Akteozid ako potenciálna terapeutická možnosť pre primárny hepatocelulárny karcinóm: Predklinická štúdia

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen a Zhiyong Wang

Abstraktné

Východiská: Hepatocelulárny karcinóm (HCC) je bežný malígny nádor s charakteristikami zlej prognózy, vysokej morbidity a mortality na celom svete. Najmä pre pokročilých pacientov s HCC je k dispozícii len niekoľko možností systémovej liečby a zahŕňajú sorafenib a nedávno opísaný režim atezolizumab plus bevacizumab ako možné liečby prvej línie. Tu navrhujeme akteozid, fenyletanoidný glykozid široko distribuovaný v mnohých liečivých rastlinách ako potenciálneho kandidáta proti pokročilému HCC.

Metódy: Bunková proliferácia, tvorba kolónií a migrácia boli analyzované v troch ľudských HCC bunkových líniách BEL7404, HLF a JHH-7. Skúška angiogenézy sa uskutočnila s použitím HUVES. Model nahých myší s xenoštepom BEL7404 alebo JHH-7 bol vytvorený na analýzu možných protinádorových účinkov akteozidu. Na odhalenie potenciálnych protinádorových mechanizmov akteozidu sa použili qRT-PCR a western blotting.

Výsledky:Akteozid z cistancheinhibovala bunkovú proliferáciu, tvorbu kolónií a migráciu vo všetkých troch ľudských HCC bunkových líniách BEL7404, HLF a JHH-7. Zákaz angiogenézy akteozidom bol odhalený inhibíciou tvorby trubíc a migrácie buniek HUVEC. Kombinácia akteozidu a sorafenibu vyvolala silnejšiu inhibíciu tvorby bunkových kolónií a migrácie buniek HCC, ako aj angiogenézu HUVEC. In vivo protinádorová účinnosť akteozidu sa ďalej demonštrovala na modeli nahých myší s xenoštepom BEL7404 alebo JHH-7, pričom v kombinácii so sorafenibom došlo k zvýšeniu inhibície rastu xenoštepu JHH-7. Ďalšie ošetrenie buniek JHH-7 akteozidom odhalilo zvýšenie hladiny tumor-supresorového proteínu p53, ako aj zníženie hladiny génu peptidázy súvisiacej s kalikreínom (KLK1, 2, 4, 9 a 10) bez signifikantného zmeny zvyšku génov KLK1–15.

Závery:Akteozid z cistanchevykazuje protinádorový účinok pravdepodobne prostredníctvom up-regulácie hladín p53, ako aj inhibície expresie KLK a angiogenézy. Akteozid by mohol byť užitočný ako doplnok pri liečbe pokročilého HCC na klinike.

Kľúčové slová: Akteozid, Hepatocelulárny karcinóm, Sorafenib, Xenoštep, p53, Kallikrein

Pozadie

Hepatocelulárny karcinóm (HCC) je bežný malígny nádor s charakteristikami zlej prognózy a vysokej morbidity a mortality na celom svete [1, 2]. Boli identifikované rôzne faktory, ktoré prispievajú k výskytu a progresii HCC, vrátane infekcie vírusom hepatitídy B alebo C, inaktivácie nádorových supresorových génov, ako je p53, abnormálnej aktivácie onkogénov, ako je K-ras, a niektorých signálnych molekúl. ako sú PI3K, ERK/MAPK a Wnt/-katenín, ako aj vyhýbanie sa imunitnému systému hostiteľa [3, 4]. Pre manažment HCC sú možnosti pre pacientov s HCC v ranom štádiu resekcia, transplantácia pečene a rádiofrekvenčná ablácia, avšak s vysokou mierou recidívy a metastáz [3, 5, 6]. Okrem toho je pre pokročilých pacientov s HCC k dispozícii len niekoľko možností systémovej liečby, medzi ktoré patrí sorafenib a nedávno opísaný režim atezolizumab plus bevacizumab ako možná liečba prvej línie [7]. V tejto súvislosti je dôležité a zaujímavé buď vyvinúť nové činidlá zacielené na viaceré molekulárne ciele, alebo nastaviť novú stratégiu, ako je aplikácia kombinovanej terapie pri liečbe pokročilého HCC.

