Nový, ataxický myšací model ataxie telangiektázie spôsobenej klinicky relevantnou nezmyselnou mutáciou (2. časť)

Ak sa chcete dozvedieť viac informácií, kontaktujte prosímdavid.wan@wecistanche.com

3.0 Diskusia

Zvýšením genotoxického stresu pridaním sekundárneho zásahu do dráhy DDR sme vytvorili nový myšací model, ktorý zobrazuje najkomplexnejšiu sadu symptómov AT zo všetkých doteraz známych modelov. To zahŕňa závažnú a progresívnu ataxiu spojenú s cerebelárnou atrofiou a poruchami vlastností PN spolu s vysokým výskytom rakoviny a defektov vo vývoji imunitných buniek. Tieto komorbidity spolu zahŕňajú tri hlavné príčiny predčasnej smrti vAT – každý prispievana približne tretinu úmrtí. Z nich je zneschopňujúci účinok ataxie najprenikavejší a pacienti a opatrovatelia uvádzajú, že má najväčší vplyv na kvalitu ich života. Z tohto dôvodu je prítomnosť ataxie a cerebelárnej atrofie v tomto novom myšacom modeli veľmi dôležitá, pretože po prvýkrát poskytuje zdroj nielen na objasnenie mechanizmov neurologickej dysfunkcie, ale aj kriticky potrebný in vivo model na testovali vážne potrebné AT terapeutiká, ako sú napríklad zlúčeniny na prečítanie, ktoré tu opisujeme. Našli sme niekoľko podobností medzi celkovou progresiou ataxie v Atm3535; Aptx myši aAT pacientov. V klinickej AT sú motorické deficity pozorovateľné približne vo veku 2 rokov, keď rodičia a lekári zistia zníženú schopnosť prechodu z batoľaťa do hladkého, reflexne koordinovaného vrátka – bohužiaľ, o motorických defektoch v skorších štádiách v dôsledku chorôb sa vie len málo. nízka prevalencia a súčasný nedostatok včasného diagnostického testovania (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Pacienti sa zvyčajne učia chodiť bez pomoci a neurologické symptómy majú tendenciu zostať stabilné počas prvých 4 až 5 rokov života (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Zistili sme podobnú skorú progresiu motorických deficitov v Atm735×R3x; Myši Aptx^', detegujúce skoré mierne motorické deficity v P8 (deficit vzpriamovacieho reflexu), po ktorom nasledovalo obdobie relatívnej stability pred nástupom progresívnej a ťažkej ataxie, ktorá sa vyvinula po p210, ktorá zahŕňala zmeny v chôdzi, úľakom, tremor a lokomotoriku činnosť. Z týchto zistení vyvstáva niekoľko dôležitých otázok, vrátane toho, či ATM a/alebo APTX zohrávajú úlohu v neurovývoji v

cerebellum. Budúce štúdie zamerané na skorú fázu poruchy budú rozhodujúce pre pochopenie toho, či sa mozoček vyvíja normálne pred dysfunkciou alebo či sú počiatočnou príčinou vývojové chyby. Zistili sme tiež, podobne ako u pacientov s AT, že závažnosť neskoro sa rozvíjajúcej ataxie bola premenlivá, pričom niektoré myši sa pohybovali s nemotorným, vysoko stúpajúcim zadným vrátkom (Video 3) a iné sa pohybovali takmer výlučne prostredníctvom skrútenia zadného trupu ( Obr. 1E a Video 4) (Rothblum-Oviatt a kol. 2016; Levy a Lang 2018; Boder a Sedgwick 1958). Celkovo sme zistili, že Atm?35×xR35×; U myší Aptx sa vyvinula vizuálne hlboká a merateľná progresívna strata motorickej koordinácie podobná tej, ktorá sa pozorovala u pacientov s AT, ktorá bola zachránená expresiou aspoň jednej kópie Atm alebo Aptx get he. Strata motorickej koordinácie pri AT sa pripisuje cerebelárnej degenerácii v dôsledku jej relatívne selektívnej neuropatológie v mozgu a jej kauzálnej úlohy v niekoľkých rôznych formách ataxie (Hoche et al. 2012). V súlade sAT pacientneuroimagingové štúdie (Wallis a kol. 2007; Sahama a kol. 2015; Sahama a kol. 2014; Dineen a kol. 2020; Tavani a kol. 2003; Quarantelli a kol. 2013), zistíme, že veľkosť mozočka v Atm735×R3 ; Myši Aptx' sú spočiatku normálne, ale progresívne atrofujú súčasne so zmenami neurologickej funkcie. Zatiaľ čo strata cerebelárneho tkaniva bola považovaná za hlavnú príčinu ataxie u ľudí, z klinických údajov nie je jasné, či závažnosť ataxie je dobrým prediktorom rozsahu cerebelárnej degenerácie zistenej postmortem (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen a kol. 2020). V bankomate?35×R35×; Aptx^ myši, nachádzame jasnú atrofiu spojenú so stenčovaním dendritovej vrstvy Purkyňových neurónov, ktorá predchádza neskorým závažným deficitom správania. Naše histologické pozorovania v Atm?35xR35×; Aptx'myši naznačujú, že zmeny v samotnej cerebelárnej funkcii, skôr než hlboká strata cerebelárnych buniek, sú dostatočné na to, aby spôsobili ataxický fenotyp, čo je v súlade s pozorovaním defektov správania pred významnou stratou PN v niekoľkých SCA (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti a kol., 2000; Clark a kol., 1997; Jayabal a kol., 2016). Dôvod, prečo je nedostatok ATM a APTX potrebný na vyvolanie ataxie u myší, keď strata jedného z nich je dostatočná na to, aby spôsobila ataxiu u ľudí, zostáva nejasná. Jednou z možností je, že mozog hlodavcov môže flexibilnejšie využívať kompenzačné dráhy alebo nadbytočné proteíny a zároveň reagovať na 10-20k DNA lézie, ktoré ovplyvňujú bunky každý deň (Lindahl a Barnes 2000). Existuje niekoľko foriem opravy DNA, ktoré môžu potenciálne čeliť tejto výzve, vrátane opravy excízie bázy (BER), opravy excízie nukleotidov (NER),

