Abstrakt:Kvercetín bol dôkladne študovaný pre svoje účinky proti Alzheimerovej chorobe (AD) a proti starnutiu. Naše predchádzajúce štúdie zistili, že kvercetín a vo svojej glykozidovej forme, rutín, môžu modulovať funkciu proteazómu v bunkách neuroblastómu. Zamerali sme sa na skúmanie účinkov kvercetínu a rutínu na intracelulárnu redoxnú homeostázu mozgu (redukovaný glutatión/oxidovaný glutatión, GSH/GSSG), jeho koreláciu s aktivitou enzýmu 1 štiepiaceho APP (BACE1) a amyloidového prekurzorového proteínu (APP) expresiou v transgénnych myšiach TgAPP (nesúcich ľudský švédsky mutovaný APP transgén, APPswe). Na základe toho, že spracovanie proteínu BACE1 a APP je regulované dráhou ubikvitín-proteazóm a že suplementácia GSH chráni neuróny pred inhibíciou proteazómu, skúmali sme, či diéta obsahujúca kvercetín alebo rutín (30 mg/kg/deň, 4 týždne) znižuje niekoľko skoré príznaky AD. Genotypizačné analýzy zvierat sa uskutočňovali pomocou PCR. Na stanovenie intracelulárnej redoxnej homeostázy boli prijaté spektrofluorometrické metódy na kvantifikáciu hladín GSH a GSSG pomocou o-ftalaldehydu a zisťoval sa pomer GSH/GSSG. Hladiny TBARS boli stanovené ako marker peroxidácie lipidov. Enzýmové aktivity SOD, CAT, GR a GPx boli stanovené v kortexe a hipokampe. Aktivita BACE1 sa merala substrátom špecifickým pre sekretázu konjugovaným s dvoma reportérovými molekulami (EDANS a DABCYL). Génová expresia hlavných antioxidačných enzýmov: APP, BACE1, proteínu 10 obsahujúceho dezintegrín a metaloproteinázovú doménu (ADAM10), kaspázy-3, kaspázy{16}} a zápalových cytokínov bola stanovená pomocou RT-PCR. Po prvé, nadmerná expresia APPswe u myší TgAPP znížila pomer GSH/GSSG, zvýšila hladiny malónaldehydu (MDA) a celkovo znížila aktivity hlavných antioxidačných enzýmov v porovnaní s myšami divokého typu (WT). Liečba TgAPP myší kvercetínom alebo rutínom zvýšila GSH/GSSG, znížila hladiny MDA a podporila antioxidačnú kapacitu enzýmu, najmä rutínu. Po druhé, expresia APP aj aktivita BACE1 sa znížili pomocou kvercetínu alebo rutínu u myší TgAPP. Pokiaľ ide o ADAM10, mala tendenciu zvyšovať sa u myší TgAPP s liečbou rutínom. Pokiaľ ide o expresiu kaspázy{21}}, TgAPP vykazoval nárast, ktorý bol opačný v prípade rutínu. Nakoniec, zvýšenie expresie zápalových markerov IL-1 a IFN- u myší TgAPP bolo znížené kvercetínom aj rutínom. Súhrnne tieto zistenia naznačujú, že z dvoch flavonoidov môže byť rutín zahrnutý do každodennej stravy ako forma adjuvantnej terapie pri AD.

Kliknite na Antioxidant Cistanche Chemist Warehouse

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Kľúčové slová:kvercetín; rutín; glutatión; APPswe; BACE1; Alzheimerova choroba

1. Úvod

Pokles kognitívnych funkcií je základným klinickým symptómom neurodegenerácie, ktorý úzko súvisí s vekom [1]. Vplyv výživy na kognitívny pokles súvisiaci s vekom je čoraz narastajúcou témou, keďže ide o životne dôležitý faktor, ktorý možno ľahko zmeniť. Patologické zmeny v mozgu pozorované počas kognitívneho poklesu prebiehajú dlho pred akýmkoľvek klinickým prejavom, ktorý sa väčšinou vyskytuje v starobe. To poskytuje dlhšie obdobie na vytvorenie stratégií prevencie v súvislosti s kognitívnym poklesom súvisiacim s vekom a demenciou, ktorá je hlavným problémom verejného zdravia [2]. Po mnoho rokov prebieha intenzívny výskum zlúčenín prírodného pôvodu, ktoré sa nachádzajú v každodennej strave, v rámci terapie zlepšujúcej kognitívne funkcie [3].