Akteozid z cistancheje fenyletanoidný glykozid široko rozšírený v mnohých liečivých rastlinách, vrátane Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] a Ligustrum purpurascens [10]. Pribúdajúce dôkazy ukázali, že akteozid môže prejavovať rôzne biologické aktivity, vrátane protinádorovej aktivity. Napríklad akteozid vykazoval silné antiproliferatívne účinky na rakovinové bunky prostaty [11]. Intraperitoneálne podanie akteozidu potlačilo rast nádoru v modeli myší s melanómom pravdepodobne prostredníctvom inhibície proteínkinázy C [12]. Okrem toho akteozid zosilnil senzibilizáciu buniek kolorektálneho karcinómu na 5- fluorouracil prostredníctvom zacielenia na signalizáciu PI3K/Akt [13]. Naše predchádzajúce údaje tiež ukázali inhibíciu melanogenézy akteozidom v bunkách melanómu B16 [14]. Napriek tomu je dostupných len málo informácií o možnej účinnosti akteozidu pri liečbe HCC a možných základných mechanizmoch.

V tejto štúdii sme to ukázaliAkteozid z cistancheinhibuje bunkovú proliferáciu, tvorbu kolónií a migráciu vo všetkých troch ľudských HCC bunkových líniách BEL7404, HLF a JHH7. Angiogenéza je tiež inhibovaná po liečbe akteozidom, ako ukazuje inhibícia tvorby trubíc a migrácie buniek HUVEC. In vivo protinádorová účinnosť akteozidu je ďalej demonštrovaná na modeli nahých myší s xenoštepom BEL7404 alebo JHH-7, pričom pri inhibícii rastu xenoštepu JHH-7 došlo v kombinácii so sorafenibom k zlepšeniu. Protinádorové účinky akteozidu možno pripísať jeho up-regulácii p53, ako aj supresii KLK a angiogenéze.

Metódy

Bunková kultúra

Bunkové línie ľudského hepatocelulárneho karcinómu (HCC) BEL7404, HLF a JHH7 sa získali z American Type Culture Collection a rutinne sa kultivovali v médiu DMEM obsahujúcom 10 percent fetálneho hovädzieho séra doplneného 100 jednotkami/ml penicilínu G a 100 ug/ml streptomycínu. vo zvlhčenom inkubátore pri 37 stupňoch s 5 percentami oxidu uhličitého. Ľudské endotelové bunky pupočníkovej žily (HUVEC) boli izolované z ľudských pupočníkových žíl (poskytnuté spoločnosťou ScienCell Research Laboratories, San Diego, USA) a udržiavané v médiu endotelových buniek, ako bolo opísané vyššie [15].

ČinidláAkteozid z cistanche (A01) bol zakúpený od Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Čína; šarža č. 100581; čistota väčšia alebo rovná 99 percent podľa HPLC). Sorafenib bol získaný od Selleck Chemicals (Houston, USA). Akteozid sme rozpustili v 0,9 percentnom fyziologickom roztoku. Zásobný roztok sorafenibu bol pripravený v dimetylsulfoxide (DMSO; 10 mM), rozdelený na alikvóty a skladovaný pri -20 stupňoch.

Zvieratá

V štúdii sa použili samce myší BALB/c (Nu/Nu) (18-20 g, 6–8 týždňov v čase prijatia) (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, Čína). Zvieratá boli umiestnené v individuálne vetraných polysulfónových klietkach v miestnosti s regulovanou teplotou a svetlom (12-hodinový cyklus svetla- 12h tmy, svetlá zapnuté o 7:00 ráno) s voľným prístupom k potrave a vode . Všetky experimentálne protokoly boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a použitie a boli vykonané v súlade s pokynmi Medzinárodnej asociácie pre štúdium bolesti týkajúce sa použitia laboratórnych zvierat.

Test bunkovej proliferácie Antiproliferatívna aktivita sa uskutočnila použitím MTT testu. V stručnosti, bunky boli nanesené v hustote 4 – 5 x 103 buniek na jamku na 96-jamkové platne. Po pripojení cez noc sa bunky ošetrili sériou koncentrácií akteozidu. Po ošetrení liekom v uvedenom časovom bode sa bunky inkubovali s 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidom (MTT Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Konečná koncentrácia: 5 ug/ml) počas 3–4 hodín pri 37 stupňoch. Formazánový produkt sa rozpustil v DMSO na kvantifikáciu pri vlnovej dĺžke 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>Pod svetelným mikroskopom sa spočítalo 10 buniek (zväčšenie x 100; Olympus, Tokio, Japonsko).

