Akútne vystavenie kože ultrafialovému svetlu spúšťa zápal obličiek sprostredkovaný neutrofilmi

My a iní sme ukázali, že UV svetlo indukuje rýchlu infiltráciu neutrofilov do kože (6, 7). Hoci neutrofily sú hlavnými prispievateľmi k zápalu v miestach lokálneho poranenia, nedávno sa zistilo, že neutrofily môžu byť domovom aj orgánov vzdialených od primárneho miesta zápalu (8–10), kde prispievajú k poškodeniu pľúcneho tkaniva prostredníctvom produkcie reaktívneho kyslíka. druhov (ROS) (11) alebo aktivovať adaptívny imunitný systém v lymfatických uzlinách a kostnej dreni (9, 12). U SLE sa predpokladá, že neutrofily hrajú dôležitú úlohu pri lokálnych aj systémových ochoreniach. Neutrofily sú prítomné v kožných léziách pacientov so SLE (13, 14) a vobličkytkaniva pacientov s LN (15, 16). Vysoká expresia neutrofilného génového podpisu je silným prediktorom aktívneho ochorenia, vrátane LN a kožných vzplanutí (17, 18). Prozápalové granulocyty s nízkou hustotou (LDG) sú zvýšené najmä u pacientov s kožným ochorením (19). Zatiaľ čo tieto zistenia implikujú neutrofily v lokálnom poškodení tkaniva pri SLE, či neutrofily poskytujú patogénne spojenie medzi zápalom kože apoškodenie obličieknie je pochopené.

Aby sme objasnili, ako vystavenie pokožky UV žiareniu ovplyvňujeobličkya úlohu, ktorú v týchto procesoch zohrávajú neutrofily, sme hodnotili zmeny vobličkovégénová expresia v súlade s migráciou neutrofilov. Zistili sme, že akútne vystavenie kože UV žiareniu stimuluje zápalové procesy voblička,vrátane expresie endotelových adhéznych molekúl, zápalových mediátorov, markerov poranenia a prechodnej proteinúrie. Predovšetkým sme zistili, že neutrofily migrovali doobličkypo vystavení UV svetlu spôsobom závislým od IL{0}}A, lokalizované do tubulointersticiálnych (TI) oblastí, kde vykazovali prozápalové fenotypy. Blokovanie prenosu neutrofilov liečbou anti-G-CSF imunoglobulínom (IgG) bolo zrušenéobličkovézápal a zabránil up-regulácii markerov tubulárneho poškodenia. Tieto zistenia spolu ukazujú, že vystavenie kože UV žiareniu spúšťa subklinickéobličkovézápalové a úrazové procesy sprostredkované neutrofilmi.

Výsledky

Vystavenie kože UV žiareniu spôsobuje subklinické poškodenie obličiek.Expozícia slnečnému žiareniu bola spojená so zhoršením systémových symptómov a výskytom vzplanutí ochorenia u pacientov so SLE, vrátane nefritídy (2–4). Preto sme sa najprv pýtali, či akútny sterilný zápal v koži vyvolaný jediným vystavením ultrafialovému B (UVB) svetlu (500 mJ/cm2) u čiernych 6 (B6) myší vedie k zmenámobličkyvrátane zápalu, poranenia a proteinúrie (obr. 1A). Pľúca boli vybrané ako kontrolný orgán, pretože pri SLE nebola hlásená žiadna súvislosť medzi fotosenzitivitou a klinickým ochorením pľúc. Celkom 500 mJ/cm2 UVB svetla u myší B6 bolo definovaných ako dve minimálne erytematózne dávky (20), referenčná dávka používaná pri protestoch ľudí (21). Analýza génovej expresie perfundovanýchobličky tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-zložiťobličkovéindukcia v s100A9, neutrofilný mediátor spojený spoškodenie obličiek(22), ako aj zvýšená expresia s100A6, proteín viažuci vápnik spojený s tubulárnym poškodením (23) (obr. 1 D a E). Zatiaľ čo indukcia s100A9 bola detegovaná v pľúcach, expresia génu s100A6 zostala v pľúcach nezmenená (príloha SI, obr. S1). Zápalová odpoveď vobličkybola tiež spojená so skorým zvýšením expresie il{0}} (1. a 2. deň po UV), zatiaľ čo v tnf alebo il-6 bola minimálna alebo žiadna zmena (obr. 1F). Expresia Il-1 nebola zistená v pľúcach do 6 dní po vystavení kože UVB svetlu (príloha SI, obr. S1). Rýchla indukcia expresie cxcl12, chemokínu vylučovaného glomerulami a tubulmi a podieľa sa napoškodenie obličiek(24), bol tiež nájdený vobličkyale nie pľúca (obr. 1G a príloha SI, obr. S1). Poranenie kože vyvolané UVB svetlom preto rýchlo podnecujeobličkovéprozápalové procesy, zatiaľ čo v pľúcach sa pozoruje menej zmien.

Okrem prozápalovej odpovede pozorovanej voblička,proteinúria aj pomer albumín/kreatinín v moči sa zvýšili v prvých dňoch po vystavení kože UVB svetlu (obr. 1 H a I). Tento rýchly účinok nafunkcie obličiekbol sprevádzaný up-reguláciou v expresii lipokalínu-2 apoškodenie obličiekmolekula 1 (kim{1}}) (obr. 1 J a K), markery tubulárnejpoškodenie obličiekktoré sa pozorujú aj v LN (25, 26). Napriek prechodnej povahe proteinúrie, expresia týchtopoškodenie obličiekmarkery pretrvávali až do 6. dňa (obr. 1 J a K), čo pravdepodobne odrážalo opravu tkaniva.

Zápal kože vyvolaný UV svetlom vedie k migrácii neutrofilov do obličiek.Aby sme zistili, či sa neutrofily podieľajú na systémovej zápalovej odpovedi na UVB svetlo, skúmali sme kinetiku akumulácie neutrofilov v koži ožiarenej UV svetlom, ako aj v slezine,oblička,a pľúca myší C57BL/6 J (B6), kmeňa, ktorý najlepšie napodobňuje kožné zmeny na UVB svetlo v ľudskej koži (obr. 2A) (27). Po akútnej expozícii kože UVB svetlu sa počet neutrofilov v koži zvýšil sedemnásobne v priebehu 24 hodín a zostal zvýšený počas 6 dní v porovnaní so základnými hladinami pred UV žiarením (D-1) ​​(obr. 2B). Toto bolo sprevádzané znížením počtu neutrofilov v kostnej dreni a päťnásobným zvýšením počtu cirkulujúcich krvných neutrofilov v dňoch 1 až 6 (obr. 2 C a D). Je zaujímavé, že v rovnakom časovom rámci sa neutrofily zvýšili v slezine, pľúcach aobličky(Obr. 2 Príloha E–G a SI, Obr. S2A). Presná kinetika sa medzi jednotlivými orgánmi líšila, pričom vrchol dosiahla 1. deň v pľúcach a 2. až 6. deň v pľúcachobličkya slezina (obr. 2 E–G). Vobličky, neutrofily väčšinou lokalizované v tubulointersticiálnej oblasti vrátane vaskulatúry, ako je indikované farbením neutrofilnej elastázy (NE) v blízkosti alebo kolokalizované s adhéznou molekulou krvných doštičiek/endotelových buniek-1 (PECAM{1}}/CD31 (obr. 2H). Reprezentatívne obrázky na obr. 2H ukazujú neutrofily v alebo okolo intersticiálnej vaskulatúry (plné biele šípky) a v interstíciu (bodkované biele šípky), s občasnými neutrofilmi, ktoré sa tiež nachádzajú v glomeruloch (žlté šípky). Podobná lokalizácia bola detekovaná anti-Ly6G imunofluorescenčným (IF) farbením (príloha SI, obr. S2B).

