ACKR4a indukuje autofágiu, aby blokovala NF-kB signalizáciu a apoptózu, aby uľahčila infekciu Vibrio Harveyi

SÚHRN

Autofágia a apoptóza sú dva uznávané mechanizmy rezistencie voči bakteriálnej invázii. Avšak aj baktérie si vyvinuli schopnosť vyhýbať sa imunite. V tejto štúdii identifikujeme ACKR4a, člena rodiny atypických chemokínových receptorov, ako supresor dráhy NF-kB, ktorý spolupracuje s Beclinom-1 na indukcii autofágie na inhibíciu signalizácie NF-kB a blokovanie apoptózy, čo uľahčuje Infekcia Vibrio harveyi. Mechanicky V. harveyi-indukovaný Ap-1 aktivuje ACKR4a transkripciu a expresiu. ACKR4a tvorí komplex s Beclinom-1 a MyD88, v uvedenom poradí, indukuje autofágiu a transportuje MyD88 do lyzozómu na degradáciu, aby sa potlačila produkcia zápalových cytokínov. Medzitým autofágia indukovaná ACKR4a blokuje apoptózu inhibíciou kaspázy8. Táto štúdia po prvýkrát dokazuje, že V. harveyi používa autofágiu aj apoptózu, aby sa vyhol vrodenej imunite, čo naznačuje, že V. harveyi vyvinul schopnosť proti imunite rýb. 

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

ÚVOD

Imunitný systém sa vo všeobecnosti delí na vrodenú a získanú imunitu, pričom väčšina organizmov sa pri prežití spolieha predovšetkým na prirodzenú imunitu.1 Vrodená imunita je obranný mechanizmus vytvorený v organizmoch. Rozpoznáva molekulový vzor spojený s patogénom (PAMP) prostredníctvom receptorov na rozpoznávanie vzorov (PRR), poskytuje rýchlu odpoveď na patogénnu infekciu a chráni hostiteľa pred infekciou.2,3 Toll-like receptory (TLR) sú dôležitým PRR. môžu iniciovať širokú škálu reakcií od fagocytózy po produkciu cytokínov, čím ďalej posilňujú zápalové a vrodené imunitné reakcie.4 Vo väčšine prípadov TLR signalizujú primárne prostredníctvom MyD88-závislej dráhy, ktorá prenáša signály prostredníctvom kaskádových reakcií na aktiváciu jadrových faktor-kappa B (NF-kB).5 NF-kB je jedným z kľúčových faktorov pri iniciácii vrodenej imunity a je nevyhnutný pre koordináciu zápalovej reakcie, vrodenú imunitu, diferenciáciu buniek, proliferáciu a prežitie a je považovaný za hlavného iniciátora zápalovej reakcie.6 Keď baktérie infikujú hostiteľa, syntetizujú sa následné efektory vrodenej imunitnej reakcie, ako sú cytokíny a chemokíny, čo v konečnom dôsledku vedie k zápalovej reakcii, ktorá blokuje rast baktérií. Avšak v koevolúcii so svojimi hostiteľmi si baktérie tiež vyvinuli rôzne regulačné stratégie, aby sa vyhli a rozvrátili obranu svojho hostiteľa.

Predpokladá sa, že autofágia a apoptóza sú dve dôležité cesty proti bakteriálnej invázii.7 Autofágia je konzervatívny proces, ktorý transportuje abnormálne proteíny do lyzozómov na degradáciu a hrá dôležitú úlohu vo vrodenej imunite eukaryotov proti bakteriálnej invázii.8,9 baktérie sa vyhýbajú imunite pomocou autofágie u cicavcov. Normálne sa bunky snažia odstrániť invázne extracelulárne baktérie a kolonizovať baktérie v cytoplazme prostredníctvom autofágie,10 ale niektoré baktérie dokážu autofágiu „uniesť“ a dokončiť tak svoj rast a reprodukciu.11–13 Napríklad Unc-51-ako kináza 1 (ULK1), Beclin1, microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) a autophagy-related proteins (ATG) spolupracujú pri vytváraní autofagozómov, ktoré enkapsulujú invázne mikroorganizmy a transportujú ich do lyzozómov na degradáciu.14–16 Avšak, Mycobacterium tuberculosis down -reguluje Beclin{18}}, aby zabránil tvorbe autofagozómov, v konečnom dôsledku inhibuje autofágiu a podporuje infekciu.17 Na rozdiel od inhibície tvorby autofagozómov niektoré baktérie používajú autofagozómy na dokončenie sebareplikujúcich miest na podporu proliferácie.11,18 Okrem autofágia, apoptóza je tiež prostriedkom obrany hostiteľa proti inváznym patogénom.7 Apoptóza je vzor bunkovej smrti, ktorý sa používa na odstránenie poškodených buniek, aby sa udržala stabilita systémového prostredia.19 Po prijatí signálu o bakteriálnej invázii hostiteľ indukuje apoptózu infikovaných buniek. bunky na inhibíciu bakteriálnej infekcie.20 Preto úspešná bakteriálna kolonizácia závisí od jej schopnosti zabrániť apoptóze a chrániť replikáciu baktérií. Napríklad Edwardsiella tarda zabezpečuje svoje prežitie inhibíciou apoptózy po infekcii buniek zebrafish ZF4,21Shigella dosahuje úspešnú kolonizáciu inhibíciou apoptózy22 a proteín S produkovaný streptokokom skupiny A (GAS) sa viaže na membránu erytrocytov, aby sa vyhla detekcii imunitného hostiteľa. Aj keď sa dokázalo, že mnohé baktérie vyvinuli schopnosť vyhýbať sa imunite, existuje niekoľko správ o morských patogénoch. Vibrio harveyi patrí do čeľade Vibrionaceae, ktorá je uznávaná ako vysoko patogénny agens morských rýb; spôsobuje gastroenteritídu, svalovú nekrózu a kožné vredy a je jednou z hlavných príčin úhynu morských rýb.24

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

Okrem autofágie a apoptózy môžu niektoré baktérie (napr. Staphylococcus aureus) dokonca využiť chemokínové receptory svojho hostiteľa, aby sa vyhli imunite.25 Chemokínové receptory sú receptory spojené s G proteínom (GPCR), ktoré sa nachádzajú najmä na povrchu leukocytov. Obsahujú sedem transmembránových štruktúr, ktoré sa podieľajú na väzbe ligandu a signalizácii a zohrávajú kľúčovú úlohu pri iniciácii a udržiavaní imunitných a zápalových reakcií.26 Ako výskum chemokínov napredoval, boli objavené atypické chemokínové receptory (ACKR).27 Hoci ACKR sú štrukturálne podobné iným chemokínovým receptorom a môžu internalizovať ligandy, nemôžu aktivovať signálnu transdukčnú dráhu kvôli nedostatku domény DRYLAIV, ktorá sa tiež nazýva „tichý receptor“.28 Funkcia ACKR sa môže prejaviť nasledujúcimi spôsobmi 1. Môžu súťažiť s typickými receptormi o väzbu chemokínu, a tým regulovať signálnu transdukciu bunkovej chemotaxie; 2. Internalizáciou chemokínu do buniek sa zníži koncentrácia chemokínu v prostredí, aby sa ovplyvnilo získavanie buniek a pôsobilo ako vychytávač chemokínov. 3. Pomáhajú chemokínom dokončiť medzibunkový transport cez stromálnu bunkovú bariéru.29 Rodina ACKR zahŕňa najmä DARC,30D6 31,32, CXCR7,33 a CCRL1,34 CCRL1 je tiež známy ako atypický chemokínový receptor 4 (ACKR4). V súčasnosti niektoré štúdie ukázali, že ACKR4 zrejme realizuje signálnu transdukciu cestou nezávislou od G proteínu35–37 a má neredundantné úlohy pri kontrole zápalu a imunitnej odpovede.38 Jeho úloha v adaptívnej imunite je dobre známa, ale jeho funkcia vrodenej imunity sa skúma len zriedka.

