Prvá časť Akteozidom potlačená mikroglia M1 Polarizácia prostredníctvom inhibovanej signálnej dráhy NF-KB a obnovy funkcie mitochondrií sprostredkovanej AMPK

pre viac informácií:{0}}

ČASŤ 1 Ako Cistanche Acteosides zvyšujú vitalitu mozgových buniek a zmierňujú Alzheimerovu chorobu?

Kliknite na produkty Cistanches

Čínska farmaceutická univerzita Ying-Qi Li

Čínska farmaceutická univerzita Yi Chen

Čínska farmaceutická univerzita Si-Qi Jiang

Čínska farmaceutická univerzita Yuan-Yuan Shi

Čínska farmaceutická univerzita Xiao-Li Jiang

Čínska farmaceutická univerzita Shan-Shan Wu

Čínska farmaceutická univerzita Ping Zhou

Čínska farmaceutická univerzita Hui-Ying Wang

Čínska farmaceutická univerzita Ping Li

Kľúčové slová výskumu: akteozid, BV-2 bunky, metabolizmus, RNA-seq, mitochondrie, neuroin§ ammácia

Abstraktné

Východiská: Alzheimerova choroba (AD) je najčastejším typom demencie. Zatiaľ čoakteozid(ACT), zlúčeninaizolovanýodCistanche tubulosa, vlastníneuroprotektívne vlastnosti. Základný mechanizmus regulácie polarizácie mikroglií však zostáva nedostatočne definovaný. Metódy: Tu sa použil AlCl3-indukovaný model AD u lariev zebry, aby sa odhalila terapeutická účinnosť ACT. Bunky BV-2 sa použili na demonštráciu úlohy ACT na polarizáciu mikroglií. Sekvencia RNA, HPLC-Q-TOF-MS, western blot a molekulové dokovanie sa spojili, aby sa potvrdil jej mechanizmus.

Výsledky: ACT významne zlepšila experimentálnu dyskinézu a poruchy nervového systému u zebry. Následne potlačil polarizáciu M1 a podporil fenotyp M2 v LPS-indukovaných BV-2 bunkách. Najprv sme preukázali, že ACT má hlboký transkriptomický vplyv, ktorý zahŕňa reguláciu kľúčových signálnych dráh pri zápale, biosyntéze arginínu, ako aj biosyntéze pantotenátu a CoA, korelujúcu s funkciou mitochondrií. Liečba ACT znížila polarizáciu mikroglie M1 inhibíciou signálnej dráhy NF-KB. A metabolické dráhy boli ďalej potvrdené pomocou HPLC-Q-TOF-MS. Okrem toho ACT napravil nadmerné ROS, aby obnovil funkciu mitochondrií prostredníctvom AMPK-sprostredkovanej PGC{10}} a UCP{11}} upregulácie, čo je v súlade s metabolickými zmenami. Je zaujímavé, že ACT sa môže priamo viazať na NF-KB aj AMPK, ako dokazuje molekulárne dokovanie. Závery: Výskum poskytol infúzny mechanizmus ACT a ilustroval novú perspektívu založenú na mitochondriálnej dysfunkcii s cieľom odhaliť spojenie medzi metabolizmom a polarizáciou mikroglií.

Pozadie

Alzheimerova choroba (AD) je bežné neurodegeneratívne ochorenie sprevádzané kognitívnym poškodením a dyskinézou[1]. Je charakterizovaná závažnou stratou neurónov, senilnými plakmi a neurobrilárnymi spleťami[2]. Patogenéza AD je multidimenzionálna a spojená s neuroinflamáciou. Neuroinflumácia je riadená aktiváciou gliových buniek, ktorá úzko súvisí s rozvojom AD[3, 4]. Počas progresie a exacerbácie neuroinflamácie sa za kľúčový faktor považuje mikroglia. Mikroglie sú primárne imunitné bunky v centrálnom nervovom systéme. Je úzko spojená s kaskádou procesov, ktoré zahŕňajú vývoj mozgu, udržiavanie neutrálneho prostredia, ako aj reakciu na zranenia a opravy[1]. Okrem toho, mikroglie môžu byť stimulované na fenotyp M1 a expresia prozápalových cytokínov je zvýšená, keď sa vyskytnú ochorenia súvisiace s neurozápalom, ako je AD[5]. Štúdie tiež ukazujú, že polarizácia na fenotyp M1 je často sprevádzaná metabolickými poruchami[6], čo spôsobuje nerovnováhu energetického metabolizmu a mitochondriálnu dysfunkciu[7]. Tieto nepriaznivé zmeny sú odvodené od neurodegenerácie, dokonca aj z AD.