Aby sme určili, či iné vrodené imunitné bunky vykazovali lokálne a systémové reakcie podobné neutrofilom, skúmali sme distribúciu monocytov (CD11b plus Ly6C plus Ly6G-) v rovnakých časových bodoch po vystavení UVB svetlu. Zatiaľ čo monocyty boli tiež prijímané do kože, bolo detegované len malé množstvo infiltrujúcich monocytovobličkyna 6. deň po vystavení UVB žiareniu (∼2-násobok oproti ∼10.5-násobnému zvýšeniuobličkyneutrofily) (obr. 2F a SI príloha obr. S3). V pľúcach alebo slezine nebolo zistené žiadne zvýšenie počtu monocytov (príloha SI, obr. S3), čo naznačuje, že systémová odpoveď na poškodenie UV žiarením bola relatívne selektívna pre neutrofily.

Infiltráciu neutrofilov do kože sprevádzali histologické zmeny vrátane skorého zápalu dermy a smrti epidermálnych buniek (1. a 2. deň), po ktorých nasledoval rozvoj akantózy a hyperkeratózy s tvorbou sérocelulárnej kôry v niektorých prípadoch (6. deň) (SI Dodatok, obr. S4). Predovšetkým sa po vystavení UVB svetlu neobjavili žiadne otvorené kožné lézie, čo naznačuje, že pozorovaná infiltrácia imunitných buniek sa vyskytla za sterilných podmienok, hoci nemožno vylúčiť príspevok zmeneného mikrobiómu kože (20).

Tieto zistenia spolu ukazujú, že vystavenie kože jedinej dávke UVB svetla mobilizuje neutrofily do lokálneho miesta zápalu, ako aj do vnútorných orgánov, vrátaneoblička,sprevádzaná krvnou neutrofíliou. Zatiaľ čo celkové migračné vzory boli podobné u samcov aj samíc myší, infiltrácia neutrofilov do kože bola rýchlejšia u samíc v porovnaní so samcami (obr. 2B). Na rozdiel od toho, epidermálne poškodenie stripovaním pásky neviedlo k migrácii neutrofilov doobličkynapriek podobným úrovniam infiltrácie neutrofilov a zápalovej odozvy a poranenia tkaniva, aké je vidieť pri vystavení UV svetlu (príloha SI, obr. S5), čo naznačuje, že systémová diseminácia neutrofilov nie je spoločná pre všetky formy sterilného poškodenia kože.

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

IL-17A podporuje získavanie neutrofilov po vystavení pokožky UV žiareniu.Prieskum chemotaktických a zápalových mediátorov v koži odhalil významnú upreguláciu génovej expresie neutrofilných chemokínov a zápalových cytokínov cxcl1, cxcl5/6, g-csf a il-1 1 do 2 dní po vystavení UV žiareniu (obr. 3 A–D). Rýchly a pretrvávajúci nárast expresie s100A9 zodpovedal kinetike infiltrácie neutrofilov do kože (obr. 2B a SI príloha, obr. S6), zatiaľ čo cytokíny il-6, tnf a il-33 sa prechodne zvýšili a vrátili sa k základnej expresii do dňa 6 (príloha SI, obr. S6). Na rozdiel od toho, il{16}}a bol zvýšený iba na 6. deň (príloha SI, obr. S6), čo pravdepodobne odráža reparatívnu funkciu. Prechodná (1 až 2 d) prítomnosť monocytov v koži (príloha SI, obr. S3) bola paralelná s up-reguláciou chemokínov špecifických pre monocyty ccl4 a ccl2 (príloha SI, obr. S6). Podobne ako pri akumulácii neutrofilov v koži samíc myší (obr. 2B), akumulácia monocytov v koži sa tiež vyskytla skôr u samíc ako u samcov (príloha SI, obr. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-násobok kožnej indukcie v expresii g-csf počas 1. a 2. dňa po UV (obr. 3C). Aby sme určili, či je indukcia týchto cytokínov relevantná pre mobilizáciu neutrofilov, najprv sme kvantifikovali koncentrácie cytokínových proteínov v krvi, čo odhalilo silné a trvalé (10- až 100-násobné) zvýšenie koncentrácie v plazme IL-17A 6 až 24 hodín po vystavení UV svetlu (obr. 3F) spolu s prechodným (vrchol po 6 hodinách) zvýšením IL-6 a IL-12, cytokínov, ktoré môže byť po prúde od IL-17A (28) (obr. 3 G a H). Nebolo pozorované žiadne zvýšenie plazmatických koncentrácií IFN , GM-CSF, TNF , IL-10, IL{20}}, IL{21}} alebo IL1. Aby sme určili, či je IL-17A nevyhnutný na nábor neutrofilov indukovaný UVB, zablokovali sme účinok IL-17A neutralizačnou protilátkou pred vystavením UV žiareniu (obr. 3I). Anti–IL-17IgG významne tlmila krvnú neutrofíliu (obr. 3J) a zoslabila prílev neutrofilov do exponovaného kožného tkaniva (obr. 3K a príloha SI, obr. S7A) aobličky(obr. 3L a príloha SI, obr. S7B). Tieto zistenia ukazujú, že nábor neutrofilov v reakcii na UV svetlo je sprostredkovaný, aspoň čiastočne, IL-17A.

