Acylované fenyletanoidové oligoglykozidy s hepatoprotektívnou aktivitou z púštnej rastliny Cistanche Tubulosa

pre viac informácií:{0}}

Toshio Morikawa a spol

Abstraktné

Metanolový extrakt z čerstvých stoniekCistanche tubulosaZistilo sa, že (Orobanchaceae) vykazuje hepatoprotektívne účinky proti poškodeniu pečene u myší vyvolanému D-galaktozamínom (D-GalN) / ​​lipopolysacharidom (LPS). Z výpisu tri novéfenyletanoidoligoglykozidy, kankanozidy H1 (1), H2 (2) a I (3), boli izolované spolu so 16fenyletanoidové glykozidy(4–19) a dva acylované oligocukry (20,21). Štruktúry 1–3 boli určené na základe spektroskopických vlastností, ako aj chemických dôkazov. Spomedzi izolátov echinakozid (4, IC50=10 0,2 lM), akteozid (5, 4,6 lM), izoakteozid (6,5,3 lM), 20-acetylakteozid (8, 4,8 lM) a tubulozid A (10, 8,6 uM) inhibovala smrť hepatocytov indukovanú D-GalN. Týchto päť izolátov, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) a 10 (23,2 lM), a cistantubulozid B1 (11, 21,4 lM) tiež redukovali TNF-a- indukovaná cytotoxicita v bunkách L929. Okrem toho hlavné zložky (4–6) vykazovali in vivo hepatoprotektívne účinky pri dávkach 25–100 mg/kg, PO.

Kliknutím zobrazíte vedľajšie účinky a produkty Cistanche

1. Úvod

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je viacročná parazitická rastlina rastúca na koreňoch Salvadora alebo Calotropisspecies a rozšírená v severnej Afrike, Arábii a ázijských krajinách.Cistanche tubulosaako aj asistenčná salsa a cistanche deserticola sa tradične používali na liečbu impotencie, sterility, bedrového kĺbu a slabosti tela, ako aj ako prostriedok podporujúci krvný obeh.2,3 Predtým safenyletanoids, iridoidy, monoterpény a lignany boli izolované z Číny a PakistanuCistanche tubulosa.2,4–9 V priebehu našich charakterizačných štúdií o bioaktívnych zložkách v tejto prírodnej medicíne sme predtým uviedli, že päť iridoidov, kankanozidy A–D a kankanol, monoterpénglykozid, kankanozid E, dvafenyletanoidoligoglykozidy, kankanozidy F a G (23) a acylovaný oligocukor, kankanóza (21), boli izolované z metanolového extraktu sušených stoniekCistanche tubulosaOkrem toho sa zistilo, že metanolický extrakt a niekoľko izolátov ako echinakozid (4), akteozid (5), cistanozid F (20), 21 a kankanozid F vykazujú vazorelaxačné účinky, to znamená inhibičné účinky proti vyvolaným kontrakciám. noradrenalínom v izolovanej hrudnej aorte potkana.11 V našich pokračujúcich štúdiách o zložkách v rastline, metanolický extrakt z čerstvých stoniekCistanche tubules bolzistilo sa, že vykazuje ochranný účinok na poškodenie pečene vyvolané D-galaktozamínom (D-GalN)/lipopolysacharidom (LPS) u myší. Z metanolového extraktu sme izolovali tri novéfenyletanoidoligoglykozidy s názvom kankanozidy H1 (1), H2 (2) a I (3) spolu so 16 fenyletanoidovými glykozidmi (4–19) a dvoma acylovanými oligocukrami (20, 21). Tento článok sa zaoberá izoláciou a štruktúrnym objasnením týchto novýchfenyletanoidOligoglykozidy (1–3). Diskutované sú aj štrukturálne požiadavky fenyletanoidných glykozidov na hepatoprotektívnu aktivitu (obr. 1).

2. Výsledky a diskusia

2.1. Ochranný účinok metanolového extraktu zo stoniekCistanche tubulosana poškodenie pečene vyvolané D-GalN/LPS u myší

Čerstvé stonkyCistanche tubulosa(kultivované v Urumqi, provincia Xinjiang, Čína) boli extrahované metanolom pod refluxom, čím sa získal metanolový extrakt (8,36 percent z čerstvých stoniek). Ako je uvedené v tabuľke 1, pri dávkach 250 – 500 mg/kg, PO, metanolové extrakty vykazovali inhibičný účinok na zvýšenie sérovej aspartátaminotransaminázy (sAST) a alanínaminotransaminázy (sALT), markerov poškodenia pečene, vyvolané D- GalN/LPS u myší.