Test hojenia rán Bunky sa naočkovali na {{0}}jamkové platne (1 x 105 buniek na jamku) a kultivovali sa do 90 % konfluencie. Bunková vrstva sa poškrabala sterilnou 200 ul špičkou pipety, aby sa vytvorila medzera v rane. Migrácia buniek do poranenej oblasti bola vizualizovaná v uvedených časových bodoch (0, 10 a 24 h) pod inverzným svetelným mikroskopom pri zväčšení x 100. Každý experiment sa uskutočnil trojmo.

Test tvorby trubíc HUVEC boli kultivované tak, ako bolo opísané vyššie [15]. Stručne povedané, 96-doštičky s jamkami boli potiahnuté Matrigelom (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) podľa pokynov výrobcu a potom vrátené do inkubátora, aby polymerizovali 30–40 minút. HUVEC sa potom naočkovali v hustote 2 x 105 buniek/ml a ošetrili sa rôznymi danými liekmi počas 8 hodín. Tvorba trubíc bola fotografovaná inverzným mikroskopom v uvedených časových bodoch a analyzovaná pomocou softvéru ImageJ.

Analýza Western blotting

Celkové bunkové lyzáty boli pripravené s rádioimunoprecipitačným testovacím pufrom (RIPA) (50 mM Tris HCl pri pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % NP40, 1 % deoxycholát sodný, 0,1 % SDS, 10 ug/ml leupeptín, 10 ug/ml aprotinínu a 2 mM PMSF). Vzorky proteínov s rovnakými množstvami (20 ug/dráha) sa oddelili na géli SDS-PAGE a preniesli sa na membrány PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Membrány sa inkubovali cez noc s protilátkou p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Na kontrolu nanášania sa membrány prepláchli stripovacím pufrom a znova sa sondovali s protilátkou -aktín (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Proteíny boli detegované pomocou detekčného systému ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

qRT-PCR

Celková RNA sa extrahovala z bunkových línií pomocou činidla Trizol (Invitrogen, USA) a podstúpila reverznú transkripčnú-polymerázovú reťazovú reakciu (RT-PCR), aby sa syntetizovala cDNA pomocou komerčne dostupnej súpravy. qRT-PCR v reálnom čase s použitím 2xSYBR zeleného qPCR Supermix sa uskutočnilo na stroji Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, USA). Sekvencie primérov sú uvedené nižšie: sense 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' a anti-sense 5'-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' pre KLK1; zmysel 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ a antisense 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ pre KLK2; zmysel 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ a protizmyslový 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ pre KLK3; sense 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ a anti-sense 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ pre KLK4; zmysel 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ a antisense 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ pre KLK5; zmysel 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ a protizmyslový 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ pre KLK6; zmysel 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ a protizmyslový 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ pre KLK7; zmysel 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ a protizmyslový 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ pre KLK8; zmysel 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ a protizmyslový 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ pre KLK9; sense 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ a anti-sense 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ pre KLK10; zmysel 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ a protizmyslový 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ pre KLK11; zmysel 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ a antisense 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ pre KLK12; sense 5′-CCTGAACCACGACCATGACA{104}}′ a anti-sense 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ pre KLK13; zmysel 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ a anti-sense 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ pre KLK14; zmysel 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ a antisense 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ pre KLK15; zmysel 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ a antisense 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ pre GAPDH. Hodnoty prahu cyklu (Ct) každého génu KLK boli normalizované na hodnoty GAPDH a analyzované pomocou softvéru MxPro.