Neutrofily sprostredkovávajú zápal obličiek po vystavení kože UV žiareniuSvetlo.Zistiť, či za zápalové zmeny v tele sú zodpovedné neutrofilyobličky following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-násobne po vystavení UV žiareniu, čo naznačuje chemotaktickú úlohu G-CSF pri získavaní neutrofilov v reakcii na UV svetlo, sme inhibovali mobilizáciu neutrofilov z kostnej drene blokovaním G-CSF, ako je znázornené na obr. 4A. Neutralizácia G-CSF zabránila krvnej neutrofílii, ako aj náboru neutrofilovobličkypo vystavení pokožky UVB svetlu (obr. 4 B a C). Predovšetkým, ako už bolo uvedené v rôznych modeloch (29, 30), blokovanie G-CSF nezmenilo počet monocytov vobličky(obr. 4D). Znížená migrácia neutrofilov doobličkybol sprevádzaný výrazným zníženímobličkovéexpresie adhéznych molekúl vcam{0}} a e-selektínu (obr. 4 E a F), ako aj zápalových mediátorov s100A9 a il-1 1 d po expozícii UVB (obr. 4 G a H). Okrem toho markery poškodenia tkaniva lipokalín-2 a kim{8}} vobličkyboli významne znížené u myší vystavených UV žiareniu liečených G-CSF blokujúcou protilátkou v porovnaní s izotypovo liečenými zvieratami vystavenými UV žiareniu (obr. 4 I a J). Ako sme už uviedli (6), akútne vystavenie kože UVB svetlu spustilo reakciu na interferón typu Iobličky(obr. 4K). Blokovanie G-CSF významne znížilo, ale nezrušilo úplne IFN skóre (obr. 4K). Zatiaľ čo prítomnosť neutrofilov vobličkybola potrebná pre akútne zápalové a poranenia pozorované 1 deň po vystavení kože UV svetlu (obr. 4), v tomto časovom bode neboli pozorované žiadne rozdiely v proteinúrii, pretože vrchol proteinúrie sa vyskytol okolo 4. dňa po vystavení UV žiareniu (obr. 1 H a ja). Tieto údaje spolu naznačujú, že neutrofily sú zodpovedné za zápalovú odpoveď a priamo alebo nepriamo prispievajú k indukcii interferónu typu I vobličkypo vystavení pokožky UV žiareniu. Podobne ako výsledky získané s anti-G-CSF IgG, podanie neutralizačnej anti-IL{1}} protilátky čiastočne potlačilo migráciu neutrofilov doobličkya viedlo k zníženiu génovej expresieobličkyzápalové (vcam{0}} a s100A9) a markery poranení (lipokalín-2 a kim{4}}), hoci štatisticky významné bolo iba zníženie expresie kim{5}} (príloha SI, obr. . S7 C–F)

Subpopulácia obličkových neutrofilov je reverzne transmigrovaná, fenotyp detegovaný aj v krvi pacientov so SLE.Zatiaľ čo sa dlho predpokladalo, že neutrofily vstupujúce do miest infekcie alebo sterilného zápalu následne podliehajú apoptóze a sú rýchlo odstránené makrofágmi, množstvo štúdií odhalilo, že niektoré neutrofily sa pohybujú obojsmerným spôsobom, to znamená, že po vstupe do tkaniva transmigrujú. späť do krvného riečišťa a infiltrovať do iného miesta, čo je proces označovaný ako reverzná transmigrácia (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). Skúmať, či neutrofily, ktoré sú domovomobličkypo expozícii kože UVB svetlu prechádzajúcemu cez exponovanú kožu sme študovali migráciu neutrofilov na fotoaktivovateľnom myšom modeli B6 (fotoaktivovaný ľudským ubikvitínom C [UBC] [PA]-zelený fluorescenčný proteín [GFP]).

Experimentálna schéma je znázornená na obr. 5A; 1 deň po vystavení kože jednej dávke UVB svetla bola koža vystavená fialovému svetlu (405 nm), takže infiltrujúce imunitné bunky boli fotokonvertované na GFP-pozitívne bunky. Fotokonvertované neutrofily (GFP plus Ly6G plus) sa potom kvantifikovali v perfúziiobličkynasledujúci deň. Analýza prietokovou cytometriou odhalila, že -20 percent neutrofilov infiltrujúcich obličky bolo GFP pozitívnych po odčítaní signálu pozadia (-10 percent) (obr. 5B). Na rozdiel od modelov sterilného zápalu v pečeni alebo cremasterovom svale (8, 10) sme nezistili fotokonvertované neutrofily v pľúcach, pravdepodobne preto, že v pľúcach sa v deň 2 našlo len málo neutrofilov (obr. 2F). Testovať, či GFP plus neutrofily vobličkyextravazovali z kožného tkaniva vystaveného UV žiareniu alebo boli PA intravaskulárne, porovnali sme zmeny v počte GFP plus neutrofilov získaných zobličkymyší, u ktorých bola tá istá koža, ktorá bola vystavená UV svetlu, PA s fialovým svetlom o deň neskôr (skupina I) oproti myšiam, ktorých koža susediaca s týmto vystavením UV svetlu bola PA s fialovým svetlom o deň neskôr (skupina II, diagram v prílohe SI, obr. S8A). Hoci medzi skupinami neboli žiadne rozdiely v percentách cirkulujúcich neutrofilov (príloha SI, obr. S8B), väčší nárast GFP plus neutrofilov bol pozorovaný vobličkymyší, kde koža vystavená UV žiareniu bola tiež PA (skupina I) v porovnaní s nedostatočným zvýšením GFP plus neutrofilov u myší, kde koža bez UV žiarenia bola PA (skupina II) (príloha SI, obr. S7B). V skupine II boli počty neutrofilov podobné pozadiu GFP pozitivity na obr. 5B (príloha SI, obr. S8B).

Zatiaľ čo nízke úrovne GFP plusobličkyneutrofily v skupine II naznačujú, že fialové svetlo nespôsobuje PA cirkulujúce bunky v koži nevystavenej UV žiareniu, je možné, že vystavenie UV žiareniu zmenilo interakcie neutrofilov s krvnými cievami v koži, čo umožnilo väčšiu fotokonverziu a následnúobličkyprístup. Na určenie relatívnych podielov neutrofilov TEM sme kvantifikovali expresiu povrchových markerov používaných na charakterizáciu neutrofilov, ktoré podstúpili rTEM: CXCR4hi (8) a ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Skutočne, GFP plusobličkyneutrofily exprimovali vyššie hladiny CXCR4 v porovnaní s GFP plus neutrofily v koži alebo GFP- neutrofily vobličky(Obr. 5C). z