Pri vrodenej imunite je signálna transdukcia dráhy TLR vysoko konzervovaná od bezstavovcov po cicavce. Ako hlavný proteín signalizácie TLR bol MyD88 široko študovaný na stavovcoch. Navyše, kvôli vysoko zachovanej štruktúre MyD88 môžu mať jeho homológy u rýb podobné funkcie ako u cicavcov.39,40 U zebričiek sa MyD88 podieľa na odstraňovaní bakteriálnych infekcií.41 Predchádzajúce štúdie tiež potvrdili, že V. harveyi sa vyhýba imunite zničením signálnej transdukcie MyD88.42 Mechanizmy, ako sa V. harveyi vyhýba imunite, však zostávajú u teleostov nedostatočne pochopené. V tejto štúdii bol ACKR4a rýchlo upregulovaný v miichthys muy stimulovanom V. harveyi. Up-regulovaný ACKR4a potláčal vrodenú imunitu indukciou autofágie na blokovanie MyD88-sprostredkovanej NF-kB dráhy a indukciou autofágie na blokovanie apoptózy, aby sa zvýšila infekcia V. harveyi. Podľa našich najlepších vedomostí je táto správa prvou, ktorá objasňuje, že sa zistilo, že V. harveyi využíva autofágiu aj apoptózu na vyhýbanie sa vrodenej imunite.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

VÝSLEDKY

Infekcia V. harveyi indukuje expresiu ACKR4a na podporu vlastnej proliferácie

Aby sme identifikovali gény, ktoré sa potenciálne podieľajú na regulácii infekcie V. harveyi, ošetrili sme krívačky miiuy s V. harveyi počas 48 hodín, potom sme použili analýzu RNA-seq na skríning rôznych expresných génov (DEG) medzi liečenými a neliečenými V. harveyi vzorky sleziny. Z údajov z hlbokého sekvenovania sme identifikovali 145 up-regulovaných génov a 28 0 down-regulovaných génov (obrázok 1A). Na tomto základe sme vybrali 10 najväčších a 10 najmenších stupňov (log2 násobnej zmeny bolo 1,0) na zhlukovanie teplotnej mapy a výsledok ukázal, že príslušné vzorky v ošetrených aj neošetrených vzorkách V. harveyi sa dobre replikovali (obrázok 1B) . ACKR4a mRNA boli skúmané a zistilo sa, že je vysoko exprimovaná v M hudobnom mozgu po infekcii V. harveyi (obrázok S1A). Na následné experimenty sa teda použila línia mozgových buniek M. muiiy (MBrC). Účinnosť knockdown ACKR4a-si1 je 46,1 % a ACKR4a-si2 je 63,7 % v MBrC (obrázok S1B), takže ACKR4a-si2 (nazvaný ACKR4a-si) sa použil na následné experimenty. Následne sme sa zamerali na gén ACKR4a, ktorý môže mať imunitnú funkciu, a výsledky testu jednotiek tvoriacich kolónie (CFU) odhalili, že ACKR4a podporoval proliferáciu V. harveyi (obrázky 1C, 1D a S1C). Na ďalšie skúmanie mechanizmu, ktorým ACKR4a podporuje proliferáciu V. harveyi, sa analyzoval expresný profil ACKR4a. ACKR4a v MBrC bunkách bol regulovaný V. harveyi. Výsledky ukázali časovo závislý spôsob infekcie V. harveyi na úrovni mRNA aj proteínu (obrázky 1E a 1F). Okrem toho umlčanie ACKR4a účinne potlačilo expresiu ACKR4a na úrovni mRNA aj proteínu (obrázky 1E a 1G). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že upregulácia ACKR4a môže uľahčiť infekciu V. harveyi.

Obrázok 1. ACKR4a indukovaný V. harveyi uľahčuje jeho samoproliferáciu

ACKR4a inhibuje NF-kB signalizáciu spustenú V. harveyi 

Zistili sme, že rýchlosť bunkovej proliferácie bola ovplyvnená, keď bol MBrC infikovaný V. harveyi, a na overenie tohto zistenia sme vykonali testy bunkovej proliferácie. Výsledky ukázali, že infekcia V. harveyi znížila proliferáciu MBrC (obrázok S1D). Následné experimenty potvrdili, že nadmerná expresia ACKR4a znížila bunkovú proliferáciu, zatiaľ čo umlčanie ACKR4a zvýšilo bunkovú proliferáciu (obrázok 2A a S1E). Niekoľko štúdií preukázalo, že aktivácia NF-kB podporuje bunkovú proliferáciu. Zistilo sa, že BAY 11–7082, inhibítor NF-kB, môže tiež znížiť proliferáciu MBrC (obrázok 2A a S1E). Podobne ako v predchádzajúcich správach,43 zvýšenie NF-kB-luc bolo spojené s infekciou V. harveyi spôsobom závislým od času (obrázok S1F).

Obrázok 2. ACKR4a inhibuje NF-kB signalizáciu spustenú V. harveyi

Na ďalšie stanovenie účinku ACKR4a na NF-kB signalizáciu spustenú V. harveyi sa uskutočnil luciferázový reportérový test. ACKR4a významne inhiboval aktivitu NF-kB luciferázy spustenú V. harveyi a LPS; Aktivita luciferázy IL-1b a TNFa spúšťaná V. harveyi bola tiež inhibovaná ACKR4a (obrázky 2B–2D). Endogénny ACKR4a bol umlčaný, aby sa potvrdila jeho úloha vo vrodenej imunite. Potom sa ďalej detegovali expresné vzorce p65 a prozápalových cytokínov (IL-1b a TNFa), umlčanie ACKR4a drasticky zvýšilo p65 mRNA, IL{18}}b mRNA a TNFa mRNA (obrázky 2E–2G ). Výsledky v MLC a MKC tiež ukázali, že ACKR4a môže inhibovať signalizáciu NF-kB (obrázky S1G – S1J). Výsledky ELISA boli tiež podobné; Umlčanie ACKR4a významne zvýšilo TNFa a nadmerná expresia ACKR4a inhibovala TNFa (obrázok 2H). Na vyhodnotenie aktivácie NF-kB je potrebnejšie analyzovať transliterovanú formu, ktorou je fosforylovaný NF-kB, a je to miera aktivity NF-kB na cieľové gény. Pri stimulácii NF-kB je p65 fosforylovaný a vstupuje do jadra, aby reguloval transkripciu prozápalových cytokínov. Aby sme preskúmali reguláciu fosforylácie p65 pomocou ACKR4a, zmerali sme hladinu fosforylácie p65 po umlčaní ACKR4a a nadmernej expresii ACKR4a pomocou imunoblotu. Infekcia V. harveyi zvýšila fosforyláciu p65, čo dokázalo, že V. harveyi účinne aktivoval NF-kB. Na tomto základe umlčanie ACKR4a zvýšilo fosforyláciu p65, zatiaľ čo nadmerná expresia ACKR4a znížila fosforyláciu p65, čo naznačuje, že ACKR4a je inhibítorom signalizácie NF-kB (obrázky 2I a 2J). U zebrafish knockdown ACKR4a zvýšil fosforyláciu p65. Okrem toho test CFU ukázal, že BAY 11–7082 významne zvýšil proliferáciu MBrC (obrázok 2K). Celkovo tieto údaje naznačujú, že ACKR4a funguje ako negatívny regulátor signalizácie NF-kB na inhibíciu vrodenej imunity počas infekcie V. harveyi.