2.2. Chemické zložky zo stoniekCistanche tubulosa

Metanolový extrakt z čerstvých stoniekCistanche tubulosasa podrobil Diaion HP{0}} stĺpcovej chromatografii (H20?MeOH), čím sa získali frakcie eluované H20 a MeOH (5,63 percent a 2,73 percent, v tomto poradí). Frakcia eluovaná MeOH bola podrobená Si02 a ODS kolónovej chromatografii a nakoniec HPLC, aby sa získali tri novéfenyletanoidoligoglykozidy, kankanozidy H1 (1, 0.0008 percent ), H2(2, 0,0001 percenta) a I (3, 0,0007 percenta) spolu so 16fenyletanoidové glykozidy, echinakozid2,11 (4, 0,45 percent ), akteozid2,11 (5, 0,28 percent ), izoakteozid2,11 (6, 0.0 41 percent ), cis-akteozid12,13 (7, 0.0007 percent ), 20-acetylakteozid2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 percent ), dekafeoylakteozid14 (9, 0.0002 percentá ), tubulo strana A2,11 (10, 0,013 percent), cistantubulozidy B19 (11, 0,0020 percent), B29 (12,0,0003 percent), arearioside15 (13, 0,0006 percent), wiedemanninozid C16 (14,0,0008 percenta), cistantubulozid A9 (15, 0,0009 percenta), syringalid A 30-OaL ramnopyranozid4 (16, 0,0017 percenta), kamneozidy I17,18 (11157 percent) a II. 0,0005 percenta) a salidrozid11 (19, 0,0027 percenta) a dva acylované oligocukry, cistanozid F11 (20, 0,0004 percenta) a kankanózu11 (21, 0,0004 percenta).

2.3. Štruktúry kankanozidov H1 (1), H2 (2) a I (3)

Kankanozid H1 (1) sa získal ako biely prášok s negatívnou optickou rotáciou (½a-24D-45.3 v MeOH). Jeho IR spektrum ukázalo absorpčné pásy pri 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{10}7}}}70 a 1040 cm 1 pripísateľných hydroxylovým, esterovým karbonylom, éterovým funkciám, a aromatické kruhy. FABMSspektrá kladných a záporných iónov 1 vykazovali kvázimolekulárne iónové píky pri m/z 835 (M plus Na) plus a m/z 811 (MH), v tomto poradí, a molekulový vzorec bol stanovený ako C37H48O20 pozitívnym- meranie iónových FABMS. 1H a 13C NMR spektrá 1 (CD3OD, tabuľky 2 a 3), ktoré boli priradené rôznymi NMR experimentmi,19 ukázali signály priraditeľné dvom metylénom [d 2,70 (2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (po 1H, obidva m, H2-8)], orto- a meta-spojené aromatické protóny typu ABC [d 6,52 (1H, dd, J=1,8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz,H{{62} }})], dve bD-glukopyranozylové skupiny [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz, koncový-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }},2 Hz, vnútorný-Glc-H-1)] a aa-L-ramnopyranozylový zvyšok [d 1,06 (3H, d, J=6,0 Hz, Rha-H{{89 }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] spolu s acetylovou skupinou [d 1,98(3H, s)] a trans-p-kumaroylovou skupinou {trans-olefín [d 6,34,7,67 (po 1H, obidva d, J=16,0 Hz, H-8 a 7)] a aromatické protóny typu orto-viazané A2B{112}} [d 6,80, 7,46 (každý 2H d,J=8,7 Hz, H-3,5 a 2,6)]}. Konektivita medzi oligoglykozidovými a acylovými skupinami v 1 bola charakterizovaná experimentom HMBC, ktorý ukázal dlhodobé korelácie medzi nasledujúcimi protónovými a uhlíkovými pármi: vnútorný-Glc-H-1 a C-8 (dC71.9 ); vnútorný-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, podobný dd)] a acetylkarbonylkarbón (dC 171,4); vnútorný-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9,6, 9,6 Hz)] a p-kumaroylkarbonylový uhlík (dC 168,2); Rha-H-1 a vnútorný-Glc-C-3 (dC 80,5); a terminálny-Glc-H-1 a vnútorný-Glc-C-6 (dC69.3) (obr. 2). Nakoniec alkalická hydrolýza 1 s 5 percentným hydroxidom draselným (KOH) uvoľnila trans-p-kumarovú kyselinu, ktorá bola identifikovaná HPLC analýzou, spolu s deacylovaným produktom. Deacylovaný produkt bol postupne spracovaný s 1,0 M kyselinou chlorovodíkovou (HCl), aby sa uvoľnila L-ramnóza a D-glukóza, ktoré boli identifikované HPLC analýzou s použitím optického detektora rotácie. }}(3,4-dihydroxyfenyl)etyl OaL-ramnopyranozyl-(1- 3)-[bD-glukopyranozyl-(1-6)]-2-O-acetyl{{196 }}O-trans-p-kumaroyl-bD-glukopyranozid (1).