záujem,obličkovéexpresia ligandu CXCR4, cxcl12, 1 až 2 dni po vystavení kože UVB svetlu bola súbežná s prítomnosťou neutrofilov CXCR4hi vobličky(Obr. 1G), čo môže poskytnúť chemotaktický stimul na nábor týchto neutrofilov do obličiek. Zaujímavé je, že sme detegovali neutrofily CXCR4hi a ICAM1- hiCXCR1lo v kostnej dreni neskoro po vystavení UV žiareniu (deň 6, príloha SI, obr. S9 B a C), čo naznačuje, že niektoré z týchto neutrofilov sa tiež vrátia späť do kostná dreň podobná tomu, čo bolo hlásené pre rTEM po poškodení pečene alebo vírusovej infekcii kože (12, 36). V súlade s týmito pozorovaniami sme detegovali vyššiu expresiu CXCR4 na krvných neutrofiloch v deň 2 po vystavení UV žiareniu, čo pravdepodobne zachytilo bunky na ceste doobličkya kostnej drene (príloha SI, obr. S9D). Podobne sa zistilo výrazne väčšie percento buniek ICAM1hiCXCR1lo medzi GFP plus neutrofilmi vobličkyv porovnaní s GFP plus neutrofilmi v koži a GFP− neutrofilmi vobličky(Obr. 5D). Fenotyp ICAM1hiCXCR1lo bol detegovaný na ~20 až 35 percentách GFP plus neutrofilov vobličky(Obr. 5D), čo naznačuje, že podskupina neutrofilov, ktoré migrujú doobličkycez kožu vystavenú UV žiareniu to robí reverznou transmigráciou, zatiaľ čo zvyšokobličkyneutrofily sú pravdepodobne aktivované pri cirkulácii cez zapálenú kožu vystavenú UV žiareniu. Subpopulácia neutrofilov ICAM1- hiCXCR1lo bola tiež detegovaná vobličkynormálnych myší B6 vystavených UV svetlu, ktoré nedostali PA (príloha SI, obr. S9A).

Zatiaľ čo fenotypy neutrofilov CXCR4hi a ICAM1hiCXCR1lo boli spojené so zápalovými funkciami a poškodením tkaniva v rôznych myších modeloch (11, 31, 37), na týchto populáciách buniek u ľudí sa vykonalo len málo štúdií. Vzhľadom na vznikajúcu úlohu neutrofilov pri SLE (13, 17, 18) a ich zjavnú heterogenitu (19) sme skúmali, či polymorfonukleárne bunky s normálnou hustotou (PMN) alebo LDG od pacientov so SLE

preukázali reverzne migrujúce fenotypy: CXCR4hi (37, 38) a ICAM1hiCXCR1lo. Profilovanie PMN a LDG prietokovou cytometriou odhalilo vyššiu expresiu CXCR4 na povrchu týchto buniek u pacientov so SLE v porovnaní so zdravými kontrolami (obr. 6 A a C). Okrem toho sme našli malé, ale významne vyššie percento ICAM1hiCXCR1lo PMN v krvi SLE (priemer, 3,5 percenta) v porovnaní so zdravými kontrolami (priemer, 1,4 percenta) (obr. 6B). Je zaujímavé, že populácia neutrofilov LDG (CD15 plus CD14loCD10 plus v mononukleárnych bunkách periférnej krvi [PBMC]) obsahovala väčšie percento buniek ICAM1hiCXCR1lo ako PMN v zdravej krvi (priemer 7,1 percenta) aj v krvi SLE (priemer 29,4 percenta) (obr. 6 B a D). Populácia podobná rTEM bola významne viac zastúpená v LDG od pacientov so SLE v porovnaní so zdravými kontrolami (obr. 6D). Tieto údaje identifikujú prítomnosť neutrofilných fenotypov podobných rTEM v PMN a najmä LDG u pacientov so SLE.

Diskusia

Systémové účinky vystavenia kože UV žiareniu nie sú dostatočne známe. Identifikácia týchto dráh v normálnych základných podmienkach môže informovať o mechanizmoch systémového postihnutia tkaniva po vystavení slnku, ku ktorému dochádza pri ochoreniach, ako je SLE (2–4). Tu uvádzame niekoľko zistení o tom, ako vystavenie slnečnému žiareniu ovplyvňuje obličky. Po prvé, preukázali sme, že akútne vystavenie kože UVB svetlu spúšťa zápalové a poraneniaoblička,vrátane subklinickej proteinúrie. Zaujimave, tietoobličkovézmeny boli sprevádzané infiltráciou neutrofilov do obličiek po zápale kože sprostredkovanom UVB svetlom. Neutrofilná odpoveď bola závislá od IL-17A a G-CSF. Neutrofily v obličkách mali prozápalové fenotypy, o čom svedčí extracelulárna lokalizácia NE, vyšší podiel rTEM (CXCR4hi), tiež známych ako "staré" a ICAM1hiCXCR1lo bunky. Neutrofily sa priamo podieľali na subklinickej liečbepoškodenie obličiek,pretože deplécia neutrofilov viedla k významnému zníženiu expresie adhéznych molekúl, zápalových cytokínov, podpisu IFN-I a markerov poškodenia obličiek po vystavení kože UV žiareniu.

Iné typy poranenia kože, ako je strhnutie pásky a lokálna aplikácia agonistu TLR7, boli zaznamenané na zlepšeniepoškodenie obličiekv niektorých modeloch lupusu, hoci sa predpokladalo, že zlepšenie ochorenia je sprostredkované skôr makrofágmi a dendritickými bunkami než neutrofilmi (39, 40). Po preukázaní, že stripovanie pásky neviedlo k náboru neutrofilov doobličkynavrhujeme, aby sa vystavenie UV svetlu líšilo od iných typov sterilného zápalu kože. Možno to vysvetliť tvorbou fotoproduktov alebo jedinečných zápalových mediátorov po UV poškodení, ktoré pripravia obličku na zápal, rozdielmi v odstraňovaní neutrofilov po UV v porovnaní s odizolovaním pásky alebo inými faktormi. Zistili sme, že UV svetlo spustilo rýchlu a silnú indukciu il-17mediátorovej RNA (mRNA) v koži spolu s vysokými hladinami cirkulujúceho IL-17A proteínu (∼100-násobné zvýšenie) , ktorý bol potrebný na nábor neutrofilov po vystavení UV svetlu. Súbežná 100- až 1,{5}}násobná indukcia v expresii g-csf v koži naznačuje, že os IL-17A/G-CSF je pravdepodobným mechanizmom zodpovedným za navádzanie neutrofílie a neutrofilného tkaniva v reakcii na UV žiarenie. Úloha IL-17A pri regulácii granulopoézy a náboru neutrofilov prostredníctvom indukcie G-CSF je dobre známa v homeostatických podmienkach a niekoľko štúdií identifikovalo IL-17A ako dôležitý pre nábor neutrofilov do miest sterilný zápal (41, 42). Pri lupuse sa zvýšená expresia IL-17A nachádza v kožných léziách (43) a zvýšené hladiny cirkulujúceho IL{16}}A sa spájajú s horšími prejavmi ochorenia (44), hoci špecifický vzťah k neutrofilom, patogénna populácia pri tomto ochorení (13, 17, 18), zostáva nepreskúmaná. Okrem svojich priamych účinkov na G-CSF sprostredkovanú mobilizáciu neutrofilov z kostnej drene môže IL- 17A tiež prispievať k usmerňovaniu neutrofilov doobličkystimuláciou expresie adhéznych molekúl (napr. VCAM-1 a E-Selectin) naobličkovéendotel (45, 46).