Obrázok 3. ACKR4a interaguje s MyD88 a promótormi MyD88 degradácia pri autofágii

ACKR4a interaguje s MyD88 a podporuje MyD88 pre autofagickú degradáciu

Ďalej sme sa snažili určiť, ktorý cieľ v signalizácii NF-kB sprostredkuje supresívnu funkciu ACKR4a0. Test reportéra NF-kB-luciferázy odhalil, že nadmerná expresia ACKR4a spôsobila zníženie luciferázovej aktivity, ktorá bola indukovaná MyD88 spôsobom závislým od dávky (obrázok 3A). Nadmerná expresia ACKR4a však nevykazovala žiadny účinok na luciferázovú aktivitu riadenú TRAF6 alebo TAK1 (obrázky 3B a 3C). Výsledok imunoblotu bol podobný ako pri luciferázovom reportérovom teste; nadmerná expresia ACKR4a inhibovala MyD88 spôsobom závislým od dávky, ale nemal žiadny účinok na TRAF6 a TAK1 (obrázok 3D). Tieto výsledky naznačujú, že ACKR4a funguje na úrovni MyD88.

Všetky cicavčie TLR, okrem TLR3, sú pri prenose signálov aspoň čiastočne závislé od adaptéra MyD88, čo robí priamu reguláciu MyD88 efektívnejšou.44 Potom sme skúmali expresiu MyD88 v rôznych časoch infekcie V. harveyi a zistili sme umlčanie ACKR4a zvýšila expresiu MyD88 (obrázok 3E) a nadmerná expresia ACKR4a inhibovala expresiu MyD88 spôsobom závislým od času (obrázok 3F). Zistil sa zaujímavý výsledok, že hoci umlčanie ACKR4a zvýšilo expresiu MyD88 spustenú V. harveyi, toto zvýšenie nebolo prítomné, keď bunky odpočívali (obrázky 3G a 3H). Aby sme lepšie pochopili molekulárny mechanizmus, ktorý je základom pôsobenia ACKR4a v MyD88-sprostredkovanej signalizácii NF-kB, uskutočnili sme koimunoprecipitačné (Co-IP) testy, aby sme určili, či ACKR4a interaguje s MyD88. Flag-ACKR4a by mohol imunoprecipitovať s Myc-MyD88 (obrázky 3I a S1K). V súlade s tým sme zistili, že Flag-MyD88 by mohol interagovať s endogénnym ACKR4a (obrázok 3J). Následné subcelulárne lokalizačné experimenty ukázali, že ACKR4a nemal žiadnu významnú spoločnú lokalizáciu s MyD88 (obrázok S1L). Tieto zistenia teda podporujú koncepciu, že ACKR4a fyzicky interaguje s MyD88 a ich interakcia sa pravdepodobne vyskytuje v cytoplazme. Ďalej sme skúmali mechanizmus, ktorým ACKR4a potláčal expresiu MyD88. Buď NH4Cl alebo 3-metyladenín (3-MA), inhibítory autofágovo-lyzozómovo závislej degradačnej dráhy, viedli k významnej akumulácii MyD88 v prítomnosti ACKR4a a MG132 neovplyvnil degradáciu MyD88 (obrázok 3K). Okrem toho podobné výsledky ukázali, že 3-MA a NH4Cl významne blokovali degradáciu MyD88 spôsobom závislým od dávky (obrázky 3L a 3M). Zdá sa, že tieto zistenia naznačujú, že blokovanie autofágie účinne zabraňuje degradácii MyD88 zacielenej na ACKR4a. Autofagický tok označuje dynamický proces autofágie, ktorý je spoľahlivým indikátorom autofagickej aktivity. Pretože fluorescencia GFP je v lyzozóme zhášaná, štádium autofágie možno určiť z fluorescencie GFP a RFP.42 Pozorovanie žltej fluorescencie v paneli zlúčenia ukázalo viac červenej fluorescencie v prítomnosti ACKR4a, čo naznačuje, že ACKR4a podporuje fúziu autofagozómy a lyzozómy; zatiaľ čo inhibítor autofágie chlorochín (CQ) zabránil fúzii autofagozómov a lyzozómov, pričom vykazoval väčšiu žltú fluorescenciu (obrázok 3N). Aby sa ďalej potvrdilo, že ACKR4a sa zameriava na MyD88 na autofagickú degradáciu, uskutočnil sa test lyzozomálnej lokalizácie, MyD88 (zelená) a lyzozómy (červená) sa lokalizovali v MBrC bunke (obrázok 30), čo naznačuje, že MyD88 bol transportovaný do lyzozómov. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že ACKR4a interaguje s MyD88 a zameriava sa na MyD88 na autofagickú degradáciu.

Obrázok 4. ACKR4a sa podieľa na regulácii autofágie prostredníctvom Beclina-1

ACKR4a sa podieľa na regulácii autofágie prostredníctvom Beclina-1

Niektoré baktérie využívajú autofágiu na podporu svojho rastu a infekcie, ich replikácia sa zníži, keď autofágia chýba.13 Aby sa otestovalo, či sa V. harveyi podieľa na regulácii autofágie v bunkách MBrC, bunky boli infikované V. harveyi a potom sa vzor expresie LC3. V bunkách MBrC expozícia V. harveyi zvýšila autofágiu, ako naznačuje akumulácia GFP-LC3 puncta, ktorá bola sprevádzaná časovo závislým zvýšením infekcie V. harveyi (obrázok 4A). Nadmerná expresia ACKR4a zosilnila autofágiu indukovanú V. harveyi, ako je znázornené pozoruhodným zvýšením akumulácie bodiek RFP-LC3, na rozdiel od umlčania ACKR4a, ktoré významne znížilo autofágiu indukovanú V. harveyi (obrázky 4B a 4C). Okrem toho umlčanie ACKR4a viedlo k zníženiu expresie LC3-II indukovanej V. harveyi (obrázok 4D).