Kankanosid H2 (2) sa izoloval ako biely prášok s negatívnou optickou rotáciou (1/2a 25 D 52,4 v MeOH). Zistilo sa, že jeho molekulový vzorec C37H48O20 je rovnaký ako molekulový vzorec 1 meraním FABMS s kladnými iónmi s vysokým rozlíšením. Spektroskopické vlastnosti zlúčeniny 2 boli veľmi podobné vlastnostiam zlúčeniny 1, s výnimkou signálov spôsobených cis-p-kumaroylovou skupinou [d 5,79, 6,95 (po 1H, obe d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} a 7), 6,76, 7,73 (po 2H, obidva d, J=8,7 Hz, H-3,5 a 2,6)]. Okrem toho experiment HMBC na 2 tiež odhalil podobné módy korelácií na veľké vzdialenosti ako tie, ktoré boli zistené pre 1 medzi nasledujúcimi protónovými a uhlíkovými pármi: vnútorný-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44 }},8 Hz)] a C-8 (dC 72,0); vnútorný-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] a acetylkarbonylový uhlík (dC 171,4); vnútorný-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Hz)] a p-kumaroylkarbonylový uhlík (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H-1)] a vnútorné-Glc-C-3 (dC 80,7 ); a terminál-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Hz)] a vnútorné-Glc-C-6 (dC 69,4) (obr. 2) . Štúdiou degradácie 2 poskytla kyselinu cis-p-kumarovú a dva rovnaké cukry ako tie, ktoré sa získali v prípade 1. Štruktúra kankanozidu H2 bola teda objasnená ako 2-(3,{105}}) dihydroxyfenyl)etyl OaL-ramnopyranozyl-(1-3)-[bD-glukopyranozyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-kumaroyl- bD-glukopyranozid (2).

Kankanozid I (3) bol tiež izolovaný ako biely prášok s negatívnou optickou rotáciou (½a- 25D-62.2 v MeOH). Jeho molekulový vzorec, C35H46O18, bol stanovený pozitívnymi a negatívnymi meraniami FABMS a HRFABMS. Spektroskopické vlastnosti 3 (CD3OD, tabuľky 2 a 3) boli superponovateľné s vlastnosťami echinakozidu (4), s výnimkou signálov spôsobených aglykónovou časťou {{dva metylény {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H, dt, J=16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monosubstituované aromatické protóny [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26–7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alkalickou hydrolýzou 3 s 5 percentami KOH sa uvoľnila trans-kávová kyselina a na deacylovaný produkt sa postupne pôsobilo 1,OM HCI, aby sa uvoľnila L-ramnóza a D-glukóza. Nakoniec, konektivity acylskupiny a cukrových skupín v 3 boli objasnené pomocou HMBCexperimentu, ako je znázornené na obrázku 2. Na základe vyššie uvedených dôkazov bolo objasnené, že štruktúra kankanozidu I je 2-fenyletyl OaL- ramnopyranozyl-(1-3)-[bD-glukopyrano-syl-(1-6)]-4-0-trans-kafeoyl-bD-glukopyranozid (3)

2.4. Účinky chemických zložiek zo stoniek Cistanche tubulosa na D-GalN-indukovanú cytotoxicitu v primárnych kultivovaných myších hepatocytoch

Poškodenie pečene indukované D-GalN/LPS sa rozvinie prostredníctvom imunologických reakcií.19 Uvádza sa, že tento typ poškodenia pečene sa vyskytuje v dvoch formách. Po prvé, citlivosť na TNF-a depléciou trifosfátu uridínu v hepatocytoch je zvýšená pomocou D-GalN. Po druhé, prozápalové mediátory, ako sú NO a TNF-a, sa uvoľňujú z LPS-aktivovaných makrofágov (Kupfferových buniek). Uvádza sa, že apoptóza hepatocytov prostredníctvom TNF-a má dôležitú úlohu pri poškodení pečene vyvolanom D-GalN/LPS.20

V našich predchádzajúcich štúdiách o hepatoprotektívnych zlúčeninách z prírodných liekov sme uviedli, že niekoľko zložiek z Hovenia Dulcis, 21 Bupleurum scorzonerifolium, 22, 23 Curcuma zedoaria, 24–26 Angelica furcijuga, 27, 28 Betula sativum, 30 Salacia reticulata, 31 Anargenteaaaa2 Tilia argentestatic hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 a Piper chaba42,43 preukázali hepatoprotektívne účinky na poškodenie pečene/hepatoprotektívne účinky u myší a/alebo platyphylla var. japonica,29 Pisum inhibičný účinok na D-GalN-indukovanú cytotoxicitu v primárne kultivovaných hepatocytoch. Keďže metanolový extrakt zo stoniekCistanche tubulosapreukázali hepatoprotektívne účinky na D-GalN/LPS-indukované poškodenie pečene u myší (vide ante), inhibičný účinok zložiek na D-GalN indukovanú cytotoxicitu v primárnych kultivovaných myších hepatocytoch sa skúmal pomocou 3-(4,{ Test {6}}dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidu (MTT). Ako je uvedené v tabuľke 4, echinakozid (4, IC50=10 0,2 lM), akteozid (5, 4,6 lM), izoaceteozid (6, 5,3 lM), 20-acetylakteozid (8, 4,8 lM), tubulozidy A (10, 8,6 uM) a B11 (22, 14,6 uM) a kankanozid G11 (23, 14,8 uM) vykazovali silnú aktivitu. Ich aktivity boli väčšie ako aktivity komerčného silybínu (38,8 lM),33–43 ako pozitívnej kontroly.44,45 Štrukturálne požiadavkyfenyletanoidové glykozidy for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 uM)]; (2) aglykón s 3,4-dihydroxyskupinou vykazoval silnejšiu aktivitu ako aglykón s 4-hydroxyskupinou (6 > 23); (3) 60-ObD-glukopyranozylová skupina znížila aktivitu (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" 8-obd-glukopyranozylová="" časť="" s="" 40-o-kafeoylovou="" skupinou="" vykazovala="" silnejšiu="" aktivitu="" ako="" s="" 60-o-kafeoylovou="" skupinou="" (5="6," 8=""> 22 ); a (5) zavedenie 20-O-acetylskupiny znížilo aktivitu (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >Zistilo sa teda, že tieto zlúčeniny neovplyvňujú nadprodukciu NO a TNF-a z LPS-aktivovaných makrofágov.