Kliknutím sem sa dozviete viac o Cistanche

ako aj homológne a nehomologické spájanie koncov (HEJ a NHEJ), z ktorých všetky boli zapojené do ATM a APTX (Chou a kol. 2015; Caglayan a kol. 2017; Wakasugi a kol. 2014; Tumbale a kol. 2018; Chatterjee a Walker 2017) Prípadne to môže byť V prípade, že nedostatok ATM alebo APTX samotných nemá adekvátny vplyv na zdravie buniek počas relatívne krátkej životnosti myši, a preto je eliminácia oboch proteínov nevyhnutná na dosiahnutie dostatočnej akumulácie poškodenia DNA, ktoré sa prejaví počas tohto časového obdobia. Táto možnosť je posilnená skutočnosťou, že ATM a APTX majú odlišné biochemické vlastnosti a funkčné úlohy v reakcii na poškodenie DNA, a preto sa predpokladá, že nedostatok oboch spôsobí širší zásah do stability genómu (tj zvýšený genotoxický stres). Naše zistenie, že na vyvolanie neurologických defektov u myší sú potrebné dva proteíny dráhy stability genómu, silne naznačuje, že cerebelárne defekty spôsobuje skôr strata ATM's Oriole pri oprave DNA než potenciálne funkcie v signalizácii oxidačného stresu, mitofágii alebo mitochondriálnej funkcii ( Shiloh 2020). Alternatívy však nemožno úplne vylúčiť, keďže APTX, podobne ako ATM, bol pozorovaný v mitochondriách mozgových buniek, kde sa predpokladá, že podporuje spracovanie mitochondriálnej DNA (Meagher a Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Tento nový model myši poskytuje nový nástroj na preskúmanie týchto možností a mechanické definovanie toho, ako strata ATM a APTX v konečnom dôsledku spôsobí cerebelárnu dysfunkciu. Biofyzikálne poruchy pozorované v PN zaznamenaných z AtmR35XR35X; Aptx myši sa podobne nachádzajú v niekoľkých ďalších myších modeloch ataxie. To zahŕňa zmeny, ktoré sme pozorovali vo vstupnom odpore PN, kapacite membrány a prahu a šírke AP, ktoré boli tiež opísané v myšacích modeloch SCA ako 1, 3 a 7 (Stoyas a kol. 2020; Shakkottai a kol. 2011; Dell „Orco a kol., 2015). Navyše, progresívne znižovanie frekvencie streľby PN akčného potenciálu, ktoré uvádzame, pozitívne koreluje s rozvojom ataxie v AtrnR35XR35X; Aptx'myši sa uvádzajú vo veľkom počte modelov ataxických myší, vrátane SCA 1, 2, 3, 5, 6 a 13, ako aj niekoľkých epizodických foriem (pozri prehľad (Cook, Fields a Watt 2021)). Vzhľadom na významné prekrývanie porúch PN pozorovaných v mnohých rôznych ataxiách spôsobených odlišnými bunkovými defektmi sa obnovenie frekvencií spustenia PN AP považovalo za široko založený terapeutický prístup. Zostáva však nejasné, či je zníženie PN streľby príčinným faktorom ataxie. Okrem toho experimentálne dôkazy naznačujú, že zmeny v aktivite PN môžu byť v skutočnosti všeobecnou odpoveďou na udržanie homeostázy počas prebiehajúceho poškodenia fyziológie PN súvisiaceho s ochorením (Dell'Orco et al. 2015). Preto je potrebné neustále úsilie vo všetkých cerebelárnych ataxiách na prepojenie genetických, molekulárnych a bunkových porúch spôsobených chorobou so špecifickými zmenami v cerebelárnej nervovej signalizácii, ktoré nakoniec generujú ataxiu. Významný význam v tomto úsilí bude určiť, či cerebelárne defekty spôsobujúce ochorenie bežne alebo rozdielne spôsobujú ataxiu prostredníctvom straty cerebelárnej funkcie (napr. strata koordinačných signálov počas pohybu), alebo z dominantno-negatívneho účinku (napr. narušenie downstream neurálnej funkcie). obvody s abnormálnymi nervovými výstupnými vzormi). V konečnom dôsledku, zatiaľ čo spoločná terapeutická stratégia na riešenie cerebelárnych ataxií by mala najväčší vplyv, riadený prístup, ktorý sa zaoberá odlišnými genetickými a molekulárnymi príčinami bunkovej dysfunkcie, môže byť v konečnom dôsledku potrebný na úspešný vývoj účinného terapeutického prostriedku. Mechanistické spojenie medzi nedostatkom DNA stabilizačné proteíny ako ATM a APTX a dysfunkcia PN nie je ani zďaleka jasná. Naše výsledky naznačujú, že účinok straty ATM a APTX na PN je vnútorný, pretože nenájdeme zmeny v presynaptických vlastnostiach granulových buniek ani dôkazy o ich bunkovej strate (žiadna zmena hrúbky GCL). Okrem toho, zatiaľ čo sme pozorovali rozdiely v krátkodobej plasticite nižších olivárnych vstupov u PN s deficitom ATM a APTX a divokého typu, tieto výsledky pravdepodobne poukazujú na narušenie homeostázy Ca2* potenciálne prostredníctvom zníženia inozitolu 1,4,5- expresia trifosfátového receptora 1 (ltpr1), podobná expresii pozorovanej v myšacích modeloch SCA 1, 2 a 3, ako aj u myší s deficitom ATM (Kim a kol. 2020; Chen a kol. 2008; Demirci a kol. 2009; Shakkottai a kol. al.2011). Aj keď to poskytuje sľubnú cestu pre budúce skúmanie a porovnávanie, zatiaľ nie je jasné, dokonca ani pre SCA, či sú zmeny v homeostáze Ca2* kauzálnym faktorom alebo len ďalším symptómom alebo dokonca kompenzačnou reakciou chorých alebo narušených PN (Dell „Orco a kol., 2015). V imunitnom systéme sa ATM podieľa na oprave zlomov DNA, ktoré sa prirodzene vyskytujú počas preskupenia génov antigénových receptorov v prekurzoroch B- a T-buniek, čo je fenomén kritický pre diverzitu antigénnych receptorov (LG a TCR) týchto buniek. zistenie tohoT-bunkaproporcie v krvi sú významne znížené, čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami na ľuďoch a AT knockout myšiach (Schubert, Reichenbach a Zielen 2002; Hathcock a kol. 2013; Chao, Yang a Xu 2000; Barlow a kol. 1996). Toto zníženie T-buniek na periférii pravdepodobne koreluje s defektom bunkovej aj humorálnej imunity. Dôležité je, že sme zistili, že expresia jednej kópie génu ATM je dostatočná na obnovenie deficitov CD4 plus v krvi, čo naznačuje, že terapie schopné obnoviť čiastočnú expresiu ATM by mali terapeutickú účinnosť. Aj keď sme v tomto článku nehodnotili vývoj B-buniek, je pravdepodobné, že podobné závery by sa vzťahovali na tento proces vzhľadom na ich mechanické podobnosti (Marshall et al. 2018). Ako sa očakávalo, redukcia T-buniek v periférnej krvi koreluje s defektným vývojom tymocytov. V týmuse sme zistili dva hlavné defekty. Jeden, vyvolaný primárne deficitom APTX, sa prejavuje ako defekt v prechode DN3 na DN4, ktorý sa zhoduje so skorým preskupením lokusu TCR. Ďalší defekt, primárne spôsobený deficitom ATM, koreluje so zníženou progresiou dvojito pozitívnych CD4*CD8 na jednopozitívne bunky, predovšetkým CD4' tymocyty. Zatiaľ čo zistenie APTX bolo prekvapujúce, pretože jeho nedostatok (AOA 1) nie je spojený s imunitným deficitom, je známe, že APTX interaguje s proteínmi preskupenia génu TCR, vrátane XRCC4 (Clements et al. 2004). Budúce štúdie zamerané na definovanie úlohy APTX v mechanizmoch spájania koncov počas preskupenia génu TCR budú