ULK1, Beclin{1}} a ATG5 boli kľúčové regulačné proteíny autofágie. Výsledky qPCR ukázali, že ACKR4a významne zvýšil expresiu Beclin-1, ale nie ULK1 a ATG5 (obrázok 4E). Test luciferázového reportéra ULK1, ATG5 a Beclin{10}} odhalil, že nadmerná expresia ACKR4a spôsobila iba zvýšenie aktivity Beclin{12}}luciferázy (obrázok 4F). Ďalej sme zistili, že nadmerná expresia ACKR4a zvýšila expresiu Beclin-1, ale nie ULK1 a ATG5 (obrázok 4G). Autofágia indukovaná ACKR4a bola tiež inhibovaná Beclin-1-si, zatiaľ čo ATG5-si mala iba čiastočnú inhibíciu (obrázok 4H). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že ACKR4a bol zacielený na Beclin-1. Preto sa skúmala funkcia a mechanizmus Beclin{26}} pri autofagickej degradácii MyD88 sprostredkovanej ACKR4a. U zebričiek infikovaných V. harveyi knockdown ACKR4a neviedol k významným zmenám v ULK1, pričom významne znížil Beclin-1 a ATG5 (obrázky S2B–S2D). Beclin-1 ďalej zosilnil autofagický tok indukovaný ACKR4a ošetrením Baf1A a CQ (obrázok 4I) a Beclin{41}} zvýšil degradáciu MyD88 pomocou ACKR4a (obrázok 4J). Potom sme vykonali testy Co-IP, aby sme určili, či ACKR4a interaguje s Beclinom-1, a zistili sme, že ACKR4a interaguje s Beclinom-1 a infekcia V. harveyi zvýšila interakciu medzi ACKR4a a Beclinom{{51 }} (obrázok 4K). Test lyzozomálnej lokalizácie ukázal, že ACKR4a zosilnil fúziu autofagozómov s lyzozómom (obrázok 4L). Následne ACKR4a zvyšuje endogénnu expresiu Beclin{56}} (obrázok 4M) a umlčanie ACKR4a zoslabuje expresiu Beclin-1 indukovanú V. harveyi (obrázok 4N). Okrem toho umlčanie Beclin-1 zvýšilo fosforyláciu p65 spúšťanú V. harveyi, čo ďalej naznačuje, že V. harveyi indukuje autofágiu, aby negatívne regulovala signalizáciu NF-kB (obrázok 40). Ďalej sme sa snažili určiť biologický význam Beclina-1 pri infekcii V. harveyi, najmä pri kontrole proliferácie V. harveyi. Uskutočnil sa test CFU a zistilo sa, že umlčanie Beclin{67}} aj autofágia blokovaná CQ znížili proliferáciu V. harveyi, čo dokazuje, že V. harveyi využíva autofágiu na podporu svojej proliferácie (obrázok 4P). Vyššie uvedené výsledky spolu odhaľujú, že ACKR4a indukuje a vytvára komplexy s Beclinom-1 na podporu autofágie a potom uľahčuje infekciu V. harveyi.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ACKR4a indukoval autofágiu na blokovanú apoptózu

Autofagická bunková smrť sa považuje za rozumnú alternatívu k apoptóze a apoptóza je tiež uznávaným antibakteriálnym mechanizmom; úspešné bakteriálne infekcie dokončia samoreplikáciu inhibíciou apoptózy.22 Na určenie vzťahu medzi autofágiou vyvolanou V. harveyi a apoptózou sa stanovila apoptóza buniek MBrC s rôznymi liečbami pred a po infekcii V. harveyi a umlčanie ACKR4a zvýšilo V. harveyi-indukovaná apoptóza (obrázky 5A a 5B, ľavý panel). Pretože kaspáza3 a kaspáza7 sú dôležité pri iniciácii apoptózy, sú široko akceptované ako spoľahlivé indikátory apoptózy. Test kaspázy Glo 3/7 ukázal, že nadmerná expresia ACKR4a inhibovala aktivitu kaspázy 3/7 indukovanú V. harveyi, zatiaľ čo umlčanie ACKR4a zvýšilo aktivitu kaspázy 3/7 indukovanú V. harveyi (obrázok 5B, pravý panel). V. harveyi a exogénne pridaná rekombinantná aktívna kaspáza8 indukovaná aktivita kaspázy 3/7 bola inhibovaná ACKR4a (obrázok 5C), čo naznačuje, že ACKR4a je schopný účinne blokovať signalizáciu apoptózy. Aj keď bola preukázaná autofágia indukovaná ACKR4a, sú potrebné ďalšie štúdie na preskúmanie úlohy autofágie pri blokovaní apoptózy. Ako je znázornené na obrázku 5D, umlčanie ACKR4a významne zvýšilo efektorové kaspázy (kaspáza7) a iniciačné kaspázy (kaspáza8). Okrem toho nadmerná expresia ACKR4a inhibovala mRNA kaspázy7 a kaspázy8 (obrázok 5E) a knockdown ACKR4a významne zvýšil kaspázu7 a kaspázu8 u zebrafish (obrázky S2E a S2F). Predchádzajúce štúdie ukázali, že Beclin{41}} je molekulárny prepínač, ktorý sprostredkováva procesy apoptózy a autofágie,45 preto sa skúmalo zapojenie Beclina{43}} do regulácie apoptózy. V našej štúdii nadmerná expresia Beclin{44}} znížila kaspázu indukovanú V. harveyi8, zatiaľ čo Beclin-1 umlčala upregulovanú kaspázu indukovanú V. harveyi8 (obrázok 5F). Zistil sa zaujímavý výsledok, že kaspáza8 bola významne upregulovaná po 3 hodinách infekcie V. harveyi; bol opäť inhibovaný so zvyšujúcim sa trvaním infekcie a LC3-II negatívne koreloval s kaspázou8 (obrázok 5G). Podľa vyššie uvedených výsledkov ACKR4a indukoval autofágiu na blokovanie apoptotickej signalizácie a uľahčenie infekcie V. harveyi a Beclin-1 môže byť potenciálnym cieľom v kaskáde autofágie a apoptózy.