akteozid(ACT), fenyletanoidový glykozid, je primárne odvodený odCistanchetubulosa. Nasvedčovalo tomu stále viac dôkazovACTdisponoval mnohými farmakologickýmiaktivity vrátane neuroprotektívnych[8], protizápalových[9] a antioxidačných[10] účinkov. Najmä sa uvádza, že ACT zlepšuje poškodenie učenia a pamäti, ako aj upreguluje energetický metabolizmus u potkanov indukovaných streptozotocínom [11]. Tiež sa predpokladá, že inhibuje neurónovú apoptotickú bunkovú smrť a mitochondriálne poškodenie u experimentálnych myší s autoimunitnou encefalomyelitídou [12]. Menej štúdií sa však zameralo na vplyv ACT na polarizáciu mikroglií M1/M2. Najmä neboli vykonané rôzne mechanizmy, ako je oprava funkcie mitochondrií a regulácia bunkového metabolizmu. Okrem toho mechanizmusACTprispel k mikroglii polarizácia M1/M2 zostala nepreskúmaná. Cieľom tejto správy bolo preskúmať terapeutickú účinnosť ACT, ako aj základný molekulárny mechanizmusACTvAD. tuACTpreukázali významný neuroprotektívny účinok u lariev zebričiek AD vyvolaných AlCl{0}}. Okrem toho ACT účinne inhiboval polarizáciu M1 a podporoval fenotyp M2 v bunkách BV-2 indukovaných LPS. RNA-sekvenovanie (RNA-Seq) integrované s metabolomickou metódou na lepšie pochopenie základného mechanizmu ACT pri regulácii polarizácie mikroglií. Skúmal sa presluch medzi metabolizmom a polarizáciou mikroglií z hľadiska mitochondriálnej funkcie. Táto štúdia poskytne nový rešpekt pre ďalšie skúmanie ACT ako potenciálneho terapeutického činidla na liečbu AD.

Metódy

Zoskupenie zvierat a modelov

V tejto štúdii bol vybraný divý typ zebry (kmeň AB, 4 mesiace starý) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Boli udržiavané v 14/10-hodinovom cykle svetlo/tma pri 28 stupňoch podľa predchádzajúcej metódy[13]. Prírodné hnojivo a normálne vyvinuté embryá boli vytvorené a kultivované do 3 dní po oplodnení (pdf) v osvetľovacom inkubátore. Všetky experimenty so zebričkami sa uskutočnili pod dohľadom Výboru pre etiku zvierat Čínskej farmaceutickej univerzity. Larvy zebrafish boli rozdelené do šiestich skupín a liečené od 3 pdf do 7 pdf: kontrolná skupina, modelová skupina, modelová skupina plus donepezil hydrochloridová (DPZ) skupina, modelová plus ACT skupiny. Kontrolná skupina bola udržiavaná v médiu s 0,2 percentami DMSO a modelová skupina bola ošetrená 150 uM AlCl3 (pH 5,8). Model plus skupina DPZ bola spoločne ošetrená AlCl3 a 8 uM DPZ. Model plus ACT skupiny boli spoločne ošetrené AlCl3 a rôznymi koncentráciami ACT (200, 100, 50 uM). ACT (HPLC čistota väčšia alebo rovná 98 percent) bol získaný od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Čína). AlCl3.6H20 a DPZ boli zakúpené od Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Šanghaj, Čína).

