SD435 vo výteroch z nosa po stimulácii sa uskutočnila qRT-PCR. Štandardná krivka bola vytvorená s použitím RNA extrahovanej z SD435 a SD467 so známym titrom. Stručne, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Toronto, ON, Kanada, 74136) sa použil na extrakciu vRNA z 200 ul nazálneho výplachu.

RNA bola konvertovaná na cDNA pomocou univerzálneho chrípkového primeru Uni12 a transkriptázy SuperScript III (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) [19]. qPCR sa uskutočňovala trojmo na systéme StepOnePlusTM Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) s Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 ul cDNA a 1 ul 10 uM dopredných a reverzných primérov. PCR reakcie prebiehali pri teplote žíhania 58 °C počas 40 cyklov. Všetky sekvencie primérov qPCR sú k dispozícii na požiadanie.

2.9. Štatistická analýza

Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou softvéru GraphPad Prism 8. Boli použité neparametrické testy Mann-Whitney a Kruskal-Wallis. Významné rozdiely sú označené * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0,001) alebo **** (p < 0,0001). ns=nie je významné.

For more information:1950477648nn@gmail.com