Obrázok 5. ACKR4a indukuje autofágiu na blokovanie apoptózy

Ap-1 zvyšuje autofágiu indukovanú ACKR4a pri infekcii V. harveyi

Následne sa skúmal mechanizmus expresie ACKR4a indukovanej infekciou V. harveyi. Najprv sa skonštruovali štyri rôzne ACKR4a promótorové plazmidy podľa promótorových predikčných sekvencií (obrázok 6A). Luciferázový test ukázal, že aktivita ACKR4a-p-3 bola najvyššia (obrázok 6B). Na identifikáciu upstream aktivátora expresie ACKR4a počas infekcie V. harveyi sa analyzovala promótorová oblasť ACKR4a a zistilo sa, že ACKR4a má potenciálne väzbové miesta Sp{11}} a Ap{12}} (obrázok 6C). Test ACKR4a-luc ukázal, že Sp-1 nemohol zvýšiť aktivitu luciferázy a Ap{17}} zvýšil aktivitu luciferázy (obrázky 6D a 6E), čo zvýšilo možnosť, že ACKR4a by mohol byť priamym cieľom Ap -1. Na preskúmanie sa skonštruovali dva luciferázové vektory pozostávajúce z mutantného ACKR4a (obrázok 6F). Luciferázový test ukázal, že mutanty bez väzbových miest Ap{24}} inhibovali luciferázovú aktivitu na rozdiel od divokého typu (obrázok 6G). Aby sme potvrdili, že Ap-1 podporuje expresiu ACKR4a, umlčali sme alebo zvýšili expresiu Ap-1 prostredníctvom nadmernej expresie alebo knockdownu a expresia ACKR4a sa hodnotila v transfekovaných MbrC bunkách. Umlčanie Ap-1 významne znížilo expresiu ACKR4a indukovanú V. harveyi (obrázok 6H), zatiaľ čo nadmerná expresia Ap-1 významne zvýšila expresiu ACKR4a (obrázok 6I). Výsledky imunoblotu boli v súlade s výsledkami qPCR, nadmerná expresia Ap-1 zvýšila expresiu ACKR4a, zatiaľ čo umlčanie Ap{40}} znížilo expresiu ACKR4a (obrázok 6J). Analýza ChIP ukázala, že Ap-1 sa za normálnych fyziologických podmienok viaže na promótor ACKR4a v bunkách MBrC a stimulácia V. harveyi zvýšila väzbu Ap-1 na promótor ACKR4a (obrázok 6K). Vyššie uvedené výsledky potvrdili, že ACKR4a je potenciálnym transkripčným cieľom Ap-1. Potom sa skúmala funkcia Ap{50}} v autofágii; Umlčanie Ap{51}} účinne znížilo akumuláciu GFP-LC3 vyvolanú infekciou V. harveyi (obrázok 6L) a tiež zoslabilo infekciou V. harveyi indukovanú upreguláciu LC3-II (obrázok 6M ). Test CFU sa uskutočnil na preskúmanie úlohy Ap-1 pri infekcii V. harveyi a zistilo sa, že AP-1 uľahčuje proliferáciu V. harveyi (obrázok 6N). Celkovo vyššie uvedené výsledky naznačujú, že Ap-1 aktivuje transkripciu a expresiu ACKR4a a prispieva k infekcii V. harveyi.

Obrázok 6. Ap-1 zosilnená autofágia indukovaná ACKR4a pri infekcii V. harveyi

Obrázok 7. Pracovný model toho, ako ACKR4a uľahčuje infekciu V. harveyi

DISKUSIA

Ukázalo sa, že ACKR sa podieľajú na niekoľkých biologických procesoch, ako je regulácia chemokínového systému, internalizácia chemokínového ligandu, intracelulárna degradácia a zápalová odpoveď,4,26 ktorá je dôležitá nielen pre adaptívnu imunitu, ale aj ako dôležitá zložka vrodeného imunitného systému. .33,34 Úloha ACKR v zápalovej odpovedi na bakteriálnu infekciu u rýb však nebola skúmaná. Táto štúdia po prvýkrát demonštruje, že ACKR4a, člen rodiny ACKR, podporuje infekciu V. harveyi na teleost ryby prostredníctvom autofágie a apoptózy. Mechanicky bola transkripcia ACKR4a up-regulovaná transkripčným faktorom AP-1. Potom sa upregulovaný ACKR4a synergizoval s Beclinom{10}} na vyvolanie autofágie a transportoval MyD88 do lyzozómov na degradáciu. Medzitým ACKR4a indukuje autofágiu na blokovanie apoptózy a potom uľahčuje infekciu V. harveyi (obrázok 7). Vrodená imunita hrá kľúčovú úlohu pri ochrane eukaryotov pred endogénnou a exogénnou patogénnou inváziou.46 V dôsledku dlhodobého vystavenia mikroorganizmom si ryby vyvinuli optimalizovanejšiu vrodenú imunitu, ktorá ich chráni pred infekciou.47 TLR rozpoznali PAMP, keď sa vyskytne bakteriálna infekcia, a iniciovali vrodenú imunitnú odpoveď prostredníctvom MyD88-závislých a nezávislých dráh, ktoré vyvolali produkciu prozápalových cytokínov na odstránenie bakteriálnej infekcie. MyD88 je nevyhnutný adaptér v signalizácii TLR, s výnimkou TLR3, všetky cicavčie TLR využívajú MyD88 na aktiváciu signalizácie NF-kB.48 Preto môže byť najúčinnejšie priamo regulovať MyD88. Napríklad S-1-acetylcysteín inhibuje produkciu IL-6 indukciou degradácie MyD88. Podobne u rýb sa uvádza, že IRF3 a eIF3k inhibujú signalizáciu NF-kB zacielením na MyD88.42,49 Nahromadené dôkazy tiež naznačujú, že MyD88 bol dôležitý na elimináciu bakteriálnych infekcií. Napríklad MyD88-deficientné myši nedokázali rozpoznať bakteriálne zložky a boli vysoko citlivé na S. aureus. 50 Okrem toho sa ukázalo, že MyD88 sa podieľa aj na eliminácii bakteriálnych infekcií u zebričiek.41 Aktivácia vrodeného imunitného systému podporuje odstraňovanie baktérií, čo predstavuje hlavný selektívny tlak, podporuje ich rozvoj schopnosti potlačiť vrodenú imunitu. 51,52 Ukázalo sa, že salmonela môže regulovať imunitné reakcie a manipulovať so zápalovými reakciami po infikovaní hostiteľských buniek. Virulencia salmonely SpvC ireverzibilne defosforyluje ERK, p38 a MAPK, čím inhibuje transkripciu prozápalových cytokínov.53 V tejto štúdii sa upregulovaný ACKR4a v M. miiuy infikovanom V. harveyi skombinoval s MyD88, aby sa inhibovala fosforylácia p65. a blokovať NF-kB signalizáciu. To naznačuje, že baktérie môžu tiež potlačiť vrodenú imunitu rýb tým, že interferujú so stabilitou adaptérov v signalizácii TLR za účelom imunitného úniku.