2.5. Účinky chemických zložiek na cytotoxicitu indukovanú TNF-a v bunkách L929

Aby sa objasnili účinky zložiek na citlivosť hepatocytov na TNF-a, TNF-a-indukované zníženie životaschopnosti buniek L929, bunková línia citlivá na TNF-a48 sa skúmala pomocou testu MTT. Bez testovaných vzoriek sa životaschopnosť buniek znížila na cca. 60 percent po inkubácii buniek s 20 ng/ml TNF-a počas 44 hodín v porovnaní s prípadom bez TNF-a. Ako je uvedené v tabuľke 5, echinakozid (4, IC50=31 0,1 lM), akteozid (5, 17,8 lM), izoaceteozid (6, 22,7 lM), 20-acetylakteozid (8, 25,7 lM), tubulozid A (10, 23,2 lM) a cistantubulozid B1 (11, 21,4 lM) inhibovali pokles životaschopnosti buniek a zistilo sa, že ich aktivity sú vyššie ako aktivity piperínu42,43 a silybínu. Konštrukčné požiadavkyfenyletanoidové glykozidy for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 uM)] a (5) zavedenie 20-0-acetylovej skupiny znížilo aktivitu (8 < 5,="" 22="">< 6).="" tieto="" požiadavky="" boli="" podobné="" tým,="" ktoré="" boli="" pozorované="" v="" predchádzajúcej="" kapitole="" týkajúcej="" sa="" inhibičných="" účinkov="" na="" d-galn-indukovanú="" cytotoxicitu="" v="" primárne="" kultivovaných="" myších="">

Tieto zistenia in vitro naznačujú nasledujúce možné mechanizmy účinku na hepatoprotektívny účinok zložiek kmeňovCistanche tubulosa: (i) zníženie cytotoxicity indukovanej D-GalN (4–6, 8, 10, 22 a 23) a (ii) zníženie cytotoxicity indukovanej TNF-a (4–6, 8, 10 a 11) .

2.6. Ochranné účinky echinakozidu (4), akteozidu (5) a izoakteozidu (6) proti poškodeniu pečene vyvolanému myšiam D-GalN/LPS a ich spôsob účinku

Nakoniec sme skúmali účinok istinyfenyletanoidové glykozidyechinakozid (4), akteozid (5) a izoakteozid (6) na D-GalN/LPS-indukované poškodenie pečene u myší. Ako je uvedené v tabuľkách 6 a 4–6, významne inhibovalo zvýšenie sAST a soli vyvolané D-GalN/LPS u myší v dávkach 25–100 mg/kg, PO. Na druhej strane 4–6 neovplyvnili nadprodukciu TNF-a z makrofágov aktivovaných LPS. Okrem toho 4–6 významne inhiboval smrť buniek L929 spôsobenú TNF-a, čo naznačuje zníženie citlivosti buniek L929 na TNF-a (vide ante). Tieto zistenia naznačujú, že 4–6 znižuje citlivosť týchto buniek na cytotoxicitu vyvolanú TNF-a. Bolo publikovaných mnoho zlúčenín, ktoré inhibujú bunkovú smrť indukovanú D-GalN a produkciu TNF-a24,26,32, ale uvádza sa len málo zlúčenín, ktoré selektívne znižujú citlivosť hepatocytov na TNF-a.42,43,49,50