Použitím rovnakého modelu akútnej expozície UV žiareniu sme nedávno uviedli, že jedna dávka UV svetla spustila lokálnu a systémovú odpoveď IFN-I, ktorá bola potrebná na účinný nábor neutrofilov do kože (6). Keďže sa ukázalo, že IFN-I indukuje produkciu IL-17A (47), je pravdepodobné, že tieto dráhy buď nezávisle alebo v zhode vedú k náboru a migrácii neutrofilov sprostredkovaným UV svetlom, o ktorých tu uvádzame. Zatiaľ čo naše zistenia naznačujú zápalovú úlohu pre IL- 17A, supresívne účinky UVB svetla na signalizáciu IL-17A boli predtým hlásené pri psoriáze, kde vystavenie psoriatickej kože UVB svetlu eliminovalo patogénne T bunky a myeloidné zápalové dendrické bunky (48, 49). Keďže psoriatická koža je na rozdiel od zdravej pokožky bohatá na T bunky produkujúce a odpovedajúce IL, rozdiel v zložení buniek pravdepodobne určí odpoveď na UVB svetlo vrátane rozsahu potlačenia IL sprostredkovaného UVB svetlom -17Expresia receptora (50). Dávka UV môže tiež určiť, či sa objaví zápalový alebo terapeutický účinok: nízke dávky sú spojené s protizápalovými a imunosupresívnymi následkami (51), pravdepodobne inhibíciou reakcií CD8 T buniek (52).

Neutrofily hrajú počas zápalu tkaniva viacero úloh. Keď sú aktivované molekulárnymi vzormi spojenými s patogénmi a molekulárnymi vzormi spojenými s poškodením (DAMPS) alebo zapojením receptora, neutrofily priamo prispievajú k poškodeniu tkaniva uvoľňovaním proteáz, ROS a extrúziou neutrofilných extracelulárnych pascí (NET) (53, 54). Neutrofily môžu tiež podporovať opravu tkaniva fagocytózou bunkového odpadu a tým, že umožňujú revaskularizáciu tkaniva (8). Pri SLE je podpis neutrofilného génu silným prediktorom aktívneho ochorenia vrátane LN a kožného lupusu (17, 18). Neutrofily sa nachádzajú v kožných léziách (13, 14), ako ajobličkybioptické vzorky (15, 16) pacientov so SLE a ich zápalové vlastnosti sa čiastočne pripisujú tvorbe NET (16). Tento proces zahŕňa zvýšenú produkciu ROS (55), uvoľňovanie mitochondriálnej DNA (55) a uvoľňovanie a indukciu zápalových proteínov, ako sú s100A9 (56), IL-1b (57) a interferóny typu I (55 , 58). Naše zistenia, že inhibícia migrácie neutrofilov do obličiek zrušila s100A9 a významne znížila expresiu IL-1b aobličkySkóre IFN naznačuje, že v hre môžu byť podobné zápalové funkcie. Relevantné pre ochorenie obličiek pri SLE, neutrofily lokalizované hlavne v endoteli TI, mieste zvýšenej expresiepoškodenie obličiekmarkery kim{0}} a lipokalín-2 v tkanivách obličiek LN (59,60). Proteinúria môže vzniknúť v dôsledku nadmernej permeability glomerulárnej bariéry pre proteíny v dôsledku zhoršenej reabsorpcie proteínu tubulmi alebo kombináciou týchto mechanizmov (61). Poškodenie TI u pacientov so SLE je častým patologickým nálezom v obličkách LN, vrátane tých s miernym glomerulárnym poškodením (61, 62). Ukázalo sa, že poškodenie TI predpovedá závažnosť LN (63, 64), ale mechanizmy, ktoré ho spúšťajú, nie sú známe. Keďže zvýšený kim{9}} a lipokalín{10}} sú známe markery poškodenia TI pri SLE (26, 65) a blokujúce migráciu neutrofilov doobličkyinhibovali ich expresiu, navrhujeme, že prechodná proteinúria pozorovaná po vystavení UV žiareniu je dôsledkom neutrofilmi sprostredkovaného subklinického zápalu TI (65). Zvýšená expresia vcam{2}} obličiek, ďalší marker poškodenia TI pri SLE (66), ďalej podporuje tento model.

Okrem šírenia zápalu na lokálnych miestach sterilného alebo infekčného poranenia sa ukázalo, že neutrofily sa ukrývajú vo vzdialených orgánoch (8–10), kde v závislosti od kontextu prispievajú k poškodeniu tkaniva prostredníctvom produkcie ROS (11) alebo aktivujú adaptívny imunitný systém v lymfatických uzlinách a kostnej dreni (9, 12). Zápalová povaha týchto neutrofilov sa pripisuje ich schopnosti opustiť primárne miesto poškodenia a migrovať na sekundárne miesta, to znamená podstúpiť rTEM (9–11, 31–34). Naše zistenia, že PA buniek obsahujúcich GFP v koži po vystavení UV žiareniu viedli k detekcii GFP plus neutrofilov vobličkys fenotypom rTEM naznačujú, že subpopuláciaobličkovéneutrofily reverzne migrovali z kože vystavenej UV žiareniu (GFP plus neutrofily tvoria ~20 percentobličkyneutrofily a z nich je 20 až 35 percent rTEM; preto rTEM tvoria 4 až 7 percent z celkového počtuobličkyneutrofily). Tento podiel rTEM je porovnateľný s podielom hláseným po sterilnom poškodení pečene (~ 9 percent) (36) a ischemicko-reperfúznom poškodení (~ 8 percent) (11). Za iných okolností sa ukázalo, že rTEM sú prozápalové (10, 11) a majú zhoršenú apoptózu (35), čo vedie k možnosti, že zohrávajú úlohu pri UV-indukovanýchpoškodenie obličiek.Zvýšená expresia CXCR4 na týchto neutrofiloch je obzvlášť relevantná ako zhoda okolnostíobličkovébola pozorovaná expresia cxcl12, ligandu CXCR4 exprimovaného podocytmi a tubulmi (24), čo pravdepodobne poskytuje chemotaktický signál pre túto populáciu neutrofilov. Zvýšená expresia CXCR4 na imunitných bunkách spojená s vysokými hladinamiobličkovéCXCL12 boli identifikované u pacientov so SLE s LN (67) a táto dráha sa podieľala na lupuse, ako aj na ischémii-reperfúziipoškodenie obličieku myší (24, 68). Okrem toho, že je markerom rTEM, zvýšená expresia CXCR4 je tiež indikátorom „starých“ neutrofilov, ktoré môžu sprostredkovať zápalové reakcie poškodzujúce tkanivo (38). Presná úloha CXCR4 pri nábore neutrofilov doobličkymožno skúmať pomocou antagonizmu CXCR4, ako sa to predtým robilo v iných modeloch sterilného poškodenia (38).