je dôležité a možnosť, že alternatívne mechanizmy spájania koncov, ako je použitie mikrohomológií, zodpovedajú za nedostatok imunitného deficitu v jeho neprítomnosti, si vyžaduje ďalšie skúmanie (Bogue et al. 1997). Schopnosť prežitia Atm?35×/R35×; Aptx'myši sú podstatne dlhšie ako predchádzajúce modely myší AT. Na porovnanie, prvýAT KOmyšací model opísaný Barlowom a kol. zomrel na tymómy zvyčajne do 2-4 mesiacov po narodení (Barlow et al. 1996). Znížená schopnosť prežitia rakoviny v tomto a mnohých ďalších modeloch knockout myší AT je pravdepodobne genetická, pretože sa ukázalo, že kmeň v pozadí, ktorý obsahuje mutáciu, má významné účinky na prevalenciu rakoviny a prežitie, s A/J a C57BL/6

pozadia s výrazne zvýšenou schopnosťou prežitia v porovnaní s kmeňmi BALBC a 129S (Genik et al. 2014). Pravdepodobným základom je skutočnosť, že naše myši s nedostatkom ATM boli vytvorené na pozadí C57BL/6; že u myší Aptx*t sa nevyvinie ataxia, je to ich pomerne dlhá životnosť. Vzhľadom na to, že Atm35xR35×; nepravdepodobné, že skorá smrť u AT KO myší zabráni pozorovaniu ataxického fenotypu, ktorý by sa inak u týchto myší vyvinul. Nie je však známe, či pozadie C57BL/6 poskytuje odolnosť voči rozvoju ataxie, ako je to pri rakovine. Definovanie genetických alebo prípadne epigenetických faktorov, ktoré ovplyvňujú závažnosť ochorenia, by mohlo poskytnúť cesty pre budúci terapeutický vývoj. Vzhľadom na globálnu povahu nulovej mutácie ATM a APTX v našom myšacom modeli nemôžeme úplne vylúčiť, že k závažnému ataxickému fenotypu môžu prispieť aj extracerebelárne defekty, a teda budúce vyšetrenie mimo mozočku v prednom mozgu, mozgovom kmeni, mieche , a dokonca aj svaly bude potrebné vykonať. V mozočku, aj keď sme našli určité anatomické rozdiely vo vlastnostiach streľby PN v rôznych oblastiach mozočka, nezistili sme regionálne rozdiely v šírke ML alebo hustote PN. Pri používaní regionálnej anatómie ako faktora zoskupenia v mozočku však existujú problémy, pretože fyzické záhyby tkaniva nemusia nevyhnutne korelovať s hranicami funkčných domén, domén molekulárnej expresie alebo domén fyziologických vlastností, ktoré boli opísané (Apps a Hawkes 2009 Tsutsumi a kol. 2015; Gao, van Beugen a De Zeeuw 2012; Zhou a kol. 2014). Experimenty zamerané na skúmanie rozsahu cerebelárnych defektov v týchto doménach budú dôležité v budúcich štúdiách a budú sa porovnávať s neoficiálnymi správami o anatomických rozdieloch u pacientov s AT (Verhagen a kol. 2012; De Leon, Grover a Huff 1976; Amromin, Boder, a Teplitz 1979; Monaco a kol. 1988; Terplan a Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare a Lopez 1967; Aguilar a kol. 1968a; Paula-Barbosa a kol. 1983). Zatiaľ čo v Atm735wR35x zisťujeme dve potenciálne štádiá progresie ataxie; Aptx myši, neskoršie štádium závažnej ataxie sa u myší vyvíja v dospelosti v porovnaní s nástupom v detstve u ľudí. To môže obmedziť jeho použitie v niektorých neurovývojových štúdiách. Interpretácia budúcich experimentov musí tiež starostlivo zohľadniť skutočnosť, že tento nový model vyjadruje nulové mutácie v dvoch génoch stability genómu súčasne, čo je situácia, ktorá nebola zistená u ľudských pacientov s AT ani AOA1. Nakoniec, presne určiť, kde, kedy a ako nedostatok ATM spôsobuje cerebelárnu patológiu a ataxiu, bolo výzvou, pretože predchádzajúcim myšiam s deficitom ATM vo všeobecnosti chýbajú charakteristické znaky potrebné na kauzálne prepojenie bunkových a molekulárnych deficitov s ataxickým fenotypom. Boli definované viaceré sľubné cesty skúmania, vrátane tých, ktoré sú zamerané na neurónovú úroveň, kde sa ATM podieľa na signalizácii oxidačného stresu (Chen et al. 2003) a synaptickej funkcii (Li et al. 2009; Vail et al. 2016). ako aj gliová funkcia, kde nedávne dôkazy naznačujú, že gliová patológia môže byť hlavným faktorom v cerebelárnej patológii (Kaminsky a kol. 2016; Campbell a kol. 2016; Petersen, Rimkus a Wassarman 2012; Weyemi a kol. 2015). Tento nový zvierací model poskytuje nový nástroj na testovanie mechanistických hypotéz týkajúcich sa toho, ako nedostatok ATM spôsobuje cerebelárnu patológiu a ataxiu. Okrem toho môže tento model slúžiť predovšetkým ako kritický predklinický nástroj na testovanie predtým navrhnutých terapeutických kandidátov (Browne a kol. 2004; Chen a kol. 2003) a našich vlastných zlúčenín SMRT (Du a kol. 2013). Vážne obmedzenia neexistencie vhodného predklinického modelu na terapeutické testovanie, najmä pre zriedkavé poruchy ako AT a AOA1, nemožno preceňovať.