Autofágia a apoptóza sú dva uznávané mechanizmy rezistencie voči bakteriálnej invázii, pričom antimikrobiálna autofágia je bariérou proti invázii mikroorganizmov. PRR môžu indukovať autofágiu v rôznych štádiách kontaktu hostiteľ-baktéria a inhibovať vnútrobunkový rast baktérií.54 Naopak, baktérie si tiež vyvinuli účinné mechanizmy na prevenciu, boj alebo príkaz na autofágiu. Tieto mechanizmy často zahŕňajú zacielenie na Beclin-1, aby sa zablokovala autofágia,55 čo bráni dozrievaniu autofagozómov56 a v niektorých prípadoch dokonca aktivuje autofágiu na zabezpečenie výživy pre rast baktérií.57 Na rozdiel od toho sme zistili, že V. harveyi indukoval Beclin{{6} } aktivovaná autofágia prostredníctvom ACKR4a, ktorá sa zameriava na MyD88 na autofagickú degradáciu, čím blokuje signalizáciu NF-kB a podporuje samoreplikáciu. Ďalšou obrannou stratégiou je programovaná bunková smrť (apoptóza), ktorá sa aktivuje, keď patogény využívajú hostiteľské bunky na prežitie a replikáciu. Napríklad mykobakteriálna infekcia makrofágov spôsobuje apoptózu, ktorá prispieva k eliminácii baktérií z buniek.58 Okrem toho apoptóza makrofágov sprostredkovaná TNF-a ničí vnútrobunkové prostredie pre replikáciu mykobaktérií a znižuje rýchlosť rastu infikovaných mykobaktérií. tlak na prežitie pri apoptóze, mnohé úspešné patogény kódujú gény, ktorých produkty inhibujú apoptózu v hostiteľských bunkách, čím si zachovávajú životaschopnosť pre replikáciu patogénov.60 Hoci tieto mechanizmy boli dobre študované u cicavcov, o bakteriálnej inhibícii apoptózy u rýb sa vie len málo. V našej štúdii hrá autofágia vyvolaná V. harveyi úlohu v apoptotických štádiách a blokuje apoptotickú signalizáciu. Apoptóza a autofágia sa navzájom podporujú a antagonizujú. V preapoptotických štádiách bunky blokujú apoptotickú dráhu a znižujú úroveň apoptózy prostredníctvom autofágie, čím si zachovávajú výhodu. Autofágia nespúšťa bunkovú smrť v skorých štádiách apoptózy, ale tiež podporuje prežitie buniek.61 Autofágia počas neskorého štádia apoptózy môže podporovať apoptózu a potom zvýšená apoptóza inhibuje výskyt autofágie prostredníctvom migrácie dráh p53 a BH3.62 Biologický proces je prísne regulovaný, vrátane interakcie autofágie a apoptózy. Na mechanizme interaktívnej odozvy apoptózy a autofágie sa podieľa množstvo regulačných génov, pričom Beclin{22}} je jedným z nich.63 Okrem regulácie iniciácie autofágie sa Beclin{24}} podieľa aj na regulácii apoptózy.45 ,64 Štúdie ukázali, že Beclin{27}} stráca svoju schopnosť odolávať apoptóze po štiepení aktivovanými kaspázami.65 To naznačuje, že Beclin{29}} hrá dôležitú úlohu ako „molekulový prepínač“ v regulácii autofágie a apoptózy.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

V. harveyi je morská gramnegatívna baktéria, ktorá predstavuje vážnu hrozbu pre zdravie morských akvakultúrnych rybolovov. Infekcia V. harveyi spôsobuje meningitídu a encefalitídu u rýb66 a infekcia V. harveyi spôsobuje cerebrálnu kongesciu u kanice.67 V reakcii na bakteriálnu infekciu sú vrodené imunitné a zápalové reakcie hlavným obranným systémom rýb. Baktérie si však tiež vyvinuli schopnosť vyhýbať sa imunite v symbióze so svojimi hostiteľmi. Stručne povedané, naše výsledky odhaľujú mechanizmus imunitného úniku V. harveyi u rýb. ACKR4a indukuje autofágiu, aby inhibovala signalizáciu NF-kB a blokovala apoptózu, čo zase uľahčuje infekciu V. harveyi u teleost rýb. Toto je tiež prvýkrát, čo sa zistilo, že gramnegatívne baktérie sa vyhýbajú imunite simultánnou reguláciou vrodenej imunity a apoptózy prostredníctvom autofágie. Táto štúdia poskytuje pohľad na pochopenie účinkov autofágie na interakciu hostiteľ-baktéria u teleost rýb a poskytuje pohľad na odolnosť cicavcov voči bakteriálnej infekcii.

LITERATÚRA

1. Dinarello, CA (2018). Prehľad rodiny IL-1 pri vrodenom zápale a získanej imunite. Immunol. 281, 8–27.

2. Gaidt, MM, Ebert, TS, Chauhan, D., Ramshorn, K., Pinci, F., Zuber, S., O'Duill, F., Schmid-Burgk, JL, Hoss, F., Buhmann, R., a kol. (2017). Inflammasóm DNA v ľudských myeloidných bunkách je iniciovaný programom smrti STING-buniek pred NLRP3. Cela 171, 1110–1124.e18.

3. Xiao, TS (2017). Vrodená imunita a zápal. Bunka. Mol. Immunol. 14, 1–3.

4. Koropatnick, TA, Engle, JT, Apicella, MA, Stabb, EV, Goldman, WE a McFallNgai, MJ (2004). Vývoj sprostredkovaný mikrobiálnym faktorom v vzájomnom vzťahu hostiteľ-baktéria. Science 306, 1186–1188.

5. Janeway, CA (1989). Blíži sa k asymptote? Evolúcia a revolúcia v imunológii. Cold Spring Harb. Symp. Kvant. Biol. 54, 1-13.

6. Vallabhapurapu, S. a Karin, M. (2009). Regulácia a funkcia transkripčných faktorov NF-kB v imunitnom systéme. Annu. Rev. Immunol. 27, 693-733.

7. Krakauer, T. (2019). Zápaly, autofágia a bunková smrť: trojica vrodenej obrany hostiteľa proti intracelulárnym baktériám. Mediátory zápalu. 2019, 2471215.

8. Hurley, JH, a Young, LN (2017). Mechanizmy iniciácie autofágie. Annu. Biochem. 86, 225–244.

9. He, X., Zhu, Y., Zhang, Y., Geng, Y., Gong, J., Geng, J., Zhang, P., Zhang, X., Liu, N., Peng, Y ., a kol. (2019). RNF34 funguje v imunite a selektívnej mitofágii zacielením MAVS na autofagickú degradáciu. EMBO J. 38, 1009788–e101018.

10. Yin, L., Lv, M., Qiu, X., Wang, X., Zhang, A., Yang, K. a Zhou, H. (2021). IFN-G manipuluje NOD1-sprostredkovanú interakciu autofágie a Edwardsiella piscicida na zvýšenie intracelulárneho klírensu u rýb. J. Immunol. 207, 1087-1098.

11. Mansilla-Pareja, ME, Bongiovanni, A., Lafont, F. a Colombo, MI (2017). Zmeny replikačnej membrány vakuol Coxiella burnetii a súhra s autofágovou dráhou. Predné. Bunka. Infikovať. Microbiol. 7, 112.

12. Bravo-Santano, N., Ellis, JK, Mateos, LM, Calle, Y., Keun, HC, Behrends, V. a Letek, M. (2018). Intracelulárny Staphylococcus aureus moduluje centrálny metabolizmus uhlíka hostiteľa, aby aktivoval autofágiu. mSphere 3, 003744– 003818.

13. Winchell, CG, Dragan, AL, Brann, KR, Onyilagha, FI, Kurten, RC a Voth, DE (2018). Coxiella burnetii podvracia p62 / sekvemozóm 1 a aktivuje signalizáciu Nrf2 v ľudských makrofágoch. Infikovať. Immun. 86, e00608–e00617.