Jednou z najbežnejších neurodegeneratívnych chorôb súvisiacich s vekom je Alzheimerova choroba (AD), ktorá je charakterizovaná dvoma neuropatologickými znakmi: amyloidnými (A) plakmi a neurofibrilárnymi spleťami. Pokiaľ ide o výskum na zvieratách, zvieracie modely môžu simulovať asymptomatickú fázu AD modifikáciou prekurzorového proteínu A (APP), napríklad [4,5].

Je pozoruhodné, že niekoľko bioaktívnych fytochemikálií odvodených z rastlín spojených s rôznymi zdravotnými výhodami a zníženým rizikom mnohých chorôb bolo testovaných na vytváranie nekovalentných komplexov s amyloidným (A) peptidom [3].

Hoci mnohé tradičné lieky a prírodné dietetické produkty preukázali veľký pokrok smerom k zmierneniu patológie AD, sme si plne vedomí obmedzení zvieracích modelov AD, pretože sľubné účinky týchto látok nie sú vždy replikovateľné v štúdiách na ľuďoch [6]. Avšak kvôli ťažkostiam s analýzou mozgového tkaniva u ľudí, najmä vo veľmi skorých štádiách progresie, sú potrebné štúdie na modeloch hlodavcov. Výsledkom je, že tieto experimentálne modely môžu podporiť vývoj užívateľských činidiel z tradičných liekov a bezpečných prírodných zlúčenín na oddialenie progresie neurodegeneratívnych ochorení. Prioritou by teda malo byť testovanie prírodných zlúčenín, ktoré sa nachádzajú v každodennej strave, na prevenciu chorôb a ochranu pred rizikom AD.

Medzi tieto dôležité prírodné látky v potrave patrí kvercetín, ktorý je hlavným polyfenolickým flavonoidom v niekoľkých druhoch ovocia a zeleniny [7]. Kvercetín je prítomný hlavne vo svojej glykozidovej forme, tj rutín. Rutín (kvercetín-3-O-rutinozid) preukázal výrazné účinky na rôzne bunkové funkcie, ktoré sú základom niekoľkých patologických stavov, konkrétne antimikrobiálne, antikarcinogénne, antitrombotické, kardioprotektívne a neuroprotektívne. Tieto farmakologické účinky sú spojené najmä s protizápalovými a antioxidačnými aktivitami rutínu. Vďaka svojej schopnosti prechádzať hematoencefalickou bariérou a/alebo jej metabolitmi sa preukázalo, že rutín môže meniť kognitívne aj behaviorálne symptómy neurodegeneratívnych ochorení [8].

Naše predchádzajúce štúdie zistili, že flavonoidy, kvercetín aj rutín, ovplyvňujú rôzne signálne dráhy a molekulárne siete spojené s moduláciou funkcií proteazómu v bunkách neuroblastómu [9]. Okrem toho sa preukázalo, že expresia BACE1 a spracovanie APP sú regulované ubikvitín-proteazómovou dráhou [10] a že suplementácia redukovaným glutatiónom (GSH) chráni neuróny pred inhibíciou proteazómu [11]. Deplécia GSH v mozgu je bežným nálezom u pacientov s neurodegeneratívnymi ochoreniami, ako je AD, a môže spôsobiť neurodegeneráciu pred nástupom ochorenia [12]. Ubikvitinácia BACE1 a blokovanie ubikvitín-proteazómovej dráhy inhibuje degradáciu BACE1 a následne vedie k zvýšenej produkcii enzymatickej aktivity BACE1 [10].

Na základe týchto zistení a toho, že stravovacie návyky a suplementácia môžu ovplyvniť bunkový redox stav, sme sa zamerali na skúmanie účinkov stravy obsahujúcej kvercetín alebo rutín na intracelulárnu redoxnú homeostázu mozgu (GSH/GSSG), jej koreláciu s aktivitou BACE1, a expresia APP v myších modeloch AD (nesúce transgén APP s ľudskou švédskou mutáciou amyloidového prekurzorového proteínu, APPswe).

Napokon, keďže existujú presvedčivé dôkazy o účinku doplnkov flavonoidov na zlepšenie špecifických kognitívnych domén a/alebo nálezov MRI [13], pokúsili sme sa na zvieratách napodobniť intervenciu podávaním zdravej stravy obsahujúcej mierne množstvá konkrétnej potenciálne aktívnej látky. zložku (kvercetín alebo rutín) ako účinnú stratégiu na prevenciu expresie AD markerov.