4.0 Materiály a metódy

4.1 Etické vyhlásenie

Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami v príručke pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Národného inštitútu zdravia. So všetkými zvieratami sa zaobchádzalo podľa schválených protokolov Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) v The Lundquist Institute (31374-03,31773-02) a UCLA (ARC-2007-082, ARC{{3}). }). Protokol bol schválený Výborom pre etiku experimentov na zvieratách Lundquist Institute (číslo záruky: D16-00213). Bolo vynaložené maximálne úsilie na minimalizáciu bolesti a utrpenia poskytovaním podpory v prípade potreby a výberom etických cieľov.

4.2 Myši

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>Mutácia T nájdená vo veľkej populácii severnej AfrikyATpacientov using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), replikujúci ľudský AT PTC). Genomické alely sa potom klonovali do modifikovanej verzie cicavčieho zacieleného vektora NorCOMM pomocou 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). Výsledné targetingové vektory boli elektroporované do C2 ES buniek (C57BI/6N, odvodené v laboratóriu A. Nagy, Toronto, Kanada) a úspešne cielené klony boli identifikované selekciou pomocou G418 (Gertsenstein et al.2010). Integrácia mutovanej targetingovej kazety do lokusu Atm génu bola potvrdená Southern blotom a sekvenovaním produktov PCR na potvrdenie prítomnosti mutácie Atm PTC, bezchybného zacielenia do lokusu Atm a bezchybných funkčných komponentov lokusu Atm.

vektor (údaje nie sú uvedené). Pozitívne ES klony sa použili na injekciu blastocyst, aby sa získali transgénne línie. Transgénna alela obsahovala floxovaný ľudský beta-aktínový promótor-deltaTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc; (obr. 1A). Genotypizácia dvoch Atm línií sa uskutočnila s použitím nasledujúcich primérov na Tm 62 stupňovom stupni: Atm génový predný (F) primér: 5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; a Atm génový reverzný(R)primér: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', čím sa vytvorí produkt alely divokého typu 151 bp alebo cieľový alelový produkt 241 bp (obr. 1A, 1B). Atmn35~ a Atm035×v boli spätne krížené s myšami C57Bl/6J počas 9 generácií (99,2 percent izogénne) pred kryokonzerváciou a následnou rederiváciou s použitím náhradných matiek C57BI/6J. Atm735× a Atm?35xa Atm 35×/Q35× boli šľachtiteľmi získaní z F1 súrodencov Atm35 a Atm835X plus myší. AtmR35×k35×: zistilo sa, že obe sú plodné. Myši Aptx knockout (Aptx) boli vytvorené a poskytnuté Dr. Mathewsovi ako embryá od Dr. McKinnona (Ahel a kol. 2006) a následne získané prostredníctvom náhradných matiek C57Bl/6J. Myši Aptx' sú na zmiešanom pozadí C57Bl/6 a 129. Atm35k35; Aptx myši rôznych divokých, heterozygotných a homozygotných kombinácií boli vytvorené z Atm35X; Aptx šľachtiteľské boli vytvorené krížením myší Atm?35xR35 a Aptx^. Jedna kohorta dvojitých mutantov a zodpovedajúcich kontrolných myší sa použila v longitudinálnej behaviorálnej štúdii na analýzu chôdze a testovanie SHERPA (obr. 2, 3). Na elektrofyziologické, imunohistologické a testovacie experimenty s vertikálnym pólom sa použili viaceré ďalšie kohorty vekovo zodpovedajúcich dvojitých mutantných a kontrolných myší (obr. 4, 7). Imunologické experimenty a experimenty s expresiou proteínov sa uskutočňovali s použitím myší chovaných z pôvodných myší odvodených z AtmR35x a Atm35x (obr. 5, 6 a 8). Genotypizácia sa uskutočnila zo vzoriek ušného tkaniva myší P8-11. Na určenie genotypu každého zvieraťa sa použili metódy real-time PCR realizované spoločnosťou Transnetyx Inc. Zvieratá boli identifikovateľné pomocou tetovania na nohe, ktoré bolo urobené v rovnakom čase ako biopsia ucha. Jedinečné priméry pre Atm35x a Atm35x boli kvantifikované a použité na identifikáciu divokých, heterozygotných a homozygotných myší (uvedené vyššie). Na hodnotenie ich genotypov sa použili priméry Aptx' a Aptx*".

4.3 Zdravie zvierat

Zvieratá boli odvážené pomocou digitálnej váhy pri P8, 45, 120,210,400. Úmrtie zvieraťa sa zaznamenávalo ako deň nájdenia mŕtveho alebo v deň eutanázie, keď zvieratá dosiahli humánny koncový bod (zviera neschopné narovnať sa do 60. rokov, výrazná srsť indikujúca nedostatočnú starostlivosť o seba alebo nadmernú úzkosť, ako poznamenal veterinárny lekár personál). Mŕtve telá zvierat boli po smrti okamžite zmrazené a posmrtné pitvy boli uskutočňované v dávkach. Pravdepodobná príčina smrti bola podľa našich najlepších schopností stanovená v spolupráci s veterinárnym lekárom (Dr. Catalina Guerra) vizuálnou kontrolou vnútorných orgánov. Niektoré myši boli kanibalizované alebo náhodne zlikvidované personálom vivária a boli

preto boli označené ako „chýbajúce“. Myši bez rozlíšiteľnej vizuálnej príčiny smrti boli označené ako „neurčiteľné“. pravdepodobné príčiny smrti (napr. zväčšenie pečene, upchatie moču) boli označené ako „iné“.