Na záver z čerstvých stoniekCistanche tubulosa, tri novéfenyletanoidové glykozidy, kankanozidy H1 (1), H2 (2) a I (3) spolu so 16 známymifenyletanoidové glykozidyIzolovali sa (4–19) a dva acylované oligocukry (20, 21). Štrukturálne požiadavky na ich ochranné účinky na poškodenie hepatocytov indukované D-GalN a cytoprotektívne účinky na bunky L929 spôsobené TNF-a boli nasledovné; (1) aglykónová časť bola podstatná pre aktivitu; (2) aglykón s 3,4-dihydroxyskupinami vykazoval silnejšiu aktivitu ako ten, ktorý mal 4-hydroxyskupinu; (3) 60-ObD-glukopyranozylová skupina znížila aktivitu; (4) 8-ObD-glukopyranozylová časť s 40-O-kafeoylovými skupinami vykazovala silnejšiu aktivitu ako časť s 60-O-kafeoylovou skupinou; a (5) zavedenie {{27} }}O-acetylová skupina znížila aktivitu. Ďalej, hlavnýfenyletanoidové glykozidyechinakozid (4), akteozid (5) a izoakteozid (6) inhibovali zvýšenie insAST a sALT v dávkach 25–100 mg/kg PO u myší liečených D-GalN/LPS a tieto inhibičné účinky sa považovali za v závislosti od zníženej citlivosti hepatocytov na TNF-a. Podrobné mechanizmy pôsobeniafenyletanoidové glykozidytreba študovať ďalej.

3. Experimentálne

3.1. generál

Na získanie spektrálnych a fyzikálnych údajov boli použité nasledujúce prístroje: špecifické rotácie, digitálny polarimeter Horiba SEPA-300 (l=5 cm); UV spektrá, Shimadzu UV-1600 spektrometer; IČ spektrá,Shimadzu FTIR-8100 spektrometer; 1H a 13C NMR spektrá, JEOLJNM-ECA600 (600 a 150 MHz) a JEOL JNM-ECS400 (400 a 100 HMz) spektrometre s tetrametylsilánom ako vnútorným štandardom; FABMS a FABMS s vysokým rozlíšením, hmotnostný spektrometer JEOL JMS-SX 102A; HPLC detektor, Shimadzu RID-10A index lomu, Shimadzu SPD-10A UV–vis a Shodex OR-2 detektory optickej rotácie. Na analytické a preparatívne účely sa použili stĺpce HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II a stĺpce pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) a (250 - 20 mm id).

Na chromatografiu sa použili nasledujúce experimentálne podmienky: stĺpcová chromatografia na silikagéli s normálnou fázou (CC), silikagél 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 mesh, sférický, neutrálny ); silikagél s reverznou fázou CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) a Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); normálna fáza TLC, vopred potiahnuté TLC platne so silikagélom 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC s reverznou fázou, TLC platne vopred potiahnuté silikagélom RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC s reverznou fázou, vopred potiahnuté TLC platne so silikagélom RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekcia sa dosiahla postrekom 1 % Ce(SO4)2 – 10 % vodnej H2SO4, po čom nasledovalo zahrievanie .

3.2. Rastlinný materiál

Čerstvé stonkyCistanche tubulosapestované v Urumqi, provincia Xinjiang, Čína boli zozbierané v septembri 2007. Rastlinný materiál identifikoval jeden z autorov (MY). Poukaz na rastlinný materiál je uložený v našom laboratóriu.