In vivo protinádorová aktivita A01 samostatne alebo v kombinácii so sorafenibom Pripravili sa suspenzie BEL7404 buniek (3 x 106 buniek) a subkutánne sa injikovali do pravého boku atymické nahé myši. Desať dní po inokulácii boli myši s nádorom (telesná hmotnosť (g): 22–26; priemer ± SEM: 23,8 ± 0.14) skrínované a vybrané na randomizáciu do 7 liečebných skupín podľa objemu nádoru ({ {12}} mm3). Celkom 38 myší bolo zaradených do rôznych liečebných skupín (n=5 na skupinu okrem modelovej skupiny (n=8)). Zvieratá boli potom liečené orálnou sondou akteozidom (A01; 12,5, 25 a 50 mg/kg), samotným sorafenibom (50 mg/kg) alebo v kombinácii s A01 (50 mg/kg) raz denne počas 14 dní. Okrem toho bola intravenózne podaná aj dávka 20 mg/kg A01. Dávky boli vybrané na základe predchádzajúcich štúdií a našich predbežných údajov [15]. Rast nádoru sa monitoroval každé 3 alebo 4 dni pomocou elektronického posuvného meradla s objemom vypočítaným ako 0,5 x dĺžka x šírka (mm3). Okrem toho bol zahrnutý paralelný experiment s použitím očkovania JHH-7. Sedem dní po inokulácii boli myši s nádorom (telesná hmotnosť (g): 20–26; priemer ± SEM: 24,0 ± 0,20) skrínované a vybrané na randomizáciu do liečebných skupín podľa objemu nádoru (80-130 mm3 ). Celkom 23 myší bolo zaradených do 4 liečebných skupín (n=5 na skupinu okrem modelovej skupiny (n=8)). Zvieratá potom dostávali A01 (20 mg/kg, iv), samotný sorafenib (50 mg/kg, ig) alebo kombináciu s A01 (20 mg/kg, iv) raz denne počas 14 po sebe nasledujúcich dní. Všetky myši boli anestetizované chloralhydrátom (350 mg/kg) a usmrtené dislokáciou krku na konci obdobia pozorovania. A nádorová hmota bola odstránená a nasnímaná digitálnym fotoaparátom.

Štatistická analýza

Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Pokiaľ nie je uvedené inak, štatistické analýzy sa uskutočňovali s použitím analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval posthoc Tukeyov test. Hodnoty objemu nádoru sú uvedené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Na analýzu údajov o objeme nádoru sa použila dvojcestná ANOVA, po ktorej nasledovali Tukeyho testy. Na štatistické analýzy sa použil softvér GraphPad Prism. Hodnota p < 0,05="" sa="" považovala="" za="" štatisticky="">

Výsledky

Účinky A01 na proliferáciu a tvorbu kolónií HCC in vitro

Na test bunkovej proliferácie sa použili tri bunkové línie HCC (BEL7404, HLF a JHH7). Ako je znázornené na obr. 1, MTT test odhalil, že A01 inhiboval proliferáciu všetkých troch HCC buniek. Na ďalšiu otázku, či antiproliferatívna aktivita A01 bola spôsobená jeho schopnosťou inhibovať bunkovú klonogenicitu, sa uskutočnil test tvorby kolónií. A01 pri 100 uM vykazoval silnú inhibíciu tvorby kolónií v bunkách BEL7404 (obr. 2a a b). V kombinácii so sorafenibom (2 μM) bola inhibičná sila silnejšia ako u A01 alebo samotného sorafenibu. Podobné výsledky boli tiež pozorované v ďalších dvoch bunkách HCC, HLF a JHH-7 (obr. 2c a d).

Účinky A01 samotného alebo v kombinácii so sorafenibom na bunkovú migráciu HCC in vitro

Ďalej sme vyhodnotili migráciu buniek pomocou testu škrabancov. Ako je znázornené na obr. 3, kombinácia A01 (100 alebo 500 uM) a sorafenibu (10 uM) významne zabránila hojeniu rán vo všetkých troch bunkách HCC v porovnaní s kontrolnou skupinou. V prípade buniek BEL7404 A01 (100 alebo 500 μM) aj sorafenib (10 μM) vyvolali iba tendenciu prevencie hojenia rán bez štatistickej významnosti (obr. 3a a d). V prípade buniek HLF A01 pri 500 uM a sorafenib pri 10 uM inhibovali hojenie rán. Najmä A01 (500 μM) v kombinácii so sorafenibom (10 μM) produkoval silnejšiu inhibíciu hojenia rán ako samotný sorafenib (obr. 3b a e). V prípade buniek JHH zabránil hojeniu rán A01 (500 μM) a sorafenib (10 μM). Kombinácia A01 (100 μM) a sorafenibu (10 μM) vyvolala silnejšiu inhibíciu hojenia rán ako samotný A01 (100 μM) alebo sorafenib (10 μM). Okrem toho A01 v 500 μM v kombinácii so sorafenibom (10 μM) vykazoval silnejšiu inhibíciu hojenia rán ako samotný A01 (500 μM) alebo sorafenib (10 μM) (obr. 3c a f).