4.4 Správanie

Pred vykonaním akéhokoľvek behaviorálneho testu boli myši aklimatizované na behaviorálnu sadu približne 20 minút. Myši boli testované v rôznych časoch dňa v súlade s ich denným cyklom. Séria behaviorálnych testov sa uskutočnila na naivných dvojitých mutantných myšiach uvedených genotypov v rôznych časových bodoch v závislosti od správania, ale v rovnakej kohorte myší. Batéria testov zahŕňala hodnotenie Catwalk Gait (P45, 120,210, 400) a podskupinu testov SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College a Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 a 400). Tieto testy vykonalo UCLA Behavioral Core. Myši s dvojitým mutantom a kontrolné myši sa dodatočne skúmali testom na vertikálny pól. Všetky behaviorálne prístroje boli utreté etanolom (70 percent) medzi každým testovaným subjektom.

Analýza chôdze

Použili sme analytický systém Noldus Catwalk Gait navrhnutý na poloautomatické meranie a analýzu chôdze myší počas normálnej chôdze. Stručne povedané, pohyb myší cez chodbu so skleneným dnom je video zaznamenané z centrálnej polohy. Odtlačky labiek sú vo videu zvýraznené vďaka svetelnému osvetleniu cez sklenenú vychádzkovú plošinu. Každý krok myšou vo videu je následne detekovaný pomocou Catwalk XT (Noldus) poloautomatickým spôsobom. Cyklus pre každú myš pozostáva z 3 pokusov konzistentnej chôdze naprieč monitorovanou platformou. Akceptované sú iba konzistentné testy a myši môžu trvať až 10 pokusov na dokončenie 3 vyhovujúcich testov v oboch smeroch cez chodbu. Vyhovujúce skúšky boli definované ako skúšky s pohybom po platforme kratším ako 5 s a s nie väčšou ako 60-percentnou zmenou rýchlosti. Po umiestnení na platformu myši zvyčajne behali tam a späť bez toho, aby potrebovali výzvu experimentátora.

Vertikálny pól

Myši sa umiestnia na vrchol 80 cm vysokej skrutky s nosom smerom nadol a zadnými labkami čo najbližšie k vrcholu. Myši sa okamžite vypustia a čas začne okamžite po umiestnení.

Čas sa zastaví, keď sa prvá predná labka dotkne povrchu pod žrďou. Prirodzenou záľubou myši je okamžite zliezť po tyči a na prekonanie tyče má čas až 60 s, v opačnom prípade im pomôže zliezť tyč. Nedokončenej skúške sa automaticky pridelí čas 30 s, pretože 95 percent myší, ktoré nezostúpili do 30 s, bolo stále na tyči pri značke 60 s. Behaviorálne testy SHIRPA vykonala Kalifornská univerzita v Los Angeles Behavioral Core na P30

a P400. Všetky parametre sú hodnotené, aby poskytli kvantitatívne hodnotenie. čo umožňuje porovnávanie výsledkov v čase a medzi rôznymi laboratóriami. Každá myš bola postupne testovaná naprieč všetkými správaniami v časovom rozpätí ~{1}}min, kým sa presunula na ďalšiu myš. Experimentátor bol zaslepený voči zvieraciemu genotypu. Skríning sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie (Rogers et al. 1997).

Behaviorálne pozorovanie

Primárna obrazovka poskytuje profil pozorovania správania a hodnotenie každého zvieraťa začína pozorovaním nerušeného správania v pozorovacej nádobe (priemer 10 cm) počas 5 minút. Okrem skórovaného správania polohy tela, spontánnej aktivity, frekvencie dýchania a chvenia pozorovateľ zaznamenáva všetky prípady bizarného alebo stereotypného správania a kŕčov, nutkavého lízania, sebadeštruktívneho hryzenia a retropulzie (chôdza dozadu) a náznaky priestorových prejavov. dezorientácia.

Správanie v aréne

Potom sa myš prenesie do arény (30 cm x 50 cm) na testovanie vzrušenia prenosu a pozorovanie normálneho správania. Aréna je označená v mriežke štvorcov 10 x 10 cm² na meranie lokomotorickej aktivity v priebehu 30 s. Kým je myš aktívna v aréne, zaznamenávajú sa miery odozvy zľaknutia, chôdze, zdvihnutia panvy a zdvihnutia chvosta.

Zadržiavanie na chrbte

Zviera je pripútané v polohe na chrbte, aby sa zaznamenalo autonómne správanie. Počas tohto hodnotenia sa hodnotila sila úchopu, tonus tela, jabĺčkový reflex, rohovkový reflex, zovretie prstov na nohe, manéver drôtu a srdcová frekvencia.

Rovnováha a orientácia

Nakoniec sa vykonalo niekoľko meraní funkcie vestibulárneho systému. Boli vykonané testy vzpriamovacieho reflexu, kontaktného vzpriamovacieho reflexu a negatívnej geotaxie. Počas tohto postupu sa zaznamenávala vokalizácia, močenie a celkový strach, podráždenosť alebo agresivita.