3.3. Extrakcia a izolácia

Čerstvé stonkyCistanche tubulosa(2,98 kg) boli jemne narezané a extrahované trikrát metanolom pod refluxom počas 3 hodín. Odparenie rozpúšťadla za zníženého tlaku poskytlo metanolový extrakt (249,1 g, 8,36 %). Metanolový extrakt sa podrobil Diaion HP 20 CC (5,{32}} kg, H20?MeOH), čím sa získali frakcie eluované H20 a MeOH (167,84 g, 5,63 percenta a 81,21 g, 2,73 percenta , respektíve). Frakcia eluovaná MeOH (61,{24}} g) sa podrobila normálnej fáze silikagélu CC[1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:{115}}.5-6:4:1, obj./obj./obj.? MeOH], čím sa získa sedem frakcií [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) a 7 (4,6 0} g)]. Frakcia 2 (9,56 g) sa oddelila pomocou reverznej fázy silikagélu CC [400 g, MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)>MeOH>acetón], čím sa získa päť frakcií [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) a 2–5 (31,9 mg)]. Frakcia 2–3 (1.00 g) sa podrobila HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (7:93, v/ v)] dať sedem zlomkov [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20,4 mg), 2–3–3 (26.0 mg), 2–3–4 (136,6 mg), 2–3–5 (38{{300}},6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. Frakcia 2–3–4 (106,6 mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1% vodná AcOH (5:95, obj./obj.)], čím sa získal salidrozid (19,13,7 mg, {{340}}.0{{409}}27 percent ). Frakcia 4 (10,69 g) bola oddelená reverznou fázou silikagélu CC [500g, MeOH–H2O (30:7 {0,obj./obj.)?MeOH=acetón], čím sa získajú štyri frakcie [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7.{554}}6 g), 4–3 (1,57 g) a 4–4 (792,8 mg)]. Frakcia 4–2 (1,5{{560}}}g) sa podrobila HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (2{{57{{586} }}}:80, v/v)] a získajte päť zlomkov {Fr. 4–2–1 (42,9 mg), 4–2–2 [= kamneozid I (17, 67.0 mg, 0,014 percent)], 4–2– 3 [= akteozid (5, 1,21 g, 0,26 percenta)], 4–2–4 (41,6 mg) a 4–2–5 (181,3 mg)}. Frakcia 4–2–4 (41,6 mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (18:82, obj./obj.)], čím sa získal izoakteozid (6, 19,1 mg, 0,0040 percenta) a cis-akteozid (7,3,4 mg, 0,0007 percenta). Frakcia 4–3 (1,57 g) sa prečistila pomocou HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný roztok AcOH (20:80, obj./obj.)], čím sa získalo 11 frakcií [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 percent), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 percenta), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 percenta), 4–3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-ramnopyranozid (16, 37,6 mg, 0,0017 percent)], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetylakteozid (8, 85,4 mg, 0,0038 percenta)] a 4–3–11 (64,6 mg)]. Frakcia 4–3–6 (43,6 mg) sa ďalej čistila pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný roztok AcOH (18:82, obj./obj.)], čím sa získali kankanozidy H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 percenta) a H2 (2,3,3 mg, 0,0001 percenta). Frakcia 4–3–9 (39,8 mg) sa ďalej purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (18:82, obj./obj.)], čím sa získal kankanozid I (3, 15,4 mg, 0,0007 percenta) a 6 ( 3,1 mg, 0,0001 percenta. Frakcia 5 (8,84 g) sa oddelila pomocou reverznej fázy silikagéluCC [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, obj./obj.)?MeOH?acetón]. sedem zlomkov [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) a 5 –7 (130,1 mg)]. Frakcia 5–1 (870,2 mg) sa čistila pomocou HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (5:95, obj./obj.)], čím sa získal lakteozid bez kofeínu (9, 5,1 mg, 0,0002 percenta) a cistanozid F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 percenta). Frakcia 5–3 (3,72 g) sa prečistila pomocou HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný roztok AcOH (15:85, obj./obj.)], čím sa získalo šesť frakcií [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanóza (21, 9,4 mg, 0,0004 percent)], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3 mg), 5–3–5 [= strana echinaka (4, 2,54 g, 0,11 percenta) a 5–3–6 (318,5 mg)]. Frakcia 5–3–4 (72,3 mg) sa ďalej čistila pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (10:90, obj./obj.)], čím sa získal kamneozid II (18, 10,6 mg, 0,0005 percenta). Frakcia 5–4 (979,9 mg) sa purifikovala pomocou HPLC[Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný roztok AcOH (15:85, obj./obj.)] na dané frakcie [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 percenta), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 percenta) a 5– 4–9 (134,7 mg)]. Frakcia 5–4–6 (318,5 mg) sa purifikovala pomocou HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 % vodný AcOH (15:85, obj./obj.)] za vzniku cistantubulozidov B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 percent), B2 (12 7,6 mg, 0,0003 percenta) a A (15, 21,1 mg, 0,0009 percenta) a wiedemanninozid C(14, 17,2 mg, 0,0008 percenta). Frakcia 5–5 (1,19 g) sa čistila pomocou HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (18:82, obj./obj.)], čím sa získal tubulozid A (10, 300,3 mg, 0,013 percenta) a arenariozid (13,5,8 mg, 0,0006 percenta). Frakcia 6 (12,52 g) sa oddelila pomocou silikagélu CC s reverznou fázou [600 g, MeOH-H20 (20:80 —> 30:70, obj./obj.) —MeOH —acetón], čím sa získali štyri frakcie [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) a 6–4 (17,8 mg)]. Frakcia 6–2 (500,0 mg) sa čistila pomocou HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vodný AcOH (25:75, obj./obj.)], čím sa získala zlúčenina 4 (353,1 mg, 0,34 percenta ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Biely prášok, ½a- 24D -45,3 (c 1,06, MeOH). FABMS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C37H48020Na (M plus Na) plus: 835,2637. Nájdené: 835,2633. UV [MeOH, nm (loge)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070, 1044 cm{30}}. 1H NMR (600 MHz, CD30D) d: uvedené v tabuľke 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedené v tabuľke 3. FABMS s pozitívnym iónom: m/z 835 (M plus Na) plus. Negatívny ión FABMS: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) Biely prášok, ½a- 25D-52,4 (c 0,27, MeOH). FABMS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Nájdené: 835,2644. UV [MeOH, nm (loge)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD30D) d: uvedené v tabuľke 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedené v tabuľke 3. FABMS s pozitívnym iónom: m/z 835 (M plus Na) plus FABMS so záporným iónom : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Biely prášok, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS s kladným iónom s vysokým rozlíšením: Vypočítané pre C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Nájdené: 777,2585. UV [MeOH, nm (loge)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070, 1046 cm{30}}. 1H NMR (600 MHz, CD30D) d: uvedené v tabuľke 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedené v tabuľke 3. FABMS s pozitívnym iónom: m/z 777 (M plus Na) plus. Negatívny ión FABMS: m/z 753 (MH)-.