14. Lee, HK, Lund, JM, Ramanathan, B., Mizushima, N. a Iwasaki, A. (2007). Vírusové rozpoznávanie plazmacytoidnými dendritickými bunkami závislé od autofágie. Veda 315, 1398–1401.

15. Jounai, N., Takeshita, F., Kobiyama, K., Sawano, A., Miyawaki, A., Xin, KQ, Ishii, KJ, Kawai, T., Akira, S., Suzuki, K., a Okuda, K. (2007). Konjugát Atg5 Atg12 je spojený s vrodenými antivírusovými imunitnými odpoveďami. Proc. Natl. Akad. Sci. USA. 104, 14050–14055.

16. Schaaf, MBE, Keulers, TG, Vooijs, MA a Rouschop, KMA (2016). Proteíny rodiny LC3/GABARAP: funkcie (ne)súvisiace s autofágiou. FASEB J 30, 3961-3978.

17. Chen, Z., Wang, T., Liu, Z., Zhang, G., Wang, J., Feng, S. a Liang, J. (2015). Inhibícia autofágie pomocou MiR-30A indukovanej Mycobacteria tuberculosis ako možný mechanizmus imunitného úniku v ľudských makrofágoch. Jpn. J. Infect. Dis. 68, 420-424.

18. Kubori, T., Bui, XT, Hubber, A. a Nagai, H. (2017). Legionella RavZ hrá úlohu pri prevencii náboru ubikvitínu do vakuol obsahujúcich baktérie. Predné. Bunka. Infikovať. Microbiol. 7, 384.

19. Danial, NN a Korsmeyer, SJ (2004). Bunková smrť: kritické kontrolné body. Cela 116, 205–219.

20. Salvesen, GS a Ashkenazi, A. (2011). Snímka: kaspázy. Bunka 147, 476–476.e1.

21. Zhou, ZJ, and Sun, L. (2016). Edwardsiella tarda indukovaná inhibícia apoptózy: stratégia pre intracelulárne prežitie. Predné. Bunka. Infikovať. Microbiol. 6, 76.

22. Gunther, SD, Fritsch, M., Seeger, JM, Schiffmann, LM, Snipas, SJ, Coutelle, M., Kufer, TA, Higgins, PG, Hornung, V., Bernardini, ML, a kol. (2020). Cytosolické gramnegatívne baktérie zabraňujú apoptóze inhibíciou efektorových kaspáz prostredníctvom lipopolysacharidu. Nat. Microbiol. 5, 354-367.

23. Wierzbicki, IH, Campeau, A., Dehaini, D., Holay, M., Wei, X., Greene, T., Ying, M., Sands, JS, Lamsa, A., Zuniga, E., a kol. (2019). Streptokokový proteín S skupiny A využíva červené krvinky ako imunitnú kamufláž a je kritickým determinantom imunitného úniku. Cell Rep. 29, 2979-2989.e15.

24. Chen, J., Lu, Y., Ye, X., Emam, M., Zhang, H., and Wang, H. (2000). Súčasný pokrok v snímaní kvóra Vibrio harveyi ako cieľov objavovania liekov. Eur. J. Med. Chem. 207, 112741.

25. Kimura, T., Jain, A., Choi, SW, Mandell, MA, Schroder, K., Johansen, T. a Deretic, V. (2015). Presná autofágia sprostredkovaná TRIM sa zameriava na cytoplazmatické regulátory vrodenej imunity. J. Cell Biol. 210, 973-989.

26. Zlotnik, A., and Yoshie, O. (2012). Nadrodina chemokínov bola znovu navštívená. Imunita 36, ​​705–716.

27. Ulvmar, MH, Hub, E. a Rot, A. (2011). Atypické chemokínové receptory. Exp. Cell Res. 317, 556-568.

28. Bonecchi, R., Savino, B., Borroni, EM, Mantovani, A. a Locati, M. (2010). Chemokínové návnady: štruktúra, funkcia a biologické vlastnosti. Curr. Hore. Microbiol. Immunol. 341, 15–36.

29. Comerford, I., Litchfield, W., Harata-Lee, Y., Nibbs, RJB a McColl, SR (2007). Regulácia chemotaktických sietí „atypickými“ receptormi. Bioessays 29, 237-247.

30. Horuk, R., Chitnis, CE, Darbonne, WC, Colby, TJ, Rybicki, A., Hadley, TJ a Miller, LH (1993). Receptor pre malarického parazita Plasmodium vivax: chemokínový receptor erytrocytov. Science 261, 1182–1184.

31. Bonini, JA, Martin, SK, Dralyuk, F., Roe, MW, Philipson, LH a Steiner, DF (1997). Klonovanie, expresia a chromozomálne mapovanie nového ľudského CC-chemokínového receptora (CCR10), ktorý vykazuje vysokoafinitnú väzbu pre MCP-1 a MCP-3. DNA Cell Biol. 16, 1249-1256.

32. Nibbs, RJ, Wylie, SM, Yang, J., Landau, NR, a Graham, GJ (1997). Klonovanie a charakterizácia nového promiskuitného ľudského beta-chemokínového receptora D6. J. Biol. Chem. 272, 32078–32083.

33. Burns, JM, Summers, BC, Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, MET, Sunshine, MJ, Littman, DR, Kuo, CJ, a kol. (2006). Nový chemokínový receptor pre SDF-1 a I-TAC sa podieľa na prežití buniek, bunkovej adhézii a vývoji nádoru. J. Exp. Med. 203, 2201–2213.

34. Gosling, J., Dairaghi, DJ, Wang, Y., Hanley, M., Talbot, D., Miao, Z. a Schall, TJ (2000). Špičková hrana: identifikácia nového chemokínového receptora, ktorý viaže chemokíny aktívne v dendritických bunkách a T bunkách vrátane ELC, SLC a TECK. J. Immunol. 164, 2851–2856.

35. Hall, RA, Premont, RT a Lefkowitz, RJ (1999). Heptahelická receptorová signalizácia: mimo paradigmy G proteínu. J. Cell Biol. 145, 927-932.

36. Brzostowski, JA, a Kimmel, AR (2001). Signalizácia pri nule G: funkcie nezávislé od G-proteínu pre 7-TM receptory. Trends Biochem. Sci. 26, 291-297.

37. Sun, Y., Huang, J., Xiang, Y., Bastepe, M., Ju¨ppner, H., Kobilka, BK, Zhang, JJ, and Huang, XY (2007). Od dávky závislý prechod zo signalizácie spojenej s G proteínom na signalizáciu nezávislú od G proteínu pomocou GPCR. EMBO J. 26, 53–64.

38. Nibbs, RJB a Graham, GJ (2013). Imunitná regulácia atypickými chemokínovými receptormi. Nat. Rev. Immunol. 13, 815-829.

39. Lewis, BP, Burge, CB a Bartel, DP (2005). Konzervované párovanie semien, často lemované adenozínmi, naznačuje, že tisíce ľudských génov sú ciele mikroRNA. Cela 120, 15–20.

40. Friedman, RC, Farh, KKH, Burge, CB a Bartel, DP (2009). Väčšina cicavčích mRNA sú konzervované ciele mikroRNA. Genome Res. 19, 92-105.