Použité vybavenie

1.Číra plexi aréna (približné vnútorné rozmery 55x33 x18 cm). Na podlahe arény je doska z plexiskla označená 15 štvorcami (11 cm). Pevný vodorovný drôt (priemer 3 mm) je pripevnený cez pravý zadný roh tak, aby sa zvieratá počas manévru s drôtom nemohli dotýkať strán. Mriežka (40 x 20 cm) s 12 mm sieťovinou (približne) je pripevnená po celej šírke krabice na meranie zavesenia chvosta a sily úchopu. 2. Ako pozorovacia nádoba sa použil číry valec z plexiskla (15 x 11 cm). 3. Jedna mriežková podlaha (40x 20 cm) s 12 mm okami, na ktorých stoja poháre.4. Štyri valcové podpery z nehrdzavejúcej ocele (dĺžka 3 cm x priemer 2,5 cm) na zdvihnutie mriežky z lavičky. 5. Jedna štvorcová (13 cm) platňa z nehrdzavejúcej ocele na presun zvierat do arény. 6. Odrežte dĺžky 3/0 Mersilk držaného v kliešťoch na testy reflexu rohovky a ušnice. Pár klieští na pitevné vybavenie, zakrivené s jemnými hrotmi (125 mm kliešte, Philip Harris Scientific, kat. č. D46-174), na štípanie prsta na nohe. 9.A stopky.10. IHR Click box sa používa na testovanie úľakových reakcií. Click Box generuje krátky 20 kHz tón pri 90 dB SPL, keď sa drží 30 cm nad myšou. Kontaktujte profesora KP Steela, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Pravítko.12.30 cm číra trubica z plexiskla s vnútorným priemerom 2,5 cm pre kontaktný vzpriamovací reflex.4.5 Elektrofyziológia Príprava akútneho cerebelárneho rezu Roztomilé parasagitálne rezy s hrúbkou 300 μm boli pripravené z mozočku pokusných a kontrolných myší z rovnakého vrhu podľa publikovaných metód (Hansen et al., 2013). Stručne povedané, mozoček sa rýchlo odstránil a ponoril do ľadovo studeného extracelulárneho roztoku so zložením (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glukózy, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla a 1 NaHzPOa, pH 7,4, keď splynovaný 5 percentami CO-/95 percentami O2. Cerebella sa parasagitálne narezala pomocou vibratómu (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Nemecko) a spočiatku sa inkubovala pri 35 stupňoch-30 min a potom sa ekvilibrovala a skladovala pri izbovej teplote až do použitia. Extracelulárna elektrofyziológia Extracelulárne a intracelulárne záznamy sa získali z Purkyňových neurónov (PN) v rezoch neustále perfundovaných extracelulárnym roztokom s bublinkami karbogénu a udržiavaných buď pri 37 stupňoch C (extracelulárne) alebo 32 stupňoch (intracelulárne) ± 1 stupeň (pozri vyššie). Bunky sa vizualizovali optikou DIC a objektívom 40x ponoreným do vody (NA 0,75) s použitím mikroskopu Zeiss Examiner. Sklenené pipety s odporom ~3 MQ (Model P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) sa naplnili extracelulárnym roztokom a umiestnili sa blízko PN axónových kopčekov, aby sa zmerali kapacitné prúdové prechody spojené s akčným potenciálom v režime napäťovej svorky s potenciálom pipety udržiavaným na 0 mV. Pre celobunkové záznamy pomocou náplasti sa pipety naplnili intracelulárnym roztokom (mM): 140 mesiacov (CH3K03S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 fosfokreatín (tris soľ), 1 EGTA, 4 Mg -ATP, 0,4 Na-GTP. 100 uM pikrotoxín (Sigma) sa pridal na blokovanie inhibičných GABAegerických synaptických vstupov. Údaje boli získané pomocou

zosilňovač MultiClamp 700B pri 20 alebo 100 kHz v režime napäťovej alebo prúdovej svorky, Digidata 1440 s pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a filtrovaný pri 2 až 4 kHz. Sériový odpor bol zvyčajne medzi 10 a 15 MQ. Sériový odpor bol kompenzovaný na 80 percent len ​​pre krátkodobé experimenty plasticity. Pre extracelulárne záznamy bolo zaznamenaných celkovo 20 až 45 PN pre každé zviera vo všetkých genotypoch, pohlaviach a vekových skupinách. Záznamy boli distribuované cez mediálno-laterálnu aj rostrokaudálnu os cerebellum. Skúmali sa len bunky so "zdravým" vzhľadom (nízky kontrast bunkových hraníc) a pravidelnou, neprerušovanou rýchlosťou vypaľovania. Počas analýzy sa zistilo, že niekoľko buniek má medzery v pálení väčšie ako 2 sekundy a tieto bunky boli z analýzy vylúčené, pretože tento typ pálenia je spojený s tým, že je „nezdravý“. Dvojité mutantné tkanivo sa kvalitatívne nelíšilo v objavenia sa pod DIC mikroskopiou pred záznamami, ani počet "nezdravých" buniek nebol väčší ako počet iných genotypov (7 percent oproti 4 až 11 percentám všetkých buniek v kontrolných genotypoch pri P400). Priestorové porovnanie neurálnej aktivity sa získalo záznamom zo sériových rezov vločkových, laterálnych (2" alebo 3'), stredných (6" alebo 7.) a mediálnych (11" alebo 12t) rezov. Rezy s nižším počtom boli použité v mladšie vekové skupiny (P45 a 110), aby približne zodpovedali relatívnemu umiestneniu záznamov naprieč vekovými skupinami. 0-3 záznamy boli urobené z každého laloku v rámci každého rezu v závislosti od kvality tkaniva a zdravia. Každý záznam trval {{29} Pre každú vekovú skupinu sa použilo 3 až 5 myší a experimentátor bol zaslepený na genotyp, vek a pohlavie.

Intracelulárne záznamy boli získané z PN buď v lalôčiku IIl alebo VIl stredného mozočka (tj vermis); medzi lalokmi neboli pozorované žiadne štatistické rozdiely vo vlastnostiach.