2. Výsledky

2.1. Genotypizácia myší

Myšia kolónia TgAPP bola vyvinutá v našom laboratóriu z heterozygotných samcov Tg2576 a samíc divokého typu. Genotypizácia myší sa uskutočnila na detekciu transgénnych jedincov. Zo všetkých testovaných myší sa zistilo, že približne 40 percent je transgénnych (TgAPP).

Získané produkty PCR sa oddelili elektroforézou v 1,5 % agarózových géloch v 0.5X TBE (Tris-Borát-EDTA) pufri pri 70 V (konštantné napätie) a potom sa zobrazili farbením pomocou GelRed (Millipore). Profil amplifikácie pre transgénne myši aj myši WT je znázornený na obrázku 1.

2.2. glutatión

Na vyhodnotenie intracelulárnej redoxnej homeostázy v neurónoch u myší TgAPP sa kvantifikovali hladiny GSH a GSSG a pomer GSH/GSSG sa určil ako marker schopnosti redukovať bunky u samcov aj samíc (obrázok 2).

Pri hodnotení účinku transgénu na glutatiónový systém sa pozoroval pokles schopnosti redukovať bunky (GSH/GSSG) u myší TgAPP u zvierat WT, u samcov aj samíc a v oboch oblastiach mozgu (obrázok 2C3, H3), najmä v hipokampe. U WT aj TgAPP myší bol pomer GSH/GSSG významne nižší u samcov ako u samíc (obrázok 2C3, H3; p < 0,05). Zatiaľ čo u žien TgAPP je tento pokles výsledkom nižších hladín GSH (obrázok 2C1, H1), u mužov TgAPP sa väčšinou pripisuje zvýšeniu hladín GSSG (obrázok 2C2, H2).

Zmeny hladín GSH a GSSG u myší TgAPP po liečbe kvercetínom alebo rutínom sú výraznejšie u samcov ako u samíc. Zdá sa, že kvercetín má tendenciu zvyšovať hladiny GSH (obrázok 2C1, H1; p < 0.05) a rutín má tendenciu znižovať hladiny GSSG (obrázok 2C2, H2; p < 0,05).

Liečba kvercetínom a rutínom u samcov aj samíc dokázala zvrátiť pokles pomeru GSH/GSSG v hipokampe (obrázok 2H3), kde bolo obnovenie redoxnej sily významné oproti neliečeným myšiam TgAPP. U samcov tento index dosiahol podobné hodnoty ako u WT myší v hipokampe (H3). U samíc, aj keď tento pomer nie je zvýšený ako u WT myší, liečba kvercetínom a rutínom ho významne zvýšila v porovnaní s TgAPP myší v ich hipokampoch (H3: kvercetín, p < 0.{{{{101} 6}}01; rutín, p < 0,05).

2.3. Látky reaktívne s kyselinou tiobarbiturovou (TBAR)

Hladiny TBAR boli stanovené ako marker peroxidácie lipidov. Pomocou kalibračných kriviek boli výsledky vyjadrené ako koncentrácia malondialdehydu (MDA) (obrázok 3).

Po nadmernej expresii APP bol pozorovaný významný nárast hladín MDA v porovnaní s myšami WT v kôre (obrázok 3C) aj v hipokampe (obrázok 3H) a u mužov aj žien (p < 0 0,001) .

U samíc TgAPP liečba kvercetínom aj rutínom takmer obnovila hladiny MDA na rovnakú úroveň ako u myší WT (obrázok 3C, H). U samcov TgAPP podobne liečba kvercetínom aj rutínom obnovuje hladiny MDA na rovnakú úroveň ako u WT myší v kôre (obrázok 3C) a ešte viac sa znižuje v hipokampe (obrázok 3H). U myší WT aj TgAPP, neliečených a liečených flavonoidnou diétou, boli hladiny MDA závislé od pohlavia (obrázok 3C, H; p < 0 0,05), s výnimkou myší TgAPP liečených kvercetínom v hipokampe.

2.4. Enzýmová aktivita a expresia antioxidačných enzýmov

Aby sa zistilo, či sa regulácia enzymatickej aktivity alebo génovej expresie hlavných antioxidačných enzýmov, alebo oboch, vyskytuje pri diéte s kvercetínom alebo rutínom, uskutočnilo sa stanovenie enzymatickej aktivity a hladín mRNA.