Analýza správania Strana 3/34 Pohyby lariev zebrafish sa zaznamenávali pomocou analyzátora správania ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) pri 28 stupňoch. Stručne povedané, parametre správania a spracovanie výsledkov boli v súlade s metódou, ktorú sme zaviedli skôr[13]. Tu sa na vyhodnotenie zotavenia z dyskinézy u zebričiek vybrali priemerná rýchlosť (AS), zmena rýchlosti (AS), miera zotavenia dyskinézy (DRR) a účinnosť odozvy (RE, percentá).

Stanovenie aktivity acetylcholínesterázy (AChE) a cholínacetyltransferázy (ChAT)

Po ošetrení od 3 pdf do 7 pdf sa zozbierali larvy zebričiek na meranie aktivity AChE a ChAT.

Na základe protokolu výrobcu bola aktivita detekovaná súpravami ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). A koncentrácie proteínov rôznych vzoriek boli stanovené metódou BCA

Bunkové kultúry a liečby

Bunková línia BV{0}} (imortalizovaná myšacia mikrogliálna bunková línia) bola zakúpená od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kultivovali sa v DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Čína). Médium bolo doplnené 10 percentami FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/ml penicilínu, ako aj 100 mg/ml streptomycínu, s 95 percentami vzduchu/5 percent CO2 pri 37 stupňoch. Bunky BV-2 boli inkubované s ACT (50, 25, 12,5 uM) alebo stimulované lipopolysacharidom (LPS, 1 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) počas 24 hodín. Nakoniec sa všetky bunky alebo supernatant zhromaždili na rôzne analýzy.

Test životaschopnosti buniek

Test Cell Counting Kit-8 (CCK{1}}) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína) sa použil na vyhodnotenie životaschopnosti buniek BV-2. Bunky boli nasadené na 96-jamkovú doštičku (1 x 104 buniek/jamku, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). V stručnosti, médium sa odstránilo na konci ošetrenia a do každej jamky sa pridalo 100 ul bezsérového média obsahujúceho roztok CCK-8 na 2 hodiny pri 37 stupňoch. Absorbancia sa merala pri 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA). Životaschopnosť buniek je vyjadrená ako percento kontrolnej skupiny. Experiment sa opakoval trikrát.

Test produkcie oxidu dusnatého (NO).

NO bol stanovený meraním hladín dusitanov v supernatante kultúry BV{0}} pomocou Griessovho činidla. Brie§y, na konci ošetrenia sa médium (100 ul) prenieslo do novej 96-jamkovej platne. Do každej jamky sa pridal rovnaký objem Griessovho činidla a nechalo sa reagovať 15 minút v tme. Absorpcia pri 540 nm bola stanovená čítačkou mikrodoštičiek.

Hladiny zápalových cytokínov v supernatante

Koncentrácie TNF-, IL-1 a IL-10 v supernatante buniek BV-2 boli stanovené pomocou súprav ELISA podľa pokynov výrobcu (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China ).

Pozorovanie bunkovej morfológie

Aby sa určil účinok ACT na polarizáciu M1/M2 buniek BV-2, bunky sa umiestnili do 6-jamkovej misky a pozorovali sa pod inverzným mikroskopom (Nikon ECLIPSE Ti2, Japonsko).