Analýzy

Interstimulačné intervaly spontánneho akčného potenciálu boli detekované a analyzované pomocou štandardných a vlastných rutín v ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) a Excel (Microsoft). Konkrétne, akčné potenciály boli detegované na prahu a pomocou prispôsobených programov (TaroTools; https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/) sa určili vrcholové štatistiky (tj frekvencia a dĺžka intervalu). Variačný koeficient stredného intervalu medzi špičkami (CV) a medián intervalu medzi špičkami (CV2=2 ISIn plus 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus ISIn)) sa vypočítali v Exceli pomocou vlastné makrá. Štandardné vlastnosti membrány boli analyzované pomocou lgorPro. RM bola určená spriemerovaním 3 odoziev napäťovej krivky na -5 mV krokový impulz z -80 mV udržiavacieho potenciálu a meraním výslednej prúdovej odchýlky medzi 900 a 1000 ms po nástupe. Časová konštanta membrány sa merala prispôsobením jednej exponenciály počiatočnej fáze rozpadu od 90 percent do 10 percent vrcholu. CM bola vypočítaná vydelením membránovej časovej konštanty RM. sEPSC udalosti boli zaznamenané počas 1-minútovej epochy a detegované a merané pomocou Neuroexpress (v21.1.13). Paralelné a stúpajúce axóny vlákien boli stimulované pomocou sklenených elektród theta (WPI) a TTL-riadeného stimulačného izolátora (ISO-Flex, AMPI). Vyvolané amplitúdy EPSC a konštanty času rozpadu (1 exp. pre paralelné a 2 exp. pre šplhacie vlákna) boli analyzované pomocou vlastných rutín v lgorPro. Akčné potenciály boli skúmané ako súčasť sady 1 s prúdových injekcií medzi -500 a 2250 pA (250 pA kroky) s prídržným prúdom nastaveným tak, aby sa udržal potenciál ~70 mV. Krivky akčného potenciálu boli merané pomocou vlastného

rutiny v lgorPro. Prah akčného potenciálu bol definovaný ako prvé membránové napätie, pri ktorom prvá derivácia prekročila 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Vyšetrenie cerebelárnej atrofie

Veľkosť mozočku Ihneď po odstránení mozgu z lebky sa získal dorzálny obraz celého tela. Obrázky sa potom spracovali pomocou Fidži (NIH). Veľkosti predného mozgu a mozočku sa hodnotili načrtnutím ich 2-rozmerného priestoru a následným výpočtom plochy. Normalizovali sme možné rozdiely v celkovej veľkosti mozgu vydelením výsledkov mozočka veľkosťou predného mozgu, aby sme vytvorili relatívny pomer mozoček k prednému mozgu. Experimentátori boli slepí voči genotypu zvieraťa. Imunohistochémia V príslušných koncových bodoch štúdie (P45, 120,210,4{{7{{1{108}}4}}}}0), samce a samice myší všetkých genotypov zastúpený v tejto štúdii bol anestetizovaný izofluránom a podstúpil transkardiálnu perfúziu fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom, po ktorom nasledoval 4 % (w/v) pufrovaný paraformaldehyd (PFA) a potom sa vyrezal, aby sa extrahoval mozog. Snímky celého mozgu sa urobili ihneď po odstránení mozgu z lebky a mozgy sa potom ponorili do 4 percent PFA na 24 hodín a potom sa kryochránili v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS) s 0,05 percentami azidu a 30 percentami sacharózy počas 72 hodín. hodiny a skladujte pri 4 stupňoch až do ďalšieho použitia. Mozoček sa oddelil od predného mozgu a parasagitálne sa rozrezali pomocou posuvného mikrotómu (Microm HM 430, Thermo Scientific) nastaveného na rezy s hrúbkou 40 μm. Rezy cerebellum boli odobraté v sérii šiestich a uložené v TBS-AF (TBS s 30 percentami sacharózy, 0,05 percentami azidu sodného a 30 percentami etylénglykolu) pri 4 stupňoch alebo -20 stupňoch až do ďalšieho použitia. Na imunofluorescenčnú vizualizáciu Purkyňových neurónov, cerebellum rezov oboch Atm*; Aptx*t a Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 na genotyp) boli trikrát premyté 5 minút v TBS a potom blokované v 15-percentnom normálnom kozom sére pri izbovej teplote počas 30 minút, po čom nasledovala voľne plávajúca inkubácia v králičom alebo myšacom anti-kalbindíne D -28k (1:1000) počas 1 hodiny pri izbovej teplote na orbitálnej trepačke. Rezy sa potom trikrát premyli 5 minút TBS, nasledovala voľne plávajúca inkubácia v kozej anti-králičej alebo myšacej Alexa Fluor 488 (1:1000) počas 1 hodiny v tme pri teplote miestnosti na orbitálnej trepačke. Po sekundárnej inkubácii protilátky sa rezy trikrát premyli 5 minút v TBS, potom sa namontovali a prikryli s Fluoromount-G s DAPI. Pre niektoré rezy boli protilátky proti štiepeniu kaspázy-3(1:200) a anti-CD68(1:400) dodatočne testované paralelne s Calbindinom pomocou sekundárnej protilátky Alexa Fluor 647 (1:500). Sklíčka boli naskenované pomocou Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver. 2020) na mikroskope Zeiss vybavenom ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) s použitím objektívu 2,5, 10, 20, 40 alebo 63x a obrázkov zachytené kamerou Hamamatsu CMOS (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Na kvantifikáciu počtu buniek reagujúcich na kalbindín v každom lalôčiku vo výsledných snímkach sme použili Stereo Investigator na náhodné nakreslenie 2 čiar s dĺžkou 300 až 500 μm v každý lalok a manuálne spočítali celkový počet PN pozdĺž dĺžky v rámci hrúbky 40 um plátku tkaniva pri 40-násobnom zväčšení. Potom sa stanovila 2D hustota (počet PN/(lineárna dĺžka*40 um hrúbka)) dvoch vzoriek na lalok. spriemerované pre ďalšie porovnanie medzi lalokmi a zvieratami. Šírky kalbindinu pozitívneho PN dendritu sa merali na vopred definovanom mieste v lalôčiku VI od každého zvieraťa v 25 alebo 40 um hrubých tkanivových rezoch pri 20-násobnom zväčšení. Dendritické šírky primárnych a sekundárnych vetiev sa merali na strednej čiare medzi telami PN buniek a okrajom molekulárnej vrstvy. Na jednom reze sa nameralo 7 až 13 dendritov, jeden rez na zviera. Na somatické merania PN sa použil Stereo Investigator na náhodný výber PN distribuovaných v celej mediálnej sekcii pri 20-násobnom zväčšení. Priemerná šírka PN na zviera sa určila spriemerovaním výsledkov v 3 sériových sekciách (16 až 37 PN na sekciu). Šírky PN sa merali kolmo na vrstvu PN alebo na výstupný dendrit, ak bol naklonený o viac ako niekoľko stupňov. Šírka molekulárnej vrstvy a vrstvy granulových buniek (vizualizované farbivami Calbindin a DAPI, v tomto poradí) sa hodnotila v Stereo Investigator spriemerovaním dvoch meraní šírky na vopred definovaných miestach pre každý lalok, zhruba v polovici spolu s dlhým rozsahom každého laloku pri 2,5-násobnom zväčšení. CD68 pozitivita v cerebelárnych rezoch bola kvantifikovaná meraním celkovej percentuálnej plochy CD68 plus pozitívne farbenie cez celú strednú cerebelárnu sekciu. 10x zošité obrázky boli prahované na negatívnu kontrolu a kvantifikované pomocou ImageJ, jedna sekcia na zviera. Aby sme kvantifikovali percento Calbindin-pozitívnych PN, ktoré boli pozitívne na štiepenú kaspázu{94}}, spočítali sme PN v celom mozočku pomocou Stereo Investigator. Preskúmali sa tri zošité obrázky s 20-násobným zväčšením na zviera a výsledky sa spriemerovali. Prah pre pozitivitu kaspázy bol stanovený z kontrolných rezov zafarbených iba sekundárnymi protilátkami. Na nefluorescenčnú histologickú analýzu 25-umte hrubé, voľne plávajúce rezy tkaniva na pozitívne nabité sklíčka a vysušte cez noc na vzduchu. Tkanivo sa premývalo vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) dvakrát počas 5 minút, potom sa postupne farbilo 0,1 percentami hematoxylínu v 95 percentách etanolu po dobu asi 25 sekúnd a 0,5 percenta eozínu v 95 percentách etanolu asi 3 s a potom sa premylo v dvakrát destilovanej vode každá škvrna. Tkanivo sa následne dehydratovalo počas 1 minúty v 95 percentách etanolu, 100 percentách etanolu a 100 percentách xylénu, potom sa prekrylo krycím sklíčkom Permountom. Sklíčka sa zobrazili pomocou farebnej kamery (Q Imaging, MBF Biosciences) na rovnakom mikroskope Zeiss a akvizičnom softvéri MBF. Experimentátori boli zaslepení voči myšaciemu genotypu, v ktorom boli skúmané rezy, a poradie skúmania bolo preložené pre všetky histologické merania.