Obrázok 4 ukazuje enzýmové aktivity SOD, CAT, GR a GPx, stanovené u samíc a samcov myší, v mozgovej kôre (obrázok 4a) a hipokampe (obrázok 4b).

V dôsledku nadmernej expresie APP bol u myší TgAPP v porovnaní s myšami WT pozorovaný iba významný pokles aktivity CAT v kôre (obrázok 4a(C2); p < 0.05) a hippocampus (obrázok 4b(H2); p < 0,05).

Liečba kvercetínom nespôsobila žiadne významné rozdiely v enzýmových aktivitách v porovnaní s TgAPP myšami, u samcov alebo samíc, v študovaných oblastiach mozgu. Na rozdiel od toho u zvierat liečených rutínom došlo k zvýšeniu aktivity CAT v kortexe (obrázok 4a(C2)) a GR aktivity v hipokampe (obrázok 4b(H3)) u samcov aj samíc (p < 0 .05). Okrem toho rutín zvýšil aktivitu hipokampálnej CAT u mužov TgAPP (obrázok 4b (H2)) a aktivitu GPx u žien (obrázok 4b (H4)).

Obrázok 5 ukazuje génovú expresiu hlavných antioxidačných enzýmov, SOD, CAT, GR a GPx, stanovenú u samíc a samcov myší, v mozgovej kôre (obrázok 5a) a hipokampe (obrázok 5b).

Pre hlavné antioxidačné enzýmy neboli pozorované žiadne rozdiely v génovej expresii medzi myšami TgAPP a WT (obrázok 5a, b). Samci TgAPP liečení rutínom vykazovali významné zvýšenie expresie CAT v hipokampe (obrázok 5b(H2)). Pokiaľ ide o hipokampálny GPx, pozoroval sa podobný vzor ako CAT, hoci zvýšenie nebolo významné (obrázok 5b (H4)).

2.5. Spracovanie APP: BACE1 a ADAM10

Výsledky aktivity enzýmu BACE1 v mozgovej kôre aj v hipokampe u samcov a samíc sú uvedené na obrázku 6, vyjadrené ako percentá aktivity týkajúce sa neliečených myší TgAPP.

Na obrázku 6 sa zistilo, že aktivita enzýmu BACE1 u myší TgAPP sa zvýšila približne o 10 percent v porovnaní s myšami WT v oboch skúmaných oblastiach mozgu a u oboch pohlaví a zistilo sa, že je štatisticky významná (p < 0,05).

Zvýšenie aktivity pozorované u transgénnych myší bolo znížené liečbou kvercetínom aj rutínom, a to ako v kortexe, tak v hipokampe. Napriek tomu je stále možné poznamenať, že účinok rutínu bol o niečo väčší ako účinok kvercetínu u mužov.

Keď bola známa aktivita BACE1, rozhodli sme sa uskutočniť štúdiu génovej expresie APP, hlavnej charakteristiky transgénneho zvieracieho modelu, a jeho hlavných spracovateľských enzýmov: BACE1 a ADAM10. Obrázok 7 ukazuje výsledky získané u samíc a samcov myší, ako v kortexe, tak v hipokampe.

U oboch pohlaví bolo pozorované významné zvýšenie expresie APP o viac ako 85 percent u myší WT, čo dokazuje nadmernú expresiu génu v mozgovej kôre (obrázok 7C1; p < 0.05) a v hipokampe (obrázok 7H1; p < 0,05). Liečba kvercetínom a rutínom dokázala znížiť túto expresiu o viac ako 45 percent (p < 0,05) u samcov aj samíc myší v oboch skúmaných oblastiach mozgu (obrázok 7C1, H1), pričom účinky boli výraznejšie v hipokampe ( Obrázok 7H1).

Pokiaľ ide o expresiu proteínu BACE1, hoci aktivita BACE1 bola zmenená, medzi transgénnymi a netransgénnymi myšami neboli žiadne významné rozdiely bez ohľadu na pohlavie a skúmanú liečbu flavonoidmi.

Hodnotili sme teda expresiu ADAM10 zapojenú do neamyloidogénneho spracovania APP. Hoci zmeny v expresii ADAM10 u myší TgAPP v porovnaní s myšami WT neboli štatisticky významné, bol pozorovaný mierny pokles. Čo sa týka liečby flavonoidmi, rutín vykazoval rastúci trend v expresii ADAM10, a to u mužov aj žien a v oboch oblastiach mozgu (obrázok 7C3, H3).

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】