Stanovenie bunkového metabolizmu analýzou HPLC-Q-TOF-MS

Bunky BV{{0}} boli nasadené do 6-jamkovej misky oddelene (n=6/skupina). Po ošetrení sa médium odstránilo a bunky sa trikrát premyli studeným PBS. Potom sa ihneď vystaví tekutému dusíku na potlačenie metabolizmu buniek. Bunky sa zozbierali studeným 80 percentným metanolom (1 ml/jamka) a suspenzia sa preniesla do 2 ml Eppendorfovej skúmavky. Na uľahčenie precipitácie proteínu sa 1 minútu intenzívne vortexuje a centrifuguje sa pri 13, 000 otáčkach za minútu 15 minút pri 4 stupňoch. Bunková suspenzia sa preniesla do novej 2 ml skúmavky Eppendorf a vysušila sa pod prúdom dusíka a skladovala sa pri -80 stupňoch až do analýzy. Vysušený zvyšok sa rekonštituoval v 15{{40}} μl vopred vychladeného 25% acetonitrilu. Aby sa zabezpečila stabilita a presnosť sekvenčnej analýzy, boli rovnaké objemy (10 μl) každej vzorky buniek kombinované ako vzorky na kontrolu kvality (QC). Počas detekcie metabolitu boli tieto vzorky injikované po každých šiestich vzorkách buniek, aby sa potvrdila ich stabilita. Na HPLC-Q-TOF-MS sa vstrekol 1 ul alikvót. Analýza HPLC-Q-TOF-MS sa uskutočnila na systéme Agilent 1290 HPLC spojenom s hmotnostným spektrometrom Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separácia sa uskutočnila na kolóne ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 1 00 mm, 1,7 μm). Mobilná fáza bola zložená z 0,1 percenta kyselina mravčia-voda (obj./obj.; A) a acetonitril (B). Rýchlosť prietoku bola nastavená na 0,4 ml/min s nasledujúcimi optimálnymi gradientovými elučnými podmienkami: 0 až 2 minúty, 5 percent B; 2 až 20 minút, 5 percent až 95 percent B (pozitívny iónový mód); 0 až 2 minúty, 5 percent B; 2 až 20 minút, 5 percent až 95 percent B (režim záporných iónov). Prevádzkové parametre hmotnostného spektrometra boli nastavené nasledovne: teplota plynu, 320 stupňov; sušiaci plyn, 10 l/min; nebulizér, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V. Surové dáta boli spracované pod MassHunter Workstation Software verzie B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Nespracované údaje boli vopred spracované platformou XCMS. Analýza hlavných komponentov (PCA) a čiastočná diskriminačná analýza najmenších štvorcov (PLS-DA) normalizovaných údajov sa uskutočnili pomocou MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). V kombinácii s literatúrou boli rozdielne metabolity (VIP > 1, T-test P < 0,05)="" identifikované="" na="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" nakoniec="" sa="" uskutočnila="" analýza="" dráhy="" pomocou="">

Meranie mitochondriálneho membránového potenciálu (MMP)

MMP bola detegovaná pomocou §uorescenčnej sondy JC-1 (Beyotime, Čína) v súlade s pokynmi výrobcu. V stručnosti, bunky z rôznych skupín boli premyté PBS a inkubované s JC-1 farbiacim roztokom počas 20 minút pri 37 stupňoch. Po farbení sa bunky dvakrát premyli s použitím farbiaceho pufra. Potom sa fluorescenčné signály detegovali prietokovou cytometriou (BD Accuri C6).

Meranie mitochondriálneho adenozín 5'-trifosfátu (ATP)

Koncentrácia ATP v mitochondriách bola detekovaná ATP Assay Kit (Beyotime, Čína) v súlade s pokynmi výrobcu. V stručnosti, kultivačné médium BV{0}} buniek z rôznych skupín sa vyhodilo a bunky sa homogenizovali s lyzačným pufrom na ľade. Supernatant získaný po centrifugácii (12,{2}}g, 5 minút) sa použil na stanovenie koncentrácie ATP. Luminiscencia (luciferázou katalyzovaná §uoresceínová reakcia) bola detegovaná EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Meranie hladiny intracelulárnych reaktívnych foriem kyslíka (ROS).

Na meranie hladiny ROS bola použitá súprava ROS Assay Kit (Beyotime, Čína). Bunky z rôznych skupín sa inkubovali s DCFH-DA (10 uM) počas 20 minút pri 37 stupňoch. Po zavedení sondy sa bunky trikrát premyli DMEM. Potom sa pomocou prietokovej cytometrie (BD Accuri C6) detegovali §uorescenčné signály.

Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM)

Bunky BV-2 boli nasadené do 6-jamkovej misky. Médium sa odstránilo a do každej jamky sa rýchlo pridal 1 ml 2,5 % glutaraldehydu. Potom boli bunky prenesené do 1,5 ml Eppendorfovej skúmavky a centrifugované pri 1000 ot./min. počas 3 minút. Bunky boli fixované cez noc novým 2,5 percentným glutaraldehydom pri 4 stupňoch. Po exxácii, dehydratácii a zapustení boli bunky pozorované transmisným elektrónovým mikroskopom HT7800 (Hitachi, Tokio, Japonsko).

RNA-seq a bioinformatická analýza dát

Celková RNA z buniek BV-2 (n=3/skupina) boli extrahované pomocou činidla Trizol (Vazyme Biotech, Čína) podľa pokynov výrobcu činidla. Všetky analytické vzorky boli zaslané do Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) na vykonanie sekvenčného testu RNA. Údaje boli analyzované na bezplatnej online platforme Majorbio Cloud Platform. Parametre pre diferenciálnu expresnú analýzu boliP-adjust < 0.05 a |log2FC|Väčšie alebo rovné1. Pôvodné sekvenčné dáta boli odoslané do databázy NCBI Sequence Read Archive (SRA).

Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qRT-PCR)

Celková RNA buniek BV{0}} v každej skupine sa zozbierala pomocou 500 μl izolačného činidla RNA-easyTM (Vazyme Biotech, Čína) a reverzná transkripčná reakcia sa uskutočnila pomocou FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Čína) . Reakcie sa uskutočňovali podľa protokolu výrobcu. cDNA bola podrobená qRT-PCR testom so špecifickými primérmi a TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Čína). Priméry sú uvedené v tabuľke S1 (pozri dodatočný súbor 1) a -aktín sa použil ako vnútorná kontrola. Na kvantitatívnu analýzu bola použitá metóda 2-ΔΔCT.

Western blot analýza

Bunky BV-2 boli lyzované RIPA lyzačným pufrom (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Čína) obsahujúcim 1 percento koktailu inhibítora proteázy (Thermo Fisher), čím sa získal celkový proteín. Uskutočnila sa 10-percentná SDS-PAGE na oddelenie proteínov, ktoré sa preniesli na membrány NC. Po blokovaní 5 percentami odstredeného mlieka/BSA počas 2 hodín sa membrány inkubovali s AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-KB (ABclonal) alebo GAPDH (ABclonal) protilátky v 5% TBST pri 4 stupňoch cez noc. Membrány sa inkubovali so sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (ABclonal) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Na vizualizáciu a kvantifikáciu sa použil vysokosig ECL western blotting substrát (Tanon, Čína), gélový zobrazovací systém (Tanon, Čína) a softvér ImageJ.

Molekulárne dokovanie

Molekulárne dokovacie analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru Autodock (verzia 4.2). Afinita medzi ACT a proteínmi bola pozorovaná softvérom AutodockTools. Trojrozmerné (3D) proteínové štruktúry AMPK (PDB ID: 5g5j) a NF-KB (PDB ID: 4q3j) boli získané z Protein Data Bank

Štatistická analýza

Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Rozdiely medzi rôznymi skupinami boli analyzované jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho násobok.

Výsledky

ACT zmiernil dyskinézu a zlepšil funkciu cholinergného systému u lariev zebričiek

AlCl3-indukovaný model AD u lariev zebričiek sa použil na demonštráciu účinku ACT na AD. Najprv sa pozoroval pohyb lariev zebričiek v cykloch svetlo/tma a zaznamenali sa ich plavecké dráhy (obr. 1a, 1b). Vypočítali sa AS a AS pohybu zebričiek indukovaného AlCl3 v zodpovedajúcom čase po podaní. Výsledky ukázali, že rôzne dávky ACT účinne zvýšili AS a AS zebričiek (obr. 1c). DRR a RE odhalili intuitívnejšie porovnanie ACT a DPZ (obr. 1d). V súlade s tým ACT zmiernil dyskinézu a vykazoval podobné účinky ako DPZ. Všeobecne sa uznáva, že cholinergný systém hrá dôležitú úlohu v procesoch učenia a pamäte. Na odhalenie účinku ACT sa teda použili aktivity AChE a ChAT. Expozícia AlCl3 u zebrafish poskytnutá s mozgovou cholinergnou zmenou (obr. 1e). Bolo pozoruhodné, že liečba ACT potlačila aktivitu AChE. Okrem toho aktivita ChAT vykazovala pokles po liečbe ACT. Stručne povedané, ACT preukázal hlboký vplyv na funkciu cholinergného systému u lariev zebričiek AD indukovaných AlCl3-.