4.7 Merania prietokovou cytometriou

Analýza krvi a buniek týmusu prietokovou cytometriou sa uskutočnila farbením špecifickými anti-myšími protilátkami∶CD4, CD8, CD3, CD44 a CD25. Stručne, vzorky celej krvi (50 μ) boli zafarbené pomocou fluorescenčne značených protilátok, potom boli červené krvinky lyzované pomocou BD lyzačného roztoku, zatiaľ čo živé biele krvinky boli zafarbené pomocou farbenia životaschopnosti. Thymi boli mechanicky disociované. 1 až 2 milióny buniek týmusu sa podobne zafarbilo s použitím špecifických protilátok pre CD4, CD8, CD44 a CD25. Analýza imunofarbených vzoriek bielych krviniek alebo týmusu sa uskutočnila pomocou FACS ARIA 1 a údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo, ako už bolo uvedené (Sanghez et al. 2017).

4.8 Western BIots

Proteínové extrakty (bunky/tkanivá) sa homogenizovali v lyzovacom pufri pre rádioimunoprecipitačný test (RIPA) (150 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 percenta deoxycholátu,0,1 percenta SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) s inhibítormi proteázy (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptín, 5 ug/ml pepstatín, 5 ug/ml chymotrypsín, 10 ug/ml aprotinínu). Proteínové extrakty boli sonikované a potom peletované centrifugáciou pri 13, 000 otáčkach za minútu počas 15 minút pri 4 °C. Na kvantifikáciu koncentrácií proteínov sa použil proteínový test BCA. Vzorky obsahujúce rovnaké množstvá proteínu 50 až 100 ug na dráhu sa oddelili pomocou 4 až 12 percentného gradientu TGX prefabrikovaných gélov BioRad a potom sa preniesli systémom TransBlot Semi-Dry BioRad s použitím nitrocelulózového prenosového balenia. Prenesené bloty sa zafarbili farbivom Ponceau S na rovnaké naplnenie proteínu, potom sa premyli a blokovali 5 percentným odtučneným sušeným mliekom v TBST počas 60 minút pri teplote miestnosti. Primárne protilátky boli inkubované za trepania cez noc pri 4 stupňoch. Bloty boli testované na nasledujúce protilátky: ATM (D2E2) králičia mAb bunková signalizácia, v riedení 1:1000, -aktín (D6A8) králičia mAb bunková signalizácia, GAPDH (D16H11) králičia mAb bunková signalizácia nasledovaná vhodnou chrenovou peroxidázou HRP) sekundárne anti-králičie, anti-myšie 2 hodiny pri izbovej teplote. Po viacnásobnom premytí TBST bola expresia proteínu detegovaná pomocou chemiluminiscenčného substrátu Radiance Plus pomocou zobrazovacích systémov Azure c400 a BioRad ChemiDoc. Denzitometrická analýza ATM sa uskutočnila pomocou ImageJ. Experimenty sa uskutočnili s 2 technickými a 2-3 biologickými replikátmi, ako je uvedené.

4.9 Štatistické hodnotenie

Počet zvierat vybraných pre každú skupinu bol založený na a priori analýze sily s použitím GPower v3.1 na základe veľkosti 0,5, sily 0,8 a veľkosti účinku odhadovanej z predbežných údajov alebo predchádzajúce štúdie. Použili sme parametrické (1-a 2-spôsob ANOVA) pre normálne rozdelené a neparametrické (Kruskal Wallace) štatistické metódy pre intervalové údaje na testovanie rozdielov medzi skupinami, po ktorých nasledovali párové viacnásobné porovnávacie testy, ako je uvedené v text. Odľahlé hodnoty pre imunitné dáta na obr. 6 a 7 boli vylúčené pomocou metódy ROUT (Q=2 percent ). Špecifické analýzy použité pre každý súbor údajov sú uvedené v legende každého obrázku. Pre všetky obrázky: ns nevýznamné,*p Menšie alebo rovné 0,05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">