41. Denli, AM, Tops, BBJ, Plasterk, RHA, Ketting, RF a Hannon, GJ (2004). Spracovanie primárnych mikroRNA komplexom mikroprocesorov. Príroda 432, 231–235.

42. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y., and Xu, T. (2022). eIF3k inhibuje signalizáciu NF-kB zacielením na MyD88 na autofagickú degradáciu sprostredkovanú ATG5- u teleost rýb. J. Biol. Chem. 298, 101730.

43. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. a Xu, T. (2017). Indukovateľná mikroRNA-214 prispieva k potlačeniu zápalovej reakcie sprostredkovanej NF-kB prostredníctvom zacielenia na gén myd88 u rýb. J. Biol. Chem. 292, 5282-5290.

44. Gay, NJ, Symmons, MF, Gangloff, M. a Bryant, CE (2014). Zostavenie a lokalizácia signálnych komplexov Toll-like receptorov. Nat. Rev. Immunol. 14, 546-558.

45. McKnight, NC a Zhenyu, Y. (2013). Beclin 1 je základnou zložkou a hlavným regulátorom PI3K-III v zdraví a chorobe. Curr. Pathobiol. Rep. 1, 231–238.

46. ​​Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M. a Babiuk, LA (2007). Vrodená imunita a nové adjuvans. Sci. Tech. 26, 147-156.

47. Buchmann, K. (2014). Evolúcia vrodenej imunity: stopy od bezstavovcov cez ryby po cicavce. Predné. Immunol. 5,459.

48. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. a Xu, T. (2017b). MicroRNA-3570 moduluje dráhu NF-kB v teleostových rybách zacielením na MyD88. J. Immunol. 198, 3274-3282.

49. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. a Xu, T. (2020). IRF3 a IRF8 regulujú signalizáciu NF-kB zacielením na MyD88 v teleostových rybách. Predné. Immunol. 11, 606.

50. Takeuchi, O., Hoshino, K. a Akira, S. (2000). Najmodernejšie: Myši s2-deficientným TLR a MyD{3}}deficientným sú veľmi náchylné na infekciu Staphylococcus aureus. J. Immunol. 165, 5392-5396.

51. Keszei, AFA, Tang, X., McCormick, C., Zeqiraj, E., Rohde, JR, Tyers, M. a Sicheri, F. (2014). Štruktúra komplexu SspH1-PKN1 odhaľuje základ pre rozpoznávanie hostiteľského substrátu a mechanizmus aktivácie pre bakteriálnu E3 ubikvitín ligázu. Mol. Cell Biol. 34, 362-373.

52. Gu¨nster, RA, Matthews, SA, Holden, DW a Thurston, TLM (2017). Efektory sekrečného systému SseK1 a SseK3 typu III inhibujú signalizáciu NFkB a nekroptickú bunkovú smrť v makrofágoch infikovaných salmonelou. Infikovať. Immun. 85, e00010–e00017.

53. Mazurkiewicz, P., Thomas, J., Thompson, JA, Liu, M., Arbibe, L., Sansonetti, P. a Holden, DW (2008). SpvC je Salmonella efektor s fosfotreonín lyázovou aktivitou na hostiteľských mitogénom aktivovaných proteínových kinázach. Mol. Microbiol. 67, 1371–1383.

54. Saitoh, T. a Akira, S. (2010). Regulácia vrodených imunitných reakcií proteínmi súvisiacimi s autofágiou. J. Cell Biol. 189, 925-935.

55. Orvedahl, A., Alexander, D., Tallo'czy, Z., Sun, Q., Wei, Y., Zhang, W., Burns, D., Leib, DA a Levine, B. (2007 ). HSV-1 ICP34.5 poskytuje neurovirulenciu zacielením na autofágový proteín Beclin 1. Bunkový hostiteľský mikrób 1, 23–35.

56. Kyei, GB, Dinkins, C., Davis, AS, Roberts, E., Singh, SB, Dong, C., Wu, L., Kominami, E., Ueno, T., Yamamoto, A., et al. (2009). Autofágová dráha sa pretína s biosyntézou HIV-1 a reguluje výťažky vírusov v makrofágoch. J. Cell Biol. 186, 255-268.

57. Niu, H., Xiong, Q., Yamamoto, A., Hayashi Nishino, M. a Rikihisa, Y. (2012). Autofagozómy indukované bakteriálnym Beclin 1 väzbovým proteínom uľahčujú povinnú intracelulárnu infekciu. Proc. Natl. Akad. Sci. USA. 109, 20800–20807.

58. Hussain, MA, Datta, D., Singh, R., Kumar, M., Kumar, J. a Mazumder, S. (2019). TLR-2 sprostredkovaný cytozolický-Ca2+ nárast aktivuje ER stres-superoxid-NO signálozóm zvyšujúci produkciu TNF-a, čo vedie k apoptóze makrofágov rýb infikovaných Mycobacterium smegmatis. Sci. Rep. 9, 12330.

59. Lee, J., Hartman, M. a Kornfeld, H. (2009). Apoptóza makrofágov pri tuberkulóze. Yonsei Med. J. 50, 1-11.

60. McCormick, AL (2008). Kontrola apoptózy ľudským cytomegalovírusom. Curr. Hore. Microbiol. Immunol. 325, 281-295.

61. Kuma, A., Hatano, M., Matsui, M., Yamamoto, A., Nakaya, H., Yoshimori, T., Ohsumi, Y., Tokuhisa, T., and Mizushima, N. (2004) . Úloha autofágie počas skorého obdobia novorodeneckého hladovania. Príroda 432, 1032–1036.

62. Marin˜ o, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, EH a Kroemer, G. (2014). Vlastná konzumácia: súhra autofágie a apoptózy. Nat. Mol. Cell Biol. 15, 81-94.

63. Furuya, D., Tsuji, N., Yagihashi, A. a Watanabe, N. (2005). Beclin-1 zosilnil apoptózu indukovanú cis-diamindichlórplatinou zvýšením aktivity kaspázy 9. Exp. Cell Res. 307, 26-40.

64. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, XH, Mizushima, N., Packer, M., Schneider, MD, and Levine, B. (2005). Bcl-2 antiapoptotické proteíny inhibujú Beclinovu 1-závislú autofágiu. Cela 122, 927-939.

65. Djavaheri-Mergny, M., Maiuri, MC a Kroemer, G. (2010). Cross-talk medzi apoptózou a autofágiou kaspázou sprostredkovaným štiepením Beclin 1. Oncogene 29, 1717–1719.

66. Grimes, DJ, Gruber, SH a May, EB (1985). Experimentálna infekcia citrónových žralokov, Negaprion brevirostris (Poey), druhmi Vibrio. J. Fish. Dis. 8, 173-180.

67. Mohamad, N., Mohd Roseli, FA, Azmai, MNA, Saad, MZ, Md Yasin, IS, Zulkiply, NA a Nasruddin, NS (2019). Prirodzená súbežná infekcia Vibrio harveyi a V. alginolyticus u kultivovaných hybridných kaníc v Malajzii. J. Aquat. Anim. Zdravie 31, 88–96.