ACT potlačil polarizáciu M1 a podporoval polarizáciu M2 v LPS-indukovaných BV-2 bunkách

Študovali sa účinky ACT na polarizáciu mikrogliíin vitropomocou BV-2 mikrogliálnych buniek. LPS významne znížil životaschopnosť buniek BV-2 po liečbe 24 hodín. Našťastie ACT zvýšil životaschopnosť buniek BV-2 indukovaných LPS (obr. 2a). Okrem toho sa pozorovala morfológia buniek BV-2. Po 24 hodinách stimulácie LPS sa ukázalo, že bunky BV-2 prešli stavom polarizácie M1. A morfologickým zmenám sa zabránilo súčasnou liečbou ACT (obr. 2b). Okrem toho výsledky ukázali, že na rozdiel od BV-2 buniek stimulovaných LPS, BV{13}} bunky súbežne ošetrené ACT vykazovali signifikantne suprimované TNF- (obr. 2c), IL-1 ( Obr. 2d) a NO (obr. 2f) expresie v bunkovom supernatante. Ide o klasické prozápalové cytokíny ako indikátory polarizácie mikroglií M1. Podobne ako výsledky ELISA, výsledky qPCR zistili, že expresia mRNA TNF- , syntázy oxidu dusnatého (iNOS), IL-1 a CD86 mRNA boli signifikantnévýrazne inhibovaná liečbou ACT v porovnaní so skupinou LPS (obr. 3a). Ďalej sme merali hladiny polarizácie mikroglií M2 pomocou ELISA (obr. 2e) a qPCR (obr. 3b), ktorých výsledky ukázali, že ACT signifikantne zvýšilo hladiny expresie markerov súvisiacich s mikrogliami M2 (IL-10, CD206 , TGF- a Arg-1). Celkovo tieto výsledky ukázali, že ACT potláča polarizáciu mikroglií M1 a podporuje fenotyp M2.

ACT regulovaná polarizácia M1/M2 prostredníctvom inhibície NF-κB signálnej dráhy v LPS-indukovaných BV-2 bunkách

Transkriptomická analýza bola vykonaná pomocou RNA-seq na pochopenie mechanizmu ACT v BV-2 bunkách z celkovej úrovne. PCA ilustrovala, že kontrolné, LPS a ACT skupiny sa dali dobre rozlíšiť (obr. 4a). Odhalilo 899 rozdielne exprimovaných génov (DEG) medzi kontrolnou skupinou a LPS skupinou, zatiaľ čo 49 DEG bolo medzi LPS skupinou a ACT skupinou (obr. 4b). Analýza obohatenia génovej ontológie (GO) (obr. 4c) a analýza obohatenia Kyoto Encyklopédia génov a genómov (KEGG) (obr. 4d) v súlade s tým odhalili, že účinok ACT sa podieľal na signálnej dráhe NF-KB. Súbor génov spojených so signálnou dráhou NF-κB bol ďalej potvrdený a ich homeostáza bola určite ovplyvnená LPS. Ako sa očakávalo, ACT významne ovplyvnila ich prejavy (obr. 4e). NF-KB signálna dráha je klasickou dráhou na reguláciu progresie zápalu, ktorá v konečnom dôsledku vedie k uvoľneniu prozápalových faktorov. Na získanie mechanistickej podpory sa kľúčový proteín signálnej dráhy NF-KB vyhodnotil pomocou analýzy Western blot. Stimulácia LPS viedla k aktivácii NF-KB, spojenej s podporou polarizácie M1. V súlade s analýzou RNA-seq ACT inhiboval LPS-stimulovanú fosforyláciu NF-KB (obr. 4f). Preto ACT zmiernil LPS-indukovanú M1 polarizáciu prostredníctvom NF-KB signálnej dráhy v BV-2 bunkách.