Tkanivovo špecifická migrácia neutrofilov a mechanizmy zodpovedné za rozdielnu expresiu adhéznych molekúl v rôznych orgánoch nie sú dobre známe (69). Vyššie hladiny expresie chemokínu cxcl12 vobličkyale nie pľúca by mohli vysvetliť preferenčnú prítomnosť neutrofilov CXCR4hi v obličkách. Okrem toho indukcia expresie vcam{1}} a e-selektínu v obličkách v porovnaní so žiadnou zmenou expresie v pľúcach pravdepodobne prispieva k preferenčnému získavaniu a zadržiavaniu neutrofilov v obličkách. 5- až 6-násobné zvýšenie expresie s100A9 v pľúcach v porovnaní s 30- až 60-násobným zvýšením v obličkách, ako aj 6-násobným zvýšením v expresii il{10}}b v pľúcach v porovnaní s 16-násobným zvýšením v obličkách ďalej naznačujú tkanivové rozdiely v zápalovej odpovedi. Zníženie infiltrácie neutrofilov do obličiek po neutralizácii G-CSF možno pripísať zníženiu počtu cirkulujúcich neutrofilov a aktivácii neutrofilov, ako aj zníženiu lokálnej expresie vcam{13}} a e-selektínu. Nemôžeme si však byť istí, či sa počiatočná zvýšená regulácia týchto adhéznych molekúl po expozícii kože UV žiarením pripisuje cytokínom/DAMPS získaným z kože, alebo či neutrofily prostredníctvom uvoľňovania serínových proteáz priamo prispievajú k ich expresii, ako sa ukázalo v iných súvislostiach (70). Bez ohľadu na mechanizmy a na vedomie, že sme nevykonali komplexnú analýzu všetkých tkanív, naše štúdie poskytujú dôkaz o určitej orgánovej selektivite v systémových účinkoch sprostredkovaných UV svetlom. Budúce štúdie sa budú zaoberať tkanivovo špecifickými funkčnými dôsledkami systémového šírenia neutrofilov, napríklad únikom vaskulárneho albumínu a tvorbou edému v pľúcach (11, 36).

U pacientov so SLE je ťažké jednoznačne dať do súvisu expozíciu kože UV žiareniu s exacerbáciami systémového ochorenia, keďže existujú významné rozdiely (1 až 3 týždne) vo viditeľnej fotosenzitívnej reakcii u rôznych jedincov (21). Okrem toho subklinickýpoškodenie obličieksa môže ľahko vynechať, kým následné vystavenie UV žiareniu neznásobí účinky. Zatiaľ čo sme zistili, že je to sprostredkované neutrofilmizápal obličiekv reakcii na UV svetlo nespôsobuje klinické ochorenie u zdravých myší, takýto mechanizmus môže prispieť k vzplanutiu LN u pacientov s fotosenzitívnym lupusom viacerými spôsobmi. Zapojenie Fc receptora imunitnými komplexmi by mohlo zvýšiť nábor neutrofilov, čo vedie k uvoľneniu ROS a proteázy (71); zvýšená kapacita lupusových neutrofilov a LDG produkovať NET, ktoré u pacientov so SLE nie sú účinne odstraňované (72), by mohla viesť k uvoľneniu proteáz poškodzujúcich tkanivo (73), šíreniu odpovede IFN-I (58) alebo priame poškodenieobličkyendotel vytváraním cievneho poškodenia a presakovania (16). Okrem toho základné rozdiely v koži lupusu, ako je zvýšená signalizácia IFN-I (5, 74) a defekty v ochrannej populácii Langerhansových buniek (75), by mohli informovať o rozsahu a povahe systémových reakcií sprostredkovaných neutrofilmi. Sledovanie migrácie neutrofilov spojené s vyšetrovaním autoprotilátok, akumuláciou apoptotických buniek a nízkymi hladinami komplementu možno riešiť pomocou nových modelov lupusu, ako sú geneticky definované trojité mutanty (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− a Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) alebo iné kmene lupusu po vystavení UV žiareniu.

Presné mechanizmy spájajúce neutrofily so zápalom pri SLE môžu byť navyše ovplyvnené fenotypom neutrofilov/LDG, keďže heterogenita v rámci týchto populácií sa stala zreteľnejšou (77). Naše zistenia o zvýšených cirkulujúcich populáciách CXCR4 a ICAM1hiCXCR1lo (rTEM), najmä v SLE LDG, túto heterogenitu ďalej dopĺňajú a naznačujú, že niektoré prozápalovejšie granulocyty v krvi môžu mať predchádzajúcu „tkanivovú skúsenosť“, to znamená pobyt v postihnutých orgánových tkanivách, ako je koža, pred systémovou disemináciou. Fenotypy rTEM boli predtým hlásené v synoviálnej tekutine a cirkulujúcich neutrofiloch pacientov s reumatoidnou artritídou (35, 78) a pri akútnom poškodení pľúc spojenom s pankreatitídou (79). Ich úloha v SLE si vyžaduje ďalšie vyšetrovanie.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN

Materiály a metódy

Myši.Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of Washington, Seattle. Počiatočné experimenty sa uskutočňovali s použitím samcov aj samíc myší C57BL/6J (Jackson Laboratory, 3 až 4 mesiace staré, obr. 1 a 2). Vo všetkých nasledujúcich experimentoch sa použili samice myší. PA štúdie sa uskutočnili na B6. Samice myší Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J (Jackson Laboratory, 3 až 4 mesiace staré). Tieto myši boli vytvorené injekciou transgénneho vektora nesúceho PAGFP (variant T203H) pod transkripčnou kontrolou promótora ľudského ubikvitínu C do embryí C57BL/6. Zvieratá boli chované v podmienkach bez patogénov a udržiavané v cykloch svetlo-tma počas 12 hodín s ad libitným prístupom k potrave a vode. Experimenty na všetkých zvieratách sa uskutočňovali v rovnakom čase dňa, aby sa zabránilo vplyvu cirkadiánneho rytmu na migráciu neutrofilov (38).