Účinky A01 samotného alebo v kombinácii so sorafenibom na angiogenézu in vitro

Angiogenéza je úzko spojená s rastom, progresiou a metastázami nádoru [16], a preto sa považuje za jeden z intervenujúcich cieľov pri liečbe rakoviny. Najprv sme vykonali test tvorby trubíc, aby sme analyzovali potenciálnu angiogenézu in vitro. Ako je znázornené na obr. 4, liečba samotným sorafenibom (10 μM) alebo kombináciou A01 (100 a 500 μM) a sorafenibu (10 μM) počas 3 hodín začala vykazovať inhibičné účinky na tvorbu cievnych štruktúr, tzn. predĺženie a zarovnanie HUVEC (obr. 4a a c). Po liečbe počas 8 hodín A01 (100 a 500 μM), sorafenib (10 μM), ako aj kombinácia A01 a sorafenibu, všetky významne inhibovali tvorbu cievnych štruktúr, so silnejšou inhibíciou kombináciou A01 a sorafenibu ako A01 alebo samotný sorafenib (obr. 4a a c). Okrem toho je bunková migrácia HUVEC kľúčovým krokom k vytvoreniu nových ciev počas angiogenézy, a preto sa skúma. Ako je znázornené na obr. 4b a d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM), ako aj kombinácia A01 (100 a 500 μM) a sorafenibu (10 μM), všetky významne inhibovali migráciu buniek HUVEC. A01 (500 μM) v kombinácii so sorafenibom (10 μM) vyvolal silnejšiu inhibíciu ako samotný A01 (500 μM) alebo sorafenib (10 μM).

Účinky A01 samotného alebo v kombinácii so sorafenibom na in vivo rast nádoru BEL7404 a xenoimplantátov JHH-7 HCC

Na ďalšie vyhodnotenie účinnosti A01 samotného alebo v kombinácii so sorafenibom na in vivo rast nádoru HCC sme vytvorili model subkutánneho xenoštepu nahej myši pomocou BEL7404 alebo JHH-7 bunky. Ako je znázornené na obr. 5, objem nádoru sa výrazne znížil po liečbe A01 (25 a 50 mg/kg, orálnou sondou; 20 mg/kg, cez chvostovú žilu, všetky p < 0,01="" vs="" modelová="" skupina)="" alebo="" samotný="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" orálnou="" sondou;="" p="">< 0,01="" vs="" modelová="" skupina)="" samotný="" (obr.="" 5a="" a="" b).="" kombinácia="" a01="" (50="" mg/kg)="" a="" sorafenibu="" (50="" mg/kg)="" vykazovala="" silnejšiu="" inhibíciu="" rastu="" nádoru="" v="" porovnaní="" so="" samotným="" sorafenibom="" (p="">< 0,01),="" ale="" vyvolala="" podobný="" účinok="" ako="" samotný="" a01="" (obr.="" 5a="" a="" c="" ).="" ďalej="" sme="" použili="" model="" nahých="" myší="" s="" xenoštepom="" jhh{21}}="" na="" ďalšie="" testovanie="" možnej="" protinádorovej="" účinnosti="" a01.="" ako="" je="" znázornené="" na="" obr.="" 6,="" liečba="" s="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" alebo="" sorafenibom="" (50="" mg/kg,="" ig)="" spôsobila="" významnú="" inhibíciu="" rastu="" nádoru="" jhh-7="" xenoimplantátu="" (p="">< 0,01="" vs="" modelová="" skupina="" ),="" s="" väčšou="" inhibíciou,="" keď="" sa="" kombinujú="" (obr.="" 6a="" a="" b;="" p="">< 0,01="" oproti="" a01="" alebo="" skupine="" sorafenibu="">

Možná modulácia peptidázy súvisiacej s kalikreínom a p53 pomocouAkteozid z cistanche

Peptidáza súvisiaca s kallikreínom (KLK) bola navrhnutá ako rakovinový biomarker v diagnostike a prognóze rôznych druhov rakoviny vrátane hepatocelulárneho karcinómu v dôsledku jeho dysregulovanej expresie [17–19]. V tomto scenári sme detegovali génovú expresiu KLK1–15 v bunkovej línii HCC JHH-7. Ako je znázornené na obr. 7, liečba akteozidom spôsobila významnú inhibíciu hladín KLK1, 2, 4, 9 a 10 mRNA (obr. 7a-e), bez významných zmien zvyšku KLK1-15 (údaje nie sú uvedené ). Okrem toho sme detekovali aj hladinu tumor supresorového proteínu p53 a odhalili zvýšenie pri liečbe akteozidom (obr. 7f).