ACT narušil biosyntézu arginínu, ako aj biosyntézu pantotenátu a CoA v LPS-indukovaných BV-2 bunkách

RNA-seq demonštrovala, že dráhy ovplyvnené ACT tiež zahŕňali biosyntézu arginínu (Arg), ako aj biosyntézu pantotenátu a CoA (obr. 4d). A bolo navrhnuté, že stimulácia LPS spôsobuje poruchy metabolizmu buniek BV-2 spojené s polarizáciou M1[14]. Na identifikáciu účinku ACT na metabolizmus buniek sa teda použil necielený bunkový metabolóm pomocou HPLC-Q-TOF-MS. PCA (obr. 5a) a PLS-DA (obr. 5b) ilustrovali, že kontrolné skupiny, LPS a ACT skupiny bolo možné dobre rozlíšiť na základe intracelulárnych metabolitov. Hladiny rôznych metabolitov v LPS-indukovaných BV-2 bunkách sa po liečbe ACT zmenili (obr. 5c). V porovnaní s kontrolnou skupinou sa v skupine LPS významne zmenilo 11 metabolitov (tabuľka S2, pozri dodatočnú časť 2). Zatiaľ čo 14 metabolitov bolo zreteľne zmenených po liečbe ACT (tabuľka S3, pozri dodatočný bod 3), zahŕňajúcich 11 metabolických dráh (obr. 5d). Účinok ACT spočíval najmä v regulácii metabolizmu aminokyselín (biosyntéza fenylalanínu, tyrozínu a tryptofánu, metabolizmus D-glutamínu a D-glutamátu, biosyntéza Arg, metabolizmus fenylalanínu), metabolizmus nukleotidov (metabolizmus purínov, metabolizmus pyrimidínov), energetický metabolizmus (dusík metabolizmus), ako aj metabolizmus kofaktorov a vitamínov (biosyntéza pantotenátu a CoA). Je zaujímavé, že metabolické dráhy získané metabolómom boli v súlade s RNA-seq, vrátane biosyntézy Arg, ako aj biosyntézy pantotenátu a CoA. Vyššie uvedené ukazuje, že ACT môže regulovať biosyntézu Arg, ako aj biosyntézu pantotenátu a CoA v bunkách BV-2 stimulovaných LPS.

Act Mitigated Lps-indukovaná Bv-2 mitochondriálna dysfunkcia

Mitochondrie sú jadrom metabolických dráh. Vyvíjajú sa dôkazy, že mitochondrie sú kľúčovými hráčmi v mikrogliálnej polarizácii M1/M2. Predchádzajúci výskum ukázal, že LPS môže spôsobiť mitochondriálnu dysfunkciu. Prehľad stavu mitochondrií v morfológii a bunkovej distribúcii bol posúdený pomocou TEM. Po stimulácii LPS bunky BV-2 vykazovali kondenzáciu chromatínu v jadre, zníženú cytoplazmu, ako aj menej mitochondrií (obr. 6a). Okrem toho boli mitochondriálne cristae skupiny LPS neusporiadané alebo dokonca zmizli, pričom vykazovali čiastočnú kristolýzu, zmenšenú veľkosť a okrúhlu morfológiu. Je zaujímavé, že liečba ACT by mohla zmierniť morfologické zmeny v mitochondriách vyvolané LPS. Postupne sme skúmali mitochondriálnu funkciu BV-2 buniek ošetrených LPS, vrátane MMP, a mitochondriálnu produkciu ATP. Produkcia MMP (obr. 6b, 6c) a ATP v mitochondriách (obr. 6d) sa významne zlepšila v bunkách ošetrených ACT v porovnaní s bunkami v skupine s LPS. Mitochondriálna dysfunkcia môže súvisieť so zvýšenou hladinou ROS v bunke. Analýza prietokovou cytometriou odhalila, že obsah ROS bol preťažený v skupine LPS (obr. 6e, 6f). Našťastie ACT odstránil nadmerné ROS. Naznačuje, že ACT môže obnoviť funkciu mitochondrií odstránením ROS.