Vystavenie UVB svetlu a odizolovaniu pásky.Dorzálny aspekt samcov a samíc myší C57BL/6 bol oholený najmenej 24 hodín pred ožiarením UVB svetlom a v experimentoch boli použité iba myši s nepigmentovanou pokožkou. Myši boli anestetizované izofluránom a vystavené jednej dávke UVB svetla (500 mJ/cm2) s použitím žiaroviek FS40T12/UVB (National Biological Corporation), s vrcholom emisie medzi 300 a 315 nm. Energia UVB svetla na chrbtovom povrchu sa merala rádiometrom Photo light IL1400A vybaveným detektorom SEL240/UVB (International Light Technologies). Myši boli usmrtené 1, 2 alebo 6 dní po vystavení UVB svetlu a neožiarené myši boli použité ako kontroly (D-1) (obr. 2A). Odstránenie epidermálnej pásky sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie (7), a koža aobličkyboli hodnotené 24 hodín po poranení

Inhibícia IL-17A a G-CSF.Myši boli ošetrené intravenózne 100 ug purifikovaného potkanieho anti-myšieho IL-17A IgG (BioLegend) alebo izotypovej kontroly 3 hodiny pred vystavením UV svetlu (1 x 500 mJ/cm2) (obr. 3I). Prítomnosť neutrofilov v krvi, koži a fyziologickom roztokuobličkytkanivo sa vyhodnotilo prietokovou cytometriou 24 hodín po expozícii UV, ako je opísané nižšie. Migrácia neutrofilov v reakcii na UV svetlo bola inhibovaná intraperitoneálnym ošetrením myší s 50 ug anti-myšej G-CSF monoklonálnej protilátky alebo myšou IgG izotypovou kontrolou (R&D Systems) 24 hodín a 3 hodiny pred vystavením kože UVB svetlu (1 x 500 mJ /cm2) (obr. 4A). Po srdcovej perfúzii sa počet neutrofilov a monocytov vobličkyboli hodnotené prietokovou cytometriou a génovou expresiou pomocou qPCR, ako je opísané nižšie. Ako ďalšia kontrolná skupina boli použité myši, ktoré neboli vystavené UVB svetlu.

Izolácia buniek z rôznych orgánov.Po eutanázii s inhaláciou CO2 sa odobral kúsok dorzálnej kože a až do spracovania sa uchovával v roztoku RPMI (Roswell Park Memorial Institute) na ľade. Krv sa odoberala srdcovou punkciou do injekčných striekačiek potiahnutých kyselinou etyléndiamíntetraoctovou. Srdcová perfúzia sa následne uskutočnila pomocou fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) (-60 ml) cez ľavú komoru po odrezaní pravej predsiene. Úspešná perfúzia bola stanovená pozorovaním dokončeniaobličkya bledosť pľúc. Pľúca, obličky, slezina a obe stehenné kosti sa opatrne vybrali a umiestnili sa do roztoku RPMI na ľade až do spracovania vzorky. Bunky sa izolovali z ekvivalentných oblastí kožného tkaniva (~30 mm2) rozomletím a trávením tkaniva 0,28 jednotiek/ml Liberase TM (Roche) a 0,1 mg/ml deoxyribonukleázy I ( Worthington) v PBS s Ca plus 2 a Mg plus 2 počas 60 minút pri 37 stupňoch s trepaním. Z jedného boli izolované bunkyobličkyna zviera;obličkytkanivá boli rozomleté ​​a štiepené v 2 mg/ml kolagenázy typu I (Worthington) počas 30 minút pri 37 stupňoch podľa publikovaného protokolu. Pľúcne bunky boli zozbierané štiepením tkaniva v PBS (Ca plus 2 a Mg plus 2) s 1 mg/ml kolagenázy typu 1 a 60 U deoxyribonukleázy I. Celé sleziny boli rozdrvené na 40 um bunkové sitko a premyté roztokom RPMI. Celá krv a bunky zo sleziny, kostnej drene, obličiek a pľúc sa ošetrili lyzačným pufrom 1X červených krviniek (RBC) (BD Biosciences). Po izolácii/štiepení boli bunky zo všetkých tkanív filtrované (40 um), premyté PBS a resuspendované v roztoku RPMI pred počítaním.

Farbenie a analýza prietokovou cytometriou.Bunky boli ošetrené Fc Block TruStain FcX (Biolegend) a zafarbené farbivom Zombie Aqua Viability (Biolegend) podľa odporúčaní predajcu. Bunky sa premyli a povrchové farbenie sa uskutočnilo s použitím myších špecifických fluorescenčných protilátok zakúpených od Biolegend. Rôzne populácie myeloidných buniek sa analyzovali v bráne živých imunitných buniek (Zombie Aqua-CD45 plus). Kvantifikovalo sa percento a počet neutrofilov (Ly6CintLy6Ghi) a monocytov (Ly6C plus Ly6G-). Reprezentatívne vrátkovanie prietokovej cytometrie je uvedené v prílohe SI, obr. S10. Percentuálna expresia a priemerná intenzita fluorescencie povrchových markerov v modeli PA (CXCR4, ICAM1 a CXCR1) sa stanovili s použitím kontrol farbenia fluorescencia mínus jedna (FMO) v bráne neutrofilov (Ly6Ghi). Všetky vzorky sa spracovali pomocou prietokového cytometra CytoFLEX (Beckman Coulter) a údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo verzie 10 (Tree Star).

Štúdie fotoaktivácie (PA).Myši UBC-PA-GFP boli oholené a časť chrbta bola ožiarená jednou dávkou UVB svetla (500 mJ/cm2), ako je uvedené vyššie. Iba oblasť pokožky, ktorá bude fotokonvertovaná, bola vystavená UVB svetlu, zatiaľ čo zvyšná pokožka bola pokrytá hliníkovou fóliou. Po 24 hodinách od sterilného poranenia vyvolaného UVB žiarením bola celá oblasť kože ožiarená UVB žiarením vystavená fialovému svetlu (405 nm) pomocou 50 W diódovej lampy s 0,37 numerickou apertúrou (NA) vláknom (Mightex) pri výkone 100 mW (15 minút expozície na plochu). Táto metóda bola optimalizovaná na základe publikovaného protokolu fotokonverzie špecifickej pre kožu (80).Obličkya pľúca boli odobraté a spracované na analýzu prietokovou cytometriou 24 hodín po PA, ako je opísané vyššie. Prístup a časová os sú znázornené v diagrame na obr. 5A. Percento GFP plus neutrofilov vobličkybol porovnaný s tým, ktorý sa našiel u myší za troch kontrolných podmienok: 1) bez UV a bez PA, 2) UV, ale bez PA a 3) bez UV, ale PA. Hladiny expresie CXCR4 a fenotyp ICAM1hiCXCR1lo v rámci neutrofilov GFP plus a GFP− v koži aobličkyboli hodnotené prietokovou cytometriou s použitím fluorescenčne značených protilátok špecifických pre myši zakúpených od Biolegend. Na určenie, či GFP plus neutrofily vobličkypochádza z kože a nie z krvi, koža v jednej skupine myší bola vystavená UV svetlu a PA, ako je opísané vyššie (skupina I), zatiaľ čo v inej skupine bola koža vystavená UV svetlu, ale PA bola vykonaná na priľahlej oblasti kože neboli vystavené UV svetlu (skupina II) (schéma v prílohe SI, obr. S7A).Obličkyboli zozbierané a spracované na analýzu prietokovou cytometriou, ako je opísané vyššie.