3.4. Alkalická a kyslá hydrolýza 1–3

Roztoky 1, 2 a 3 (každý 1,5 mg) v 5% vodnom hydroxide draselnom (KOH, 0,5 ml) sa miešali pri 40 stupňoch počas 1 hodiny. Každý roztok sa neutralizoval s Dowex HCR W2 (H plus forma) a živica sa odstránila filtráciou. Odparenie rozpúšťadla za zníženého tlaku poskytlo zodpovedajúce deacylované produkty, ktoré sa podrobili HPLC analýze [stĺpec: Cosmosil pNAP, 250 - 4, 6 mm id; mobilná fáza: CH3CN – 1 % vodný AcOH (15:85, obj./obj.); detekcia: UV (254 nm); prietok: 1.0 ml/min] identifikuje sa ako kyselina trans-kávová (tR 9,9 min z 3), kyselina trans-p-kumarová (tR 17,1 min z 1) a kyselina cis-p-kumarová (tR17,8 min z 2). Potom sa každý rozpustil v 1,5{37} MHCI (1,{55}} ml) a zahrieval sa na 80 °C počas 3 hodín. Po ochladení sa reakčná zmes neutralizovala Amberlitom IRA{40}} (OH forma) a živice sa odstránili filtráciou. Po odstránení rozpúšťadla pri zníženom tlaku sa zvyšok oddelil kolónou Sep-Pak C18 (H20 ? MeOH). Frakcia eluovaná H20 sa podrobila HPLC analýze za nasledujúcich podmienok: HPLC kolóna, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm vnútorný priemer - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokio, Japonsko); detekcia, optická rotácia [Shodex OR{50}} (Showa Denko Co., Ltd, Tokio, Japonsko); mobilná fáza, CH3CN-H20 (85:15, obj./obj.); prietok 0,8 ml/min]. Identifikácia L-ramnózy (i) a D-glukózy (ii) uvoľnenej z 1, 2 alebo 3 vo frakcii eluovanej H2O sa uskutočnila porovnaním ich retenčných časov a optickej rotácie s retenčnými časmi autentických vzoriek [i,tR 9,9 min. (negatívny)] a [ii, tR 17,9 min (pozitívny)].

3.5. Biotest

3.5.1. Činidlá

LPS (od Salmonella enteritidis), minimálne základné médium (MEM) a Williamovo E médium boli zakúpené od Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA); fetálne bovinné sérum (FBS) bolo od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); a ďalšie chemikálie boli od Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japonsko). 96-Mikroplatničky Well boli zakúpené od spoločnosti Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokio, Japonsko).

3.5.2. Zvieratá

Samce myší ddY boli zakúpené od Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japonsko). Zvieratá boli chované pri konštantnej teplote 23 ± 2 C a boli kŕmené štandardným laboratórnym krmivom (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japonsko). Všetky experimenty sa uskutočňovali s myšami pri vedomí, pokiaľ nie je uvedené inak. Experimentálny protokol bol schválený Výborom pre experimentálny výskum zvierat Kinki University.

3.5.3. Ochranné účinky na myši s poškodením pečene vyvolaným D-GalN/LPS

Metóda opísaná Tiegsom et al.51 bola modifikovaná a použitá pre tento experiment. Stručne povedané, samce myší ddY s hmotnosťou približne 25 až 30 g pred experimentom hladovali 20 hodín. D-GalN (350 mg/kg) a LPS (10 lg/kg) rozpustené vo fyziologickom roztoku boli injikované intraperitoneálne, aby došlo k poškodeniu pečene. Každá testovaná vzorka bola podaná orálne 1 hodinu pred injekciou D-GalN/LPS. Vzorky krvi sa odobrali z infraorbitálneho venózneho plexu 10 hodín po injekcii D-GalN/LPS. Hladiny sAST a sALT boli stanovené pomocou metódy Reitman-Frankel (komerčná súprava, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hydrokortizón sa použil ako referenčná zlúčenina. Testované vzorky sa suspendovali v 5% roztoku arabskej gumy a roztok sa podával orálne v množstve 10 ml/kg v každom experimente, zatiaľ čo vehikulum sa podávalo orálne v množstve 10 ml/kg v zodpovedajúcej kontrolnej skupine.