Diskusia

Manažment pokročilého HCC bol dlho neriešiteľný pre nemožnosť diagnostiky v skorších štádiách a chemorezistenciu nádoru [5, 6]. Sorafenib, multikinázový inhibítor, o ktorom sa uvádza, že inhibuje bunkovú proliferáciu a angiogenézu, sa spolu s ďalším perorálnym multikinázovým inhibítorom lenvatinibom stal štandardnou liečbou pokročilého HCC [3, 5, 20, 21]. Celková miera prežitia je však nízka vzhľadom na nízku mieru odpovede a nevhodnosť v klinickom prostredí [3, 22]. Nedávna štúdia ukázala, že atezolizumab plus bevacizumab priniesli lepšie klinické výsledky ako sorafenib u pacientov s neresekovateľným HCC, vďaka čomu je táto kombinácia možnou novou možnosťou prvej línie liečby pokročilého HCC [7]. V tejto súvislosti sme zistili, že fenyletanoidový glykozid,Akteozid z cistancheinhibovala bunkovú proliferáciu, tvorbu kolónií a migráciu v troch ľudských HCC bunkových líniách BEL7404, HLF a JHH-7, ako aj zakázala angiogenézu HUVEC. Kombinácia akteozidu a sorafenibu vyvolala silnejšiu inhibíciu tvorby bunkových kolónií a migrácie buniek HCC, ako aj angiogenézu HUVEC. Akteozid vykazoval protinádorovú účinnosť v modeli nahých myší s xenoštepom BEL7404 alebo JHH-7, pričom v kombinácii so sorafenibom sa zvýšila inhibícia rastu xenoštepu JHH-7. Ďalšie analýzy odhalili zvýšenie p53, ako aj zníženie niektorých génov KLK. V súlade s tým by sa malo zvážiť možné použitie akteozidu ako doplnkového lieku pri liečbe pokročilého HCC na klinike.

Pribúdajúce dôkazy ukázali protinádorové účinkyAkteozid z cistanchev rôznych nádorových bunkách, ako sú bunky melanómu B16, bunky glioblastómu, bunky kolorektálneho karcinómu, bunky skvamocelulárneho karcinómu ústnej dutiny, bunky rakoviny prostaty a bunky ľudského adenokarcinómu prsníka [11–13, 23–25] alebo u zvierat nesúcich nádory [12]. Napriek tomu sa len málo štúdií zameralo na účinky akteozidu na HCC in vitro alebo in vivo s výnimkou jednej štúdie, v ktorej sa ako karcinogén použil dietylnitrozamín na vyvolanie hepatokarcinogenézy u potkanov a ktorá odhalila chemoprevenciu akteozidom [26]. V súčasnej štúdii sme preukázali inhibíciu bunkovej proliferácie, tvorby kolónií a migrácie v HCC bunkových líniách akteozidom, ako aj rast nádoru u myší nesúcich xenoimplantáty bunkovej línie HCC, čím sme priamo demonštrovali protinádorové účinky akteozidu v HCC. Okrem toho kombinácia akteozidu a sorafenibu vyvolala ešte silnejšie protinádorové účinky. V kombinácii s dôkazmi, že akteozid chráni pred poškodením pečene [27–29] bez toxických účinkov na zvieratá a bez mutagenity [30], sa zdá byť realizovateľné pre budúcu aplikáciu kombinovanej terapie akteozidu a sorafenibu u pacientov s pokročilým HCC na klinike.