Génová expresia a proteomické analýzy.Koža,oblička,a vzorky pľúc boli uložené v roztoku RNAlater (QIAGEN). RNA sa extrahovala pomocou súpravy RNeasy Kit od spoločnosti QIAGEN a komplementárna DNA (cDNA) sa syntetizovala pomocou súpravy na syntézu vysokokapacitnej cDNA (Applied Biosystems). Transkripty zápalových chemokínov, cytokínov a adhéznych molekúl boli kvantifikované pomocou qPCR v reálnom čase s použitím primérov uvedených v prílohe SI, tabuľka S1 a normalizované na priemer hladín transkriptov 18S. Použitá dávka UVB svetla neovplyvnila expresiu 18S v žiadnom z orgánov. Relatívna expresia cieľov mRNA bola stanovená pomocou štandardného vzorca 2^(-Ct) × koeficient. Skóre IFN bolo odvodené z expresie 10 reprezentatívnych génov stimulovaných interferónom (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 a ifi27l2a), ako už bolo opísané (6). Priemer a SD relatívnej expresie každého ISG boli stanovené vobličkymyší, ktoré neboli vystavené UV svetlu (priemerné UV a SDnoUV). Tie sa potom použili na štandardizáciu hladín expresie každého ISG v obličkách liečených myší (IgG izotyp plus UVB alebo a-GCSF plus UVB). Štandardizované hladiny expresie boli potom sčítané pre každú myš, aby sa odvodilo skóre expresie IFN; i=vyjadrenie každého ISG; Génová liečba=relatívna hladina génovej expresie po liečbe; a génová inoUV=relatívna hladina génovej expresie u myší, ktoré neboli vystavené UVB svetlu. ∑ 10 i=1=Geneitreatment-meanGeneinoUV SD(GeneinoUV) . Hladiny proteínov v proteínových extraktoch plazmy a kožného tkaniva sa merali pomocou definovaných panelov analytov LEGENDplex Mouse Inflammation Panel a Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

IF farbenie zmrazených obličkových tkanív.Prekrvené fyziologickým roztokomobličkyboli fixované v 4% paraformaldehyde počas 1 hodiny pri izbovej teplote a po ponorení do 30% sacharózy boli zmrazené v optimálnom reznom médiu (Sakura Finetek). 5-μm tkanivové rezy boli rehydratované v PBS pred farbením IF. Tkanivá boli permeabilizované 0,1 percenta Triton X-100 v PBS a následne blokované v PBS plus 0,1 percenta Triton X-100/5 percent BSA (hovädzí sérový albumín)/5 percent králičieho séra . NE a endotelové bunky sa detegovali farbením anti-myšacím NE Cy5 (1:100, Bioss) a anti-myším PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), v danom poradí, pri 4 stupňoch cez noc. Prítomnosť neutrofilov vobličkybola potvrdená farbením anti-myšou Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Tkanivá boli pripevnené pomocou ProLong Gold so 4′,6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI) montážnym médiom (Invitrogen) a zobrazené fluorescenčným mikroskopom Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, University of Washington).

Histologické hodnotenie kože.Vo formalíne fixované rezy kožného tkaniva zaliate v parafíne (4 až 5 μm) boli zafarbené hematoxylínom a eozínom na University of Washington Histology and Imaging Core pred UV, 1. deň, 2. deň a 6. deň po ožiarení UVB (n {{ 7}} žien). Koža bola hodnotená zaslepeným spôsobom pre nasledujúce parametre: zápal dermis/subcutis, smrť epidermálnych buniek, akantóza, hyperkeratóza, tvorba sérocelulárnej kôry a erózia/ulcerácia. Tieto parametre boli hodnotené na škále 0 až 4 v závislosti od závažnosti a rozsahu s výnimkou erózie/ulcerácie, ktorá bola hodnotená ako prítomná (1) alebo neprítomná (0). Reprezentatívne snímky boli nasnímané pomocou bitu NIS-Elements BR 3.{14}}a pokovované v programe Adobe Photoshop s úpravou osvetlenia aplikovanou na celý obrázok. Uvádza sa pôvodné zväčšenie.

Merania moču.Hladiny proteínov v moči boli hodnotené Bradfordovým proteínovým testom (Thermo Fisher Scientific). Vzorky moču boli testované pri riedení 1:40 v PBS a koncentrácia proteínu v moči bola stanovená na základe sériových riedení známych koncentrácií BSA. Pomer albumín/kreatinín v moči sa vyhodnotil pomocou albumínového testu Albuwell a súpravy Creatinine Companion Kit (Exocell) podľa pokynov výrobcu.

Odber ľudskej vzorky a analýza prietokovou cytometriou.Túto štúdiu schválila Rada pre preskúmanie inštitúcií University of Washington (STUDY00001145). Od zdravých dobrovoľníkov a pacientov so SLE bola po informovanom súhlase odobratá plná krv do heparinizovaných skúmaviek. Neutrofily (PMN) a PBMC boli izolované Ficoll-Paque diskontinuálnou gradientovou separáciou (GE Healthcare). PMN boli purifikované z erytrocytovej pelety 5% dextránovou sedimentáciou. Po lýze RBC sa bunky zafarbili fluorescenčne značenými protilátkami zakúpenými od Biolegend a expresia CXCR4 a percento buniek ICAM1hiCXCR1lo sa hodnotili v PMN (CD66b plus) a LDG (CD15 plus, CD14lo a CD10 plus v PBMC (19)). Stratégia hradlovania pre LDG a farbenie ICAM1hiCXCR1lo na základe FMO je uvedená v prílohe SI, obr. S11. Vzorky sa spracovali pomocou prietokového cytometra CytoFLEX (Beckman Coulter) a údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo verzie 10 (Tree Star).

Štatistické analýzy.Údaje sa analyzovali pomocou softvéru GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) a prezentovali sa ako priemer ± SEM. Štatistický rozdiel medzi týmito dvoma skupinami údajov bol stanovený v porovnaní s neožiarenými kontrolami (D-1) pomocou Studentovho testu. Na stanovenie štatistickej významnosti medzi týmito tromi skupinami sa použila jednosmerná ANOVA s viacnásobným porovnaním a Tukey post hoc.