3.5.4. Ochranné účinky na cytotoxicitu indukovanú D-GalN primárne kultivovanými myšacími hepatocytmi

Hepatoprotektívny účinok zložiek bol stanovený pomocou {{0}}}(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidu (MTT ) kolorimetrický test s použitím primárnych kultivovaných myších hepatocytov.33–43 Hepatocyty boli izolované z myší maleddY (30–35 g) metódou perfúzie kolagenázy. Bunková suspenzia pri 4 - 104 bunkách v 100 ul William's E média obsahujúcom FBS (10 percent), penicilín G (100 jednotiek/ml) a streptomycín (100 lg/ml) sa naočkovala do 96-jamkovej mikroplatničky a predkultivované počas 4 hodín pri 37 stupňoch pod atmosférou 5 percent CO2. K médiu sa pridalo 100 ul čerstvého média obsahujúceho D-GalN (2 mM) s testovanou vzorkou alebo bez nej a hepatocyty sa kultivovali 44 hodín. Médium sa vymenilo za 100 ul čerstvého média a do média sa pridalo 10 ul roztoku MTT [5 mg/ml vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS)]. Po 4 hodinách inkubácie sa médium odstránilo a potom sa pridalo 100 1 izopropanolu obsahujúceho 0,04 M HCI, aby sa rozpustil formazan produkovaný v bunkách. Optická hustota (OD) formazanového roztoku sa merala čítačkou mikrodoštičiek pri 570 nm (referencia: 655 nm). Inhibícia (v percentách) sa získala podľa nasledujúceho vzorca.

Inhibícia ( percentá )= [(OD(vzorka) - OD(kontrola))/(OD(normálna)-OD(kontrola))] x 100

3.5.5. Účinky na produkciu NO v LPS-stimulovaných myších peritoneálnych makrofágoch

Skríningový test na produkciu NO s použitím TGC-indukovaných myších peritoneálnych makrofágov sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie.43,46,

3.5.6. Účinky na produkciu TNF-a v LPS-stimulovaných myších peritoneálnych makrofágoch

TNF-a uvoľnený v médiu bol stanovený tak, ako bolo opísané vyššie28 s miernou modifikáciou. V stručnosti, TGC-indukované peritoneálne makrofágy myší (5 - 105 buniek/jamka) sa odobrali z peritoneálnych dutín samcov myší ddY, suspendovali sa v 100 ul RPMI 1640 doplnenom 5 percentami FBS, penicilínom (100 jednotiek/ ml) a streptomycín (100 lg/ml) a predkultivujú sa v 96-jamkových mikroplatniach pri 37 stupňoch v 5 percentách CO2 vo vzduchu počas 1 hodiny. Neadherentné bunky sa odstránili premytím PBS a pridalo sa 100 ul čerstvého média obsahujúceho rôzne koncentrácie testovanej zlúčeniny. Po 10 minútach sa pridalo 100 ul média obsahujúceho 10 ug/ml LPS a inkubovalo sa 4 hodiny. Produkcia TNF-a v každej jamke sa stanovila pomocou súpravy ELISA (súprava Mouse TNF-a ELISA, Invitrogen). Každá testovaná zlúčenina sa rozpustila v DMSO a roztok sa pridal do média (konečná koncentrácia DMSO 0,5 percenta)

3.5.7. Inhibičné účinky na bunkovú smrť indukovanú TNF-a v bunkách L929

Bunky L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japonsko) boli udržiavané v minimálnom esenciálnom médiu Eagle (MEM, Sigma-Aldrich) obsahujúcom 10 percent FBS, 1 percento neesenciálnych aminokyselín MEM (Invitrogen), penicilín G (100 jednotiek /ml) a streptomycín (100 lg/ml) pri 37 °C pod atmosférou 5 percent CO2. Bunky boli naočkované na 96-jamkovú doštičku pre tkanivové kultúry [3 -104 buniek/jamku v 100 ul/jamku v MEM]. Po 44 hodinách inkubácie v médiu TNF-a (20 ng/ml) s testovanou vzorkou alebo bez nej sa životaschopnosť buniek hodnotila kolorimetrickým testom MTT (videante).49,50 Každá testovaná zlúčenina sa rozpustila v DMSO a roztok sa pridal do média (konečná koncentrácia v DMSO 0,5 percenta).

3.6. Štatistiky

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM Na štatistickú analýzu sa použila jednosmerná analýza odchýlky (ANOVA), po ktorej nasledoval Dunnettov test. Hodnoty pravdepodobnosti (p) menšie ako 0,05 sa považovali za významné.

Poďakovanie

TM, KN a OM boli podporené grantom na vedecký výskum z projektu „High-tech Research Center“ pre súkromné ​​univerzity: dotácia zodpovedajúceho fondu z grantu na vedecký výskum od Ministerstva školstva, kultúry , Šport, veda a technológia (MEXT) v Japonsku, 2007–2011 a tiež podporovaná grantom na vedecký výskum od MEXT. MY a HM boli podporené 21. programom COE, Academic Frontier Project a grantom na podporu vedeckého výskumu od MEX

Od: ' Acylatedfenyletanoidoligoglykozidy s hepatoprotektívnou aktivitou z púštnej rastlinyCistanche tubulosa' odToshio Morikawa a spol

---Bioorganic & Medicinal Chemistry 18 (2010) 1882–1890.