Rodina ľudských kalikreínov obsahuje 15 homológnych, jednoreťazcových, vylučovaných trypsínu alebo chymotrypsínu podobných serínových proteáz (KLK1–15) a podieľa sa na regulácii rastu nádoru, neoplastickej progresii, angiogenéze a metastázach [18, 31]. Najmä KLK boli navrhnuté ako rakovinový biomarker v diagnostike a prognóze rôznych druhov rakoviny, vrátane hepatocelulárneho karcinómu v dôsledku jeho dysregulovanej expresie [17–19]. Napríklad KLK1 je navrhnutý ako biomarker rakoviny žalúdka v dôsledku zvýšenia hladín KLK1 v neoplazme žalúdka a prevencie rastu nádoru pri rakovine žalúdka inhibíciou aktivity KLK1 proteínom viažucim kalikreín (KBP) [32]. V tomto scenári sme pozorovali významnú inhibíciu hladín KLK mRNA akteozidom (KLK1, 2, 4, 9 a 10). Aplikácia KBP, ktorý sa špecificky viaže na tkanivový kalikreín a inhibuje aktivitu kalikreínu, potláča rast HCC u myší pravdepodobne prostredníctvom jeho antiangiogénnej aktivity [33], čo naznačuje možné zapojenie KLK do progresie HCC. Okrem toho je nádorový supresorový proteín p53 schopný vyvolať starnutie, apoptózu, ako aj zastavenie bunkového cyklu. Zvýšená expresia p53 udeľuje rakovinovým bunkám zvýšenú chemosenzitivitu [34]. V tomto ohľade naše západné výsledky ukázali zvýšenie hladín p53 po liečbe akteozidom. Celkovo je rozumné odvodiť, že akteozid má protinádorové účinky na HCC pravdepodobne prostredníctvom jeho up-regulácie p53, ako aj inhibície KLK a angiogenézy.

Treba poznamenať, že priamy molekulárny cieľ, na ktorýAkteozid z cistanchemôže priamo viazať je stále nejasné. Naše predbežné údaje s použitím molekulárneho dokovania odhalili priamu väzbu akteozidu s kalikreínom (údaje nie sú uvedené). Na objasnenie tohto predpokladu by boli potrebné ďalšie experimenty. Okrem toho, pokiaľ ide o dávky akteozidu použité na bunkový test v štúdii 10–50-krát vyššie ako dávky sorafenibu (10 μM), najprv sme vybrali tieto dávky akteozidu v súlade s vzťah medzi dávkou a odozvou v teste MTT. Po druhé, dávky, ktoré sme použili (100 500 μM), boli porovnateľné s predchádzajúcimi štúdiami [35], v ktorých akteozid (100 μM) inhiboval bunkovú proliferáciu buniek kolorektálneho karcinómu. Napokon, napriek vyššej dávke v bunkovom teste, akteozid spôsobil výraznú inhibíciu rastu nádoru v modeli nahých myší s xenoštepom HCC v našej štúdii (25 a 50 mg/kg), pričom účinky boli podobné ako u sorafenibu (50 mg/kg). Pre sorafenib sa v našej štúdii použil v dávke 10 μM na bunkovej úrovni. Táto dávka je porovnateľná s predchádzajúcimi štúdiami, v ktorých sa zistilo, že sorafenib inhibuje životaschopnosť buniek s IC50 4,0–6,5 μM v bunkových líniách HCC buniek PLC/PRF/5 a HepG2. Na rozdiel od toho dávka sorafenibu použitá na potlačenie rastu xenoimplantátov HCC u samíc myší SCID bola 30 mg/kg (po žalúdočnou sondou) [36]. Na klinike je odporúčaná dávka sorafenibu pre pacienta 400 mg za čas (2*0,2 g), dvakrát denne (spolu 800 mg za deň). Táto dávka pre sorafenib používaná na klinike je v protiklade s dávkou používanou v bunkovom teste (hodnota IC50 v úrovni μM), pravdepodobne kvôli jeho zlej absorbovateľnosti za podmienok in vivo. V prípade akteozidu, na základe jeho dávkovania u myší (50 mg/kg, ig), jeho ekvivalentná dávka pre ľudí (60 kg telesnej hmotnosti) je približne 250 mg. Toto dávkovanie je porovnateľné s dávkovaním sorafenibu používaného na klinike a malo by byť pre pacientov prijateľné.

Závery Na záver,Akteozid z cistancheje schopný prejavovať protinádorový účinok v bunkových líniách HCC a u nahých myší nesúcich xenoimplantáty bunkovej línie HCC, účinky pravdepodobne prostredníctvom zvyšovania hladín p53, ako aj zamedzenie KLK a angiogenézy. Akteozid by mohol byť užitočný ako doplnok pri liečbe pokročilého HCC na klinike.