ACT obnovila funkciu mitochondrií prostredníctvom zvýšenia regulácie PGC-1 a UCP-2

Koaktivátor peroxizómového proliferatívneho aktivovaného receptora-1 (PGC-1) hrá dôležitú úlohu v mitochondriálnej biogenéze[15]. Stimulácia LPS znížila expresiu PGC-1 s prejavom dysfunkcie mitochondrií. Je pozoruhodné, že expresia mRNA génu PGC{1}} a proteínu boli významne zvrátené pôsobením ACT v bunkách BV-2 ošetrených LPS (obr. 7a). Bolo tiež známe, že mitochondriálny uncoupling protein-2 (UCP-2) reguluje mitochondriálne funkcie. Ako downstream proteín PGC-1 môže kontrolovať LPS-indukovanú depolarizáciu MMP a produkciu ROS. Nedávne správy naznačujú, že je ústredným prvkom procesu mikrogliálnej aktivácie s opačnou reguláciou polarizácie M1 a M2[16]. Výsledky Western blot ukázali, že hladina proteínu UCP{0}} sa po stimulácii LPS znížila. Spoločná liečba LPS a ACT by mohla zvýšiť expresiu UCP-2 v porovnaní s liečbou LPS. Hladina expresie mRNA UCP-2 tiež vykazovala podobné zmeny (obr. 7b). Celkovo vzaté, ACT obnovil funkciu mitochondrií prostredníctvom upregulácie PGC-1 a UCP-2.

ACT potlačil polarizáciu mikroglie M1 prostredníctvom obnovenia mitochondriálnej funkcie prostredníctvom aktivácie AMPK

AMP-aktivovaná proteínkináza (AMPK), ako kľúčový senzor bunkovej energie, hrá dôležitú úlohu pri udržiavaní rovnováhy bunkového metabolizmu. PGC-1 je zároveň následným proteínom AMPK. Výsledky odhalili, že LPS inhiboval aktiváciu AMPK, čo viedlo k poruchám bunkového metabolizmu a mitochondriálnej dysfunkcii. Je pozoruhodné, že ACT by mohol v závislosti od dávky zvýšiť proteínovú expresiu p-AMPK (obr. 8a). Navrhuje sa, že ACT môže zvýšiť expresiu PGC-1 a obnoviť mitochondriálnu funkciu aktiváciou signálnej dráhy AMPK. V tejto štúdii, aby sa zistilo, či aktivácia AMPK prispela k regulačnému účinku ACT na polarizáciu M1/M2, sa na inhibíciu účinku AMPK použila zlúčenina C (CC). Na rozdiel od zníženej hladiny NO v skupine liečenej ACT, CC čiastočne blokoval účinok ACT na hladinu NO (obr. 8d). Na základe týchto výsledkov môže ACT regulovať polarizáciu M1/M2 buniek BV{11}} aktiváciou AMPK.

ACT sa viaže na a inhibuje NF-KB, ako aj aktivovaný AMPK

Molekulárne dokovanie sa použilo na potvrdenie, či sa ACT viaže na proteíny NF-KB a AMPK. Zistenia ukázali, že väzbová energia ACT a NF-κB bola - 8,4 kcal/mol, väzbová energia ACT a AMPK bola - 10,8 kcal/mol. Významné poznatky potvrdili, že ACT sa priamo viaže na NF-κB a AMPK (obr. 9). Následne sa ďalej skúmali možné väzbové režimy a interakcie vo vnútri aminokyselinového vrecka, vrátane Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 a Tyr A227 z NF -KB (obr. 9c), ako aj Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 a Thr A224 (obr. 9f). Tieto výsledky naznačujú, že ACT môže priamo ovplyvniť NF-KB a AMPK, aby zoslabil polarizáciu BV-2 mikroglie M1 a podporil fenotyp M2.