Referencie

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Globálna štatistika rakoviny 2018: GLOBOCAN odhady incidencie a mortality na celom svete pre 36 druhov rakoviny v 185 krajinách. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatocelulárny karcinóm. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Hepatocelulárny karcinóm v ére imunoterapie. Curr Probl Cancer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Hepatocelulárny karcinóm: mechanizmy progresie a imunoterapia. World J Gastroenterol. 2019;25(25):3151–67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Kontroverzie v manažmente hepatocelulárneho karcinómu. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Diagnostika a liečba hepatocelulárneho karcinómu. Semi Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO a kol. Atezolizumab plus bevacizumab pri neresekovateľnom hepatocelulárnom karcinóme. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang ČR. Monoterpenoidné a fenyletanoidové glykozidy z Ligustrum peduncular. Fytochémia. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC stanovenieakteozidv Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Antioxidačné aktivity fenyletanoidných glykozidov z Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Všeobecná syntetická stratégia a antiproliferačné vlastnosti na bunkových líniách rakoviny prostaty pre prírodné fenyletanoidové glykozidy. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I a kol. Selektívna cytotoxicita rastlinnej látky akteozidu proti nádorovým bunkám a jej mechanistické poznatky. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbaskozid: identifikácia, kvantifikácia a potenciálna senzibilizácia buniek kolorektálneho karcinómu na 5-FU zacielením na dráhu PI3K/AKT. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Vodný extrakt z kvetov Osmanthus fragrans a jeho obohatený akteozid inhibujú melanogenézu a pigmentáciu vyvolanú ultrafialovým žiarením. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Nový PI3K inhibítor S1 synergizuje so sorafenibom v bunkách nemalobunkového karcinómu pľúc zahŕňajúcich Akt-S6 signalizáciu. Preskúmajte nové drogy. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D., Weinberg RA. Charakteristické znaky rakoviny: ďalšia generácia. Bunka. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Užitočnosť peptidáz súvisiacich s kalikreínom (KLK) ako biomarkerov rakoviny. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostický a prognostický biomarkerový potenciál génov rodiny kalikreínu u rôznych typov rakoviny. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikreín-príbuzné peptidázy (KLK) pri rakovine gastrointestinálneho traktu: mechanické a klinické aspekty. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS a kol. Účinnosť a bezpečnosť sorafenibu u pacientov v ázijsko-pacifickom regióne s pokročilým hepatocelulárnym karcinómom: randomizovaná, dvojito zaslepená, placebom kontrolovaná štúdia fázy III. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A a kol. Sorafenib pri pokročilom hepatocelulárnom karcinóme. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Pieseň MJ. Infúzna chemoterapia hepatálnej artérie pre pokročilý hepatocelulárny karcinóm. World J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Vodný extrakt Anisomeles India a jeho purifikovaná zlúčenina vykazuje antimetastatickú aktivitu prostredníctvom inhibície aktivácie NF kappaB/AP-1-závislej MMP-9 v bunkách ľudského karcinómu prsníka MCF-7. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B a kol. Účinok verbascozidu na apoptózu a metastázy v ľudskom orálnom spinocelulárnom karcinóme. Int J Cancer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Synergický protirakovinový účinok chemoterapie glioblastómu na báze akteozidu a temozolomidu. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Akteozid sprostredkuje chemoprevenciu experimentálnej karcinogenézy pečene prostredníctvom STAT-3 regulovaného oxidačného stresu a apoptózy. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolity diétneho akteozidu: profily, izolácia, identifikácia a hepatoprotektívne kapacity. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Akteozid inhibuje apoptózu pri poškodení pečene vyvolanom D-galaktozamínom a lipopolysacharidmi. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Ochranný účinok akteozidu na imunologické poškodenie pečene vyvolané Bacillus Calmette Guerin plus lipopolysacharid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Extrakt z vonného kvetu Osmanthus bohatý na fenyletanoidové glykozidy: štúdie akútnej a subchronickej toxicity. J Ethnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Kalikreíny ľudského tkaniva: rodina nových biomarkerov rakoviny. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Porovnanie expresie tkanivového kalikreínu a kinínového receptora v žalúdočných vredoch a novotvaroch. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein potláča rast hepatocelulárneho karcinómu antiangiogénnou aktivitou. Cancer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Zvýšenie proteínu p53 senzibilizuje nemalobunkový karcinóm pľúc na paklitaxel a cisplatinu in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbaskozid podporuje apoptózu reguláciou signalizácie HIPK2-p53 u ľudí kolorektálny karcinóm. BMC rakovina. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib blokuje dráhu RAF/MEK/ERK, inhibuje nádorovú angiogenézu a indukuje apoptózu nádorových buniek v hepatocelulárnom model karcinómu PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.