Adherentné a suspenzné Obličkové bunky mláďat škrečkov majú odlišný cytoskelet a repertoár povrchových receptorov

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florián Pfaff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Abstraktné

Živočíšna bunková kultúra, v ktorej rastú jednotlivé bunkypozastavenie, ideálne v chemicky definovanom prostredí, je základom biofarmaceutickej výroby. V syntetickom prostredí chýbajú exogénne rastové faktory a zvyčajne si vyžaduje časovo náročný adaptačný proces na výber bunkových klonov, ktoré proliferujú vpozastaveniena vysoký počet buniek. Molekulárne mechanizmy, ktoré uľahčujú adaptáciu a ktoré prebiehajú vo vnútri bunky, sú do značnej miery neznáme. Najmä pre bunkové línie, ktoré sa používajú na produkciu vírusového antigénu, ako sú bunky obličiek mláďat škrečkov (BHK), je obmedzenie rastu vírusu prostredníctvom vývoja nežiaducich bunkových charakteristík vysoko nežiaduce. Porovnanie medzi adherentne rastúcimi bunkami BHK a suspenznými bunkami s rôznymináchylnosťna vírus slintačky a krívačky odhalili rozdiely v expresii bunkových receptorov, ako sú integríny a heparansulfáty, a v organizácii aktínového cytoskeletu. Transkriptómové analýzy a rastkinetikademonštrovali rozmanitosť bunkových línií BHK a potvrdili dôležitosť dobre charakterizovaných rodičovských bunkových klonov a vedomého skríningu, aby sa zabezpečilo, že základné bunkové vlastnosti sa počas adaptácie nestratia.

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

1. Úvod

Technológia kultivácie živočíšnych buniek sa prvýkrát použila na produkciu vírusového antigénu pri výrobe vakcín, ale v poslednej dobe sa bakteriálne alebo kvasinkové produkčné platformy pre rekombinantné proteíny zmenili aj na systémy cicavčích buniek [1, 2]. Dôležité v oboch kontextoch sú obličkové bunky mláďat škrečka (BHK), odvodené od škrečka sýrskeho (Mesocricetus auratus). Pôvodne boli BHK bunky adherentne rastúca cicavčia bunková línia závislá od kotvy s rastovým vzorom fibroblastov v štandardných podmienkach bunkovej kultúry vrátane fetálneho bovinného séra (FBS) [3, 4]. Adaptácia adherentných buniek BHK napozastavenierast v bezsérovom médiu v kombinácii s kultivačnými podmienkami vo veľkom meradle je úspešným príbehom produkcie rekombinantných proteínov (napr. faktora VIII) s vysokými výťažkami [1, 2]. Okrem toho sú BHK bunky citlivé na širokú škálu vírusov, vrátane vírusu slintačky a krívačky (FMD) [5]. Na uspokojenie zvyšujúceho sa dopytu po vakcínach proti slintačke a krívačke v mnohých častiach sveta sa musia vyrábať veľké množstvá antigénu čo najlacnejšie, čo je možné dosiahnuť zvýšením hustoty životaschopných buniek na bunkovej strane a znížením nákladov prostredníctvom zjednodušenia upstream a downstream spracovania. antigénu na strane produkcie [6]. Médiá bez živočíšnych zložiek (ACFM) znižujú riziko kontaminácie náhodnými látkami a navyše zjednodušujú proces, keď nie je potrebné dopĺňať sérum [6, 7]. Adaptácia buniek na rast v suspenzii bez séra a v ACFM je však časovo náročný a postupný proces [6, 8]. Bunky BHK ľahko dosahujú bunkové hustoty 3,5 × 106 buniek/ml v suspenzii, ale adaptácia vždy nesie riziko vývoja nežiaducich bunkových vlastností v porovnaní s počiatočnou populáciou, čo môže viesť k slabému rastu, nedostatočným bunkovo ​​špecifickým výťažkom alebo tumorigénnym aktívam. [5, 7]. Na druhej strane zmeny v bunkách môžu viesť k neočakávaným variantom vírusu počas procesu kultúrnej adaptácie. Najmä pri produkcii vakcínového antigénu je zmena charakteristík vírusu a antigenicity vysoko nežiaduca. Bunky BHK sa už líšia svojou citlivosťou a možnosťou množenia určitých kmeňov vírusu FMDV [9]. Je zrejmé, že zmena fibroblastického rastu závislého od ukotvenia prostredníctvom agregácie a tvorby sféroidov na bunky rastúce nezávisle v suspenzii bude sprevádzaná významnými zmenami v samotnej bunke [4, 6]. Strata integrínovej signalizácie v dôsledku prerušenia kontaktu extracelulárna matrica-bunka vedie k zmenám v expresii membránových proteínov a v organizácii aktínového cytoskeletu, ktorý je dôležitým príjemcom integrínom sprostredkovanej signalizácie [6, 10]. Tieto integríny zároveň zohrávajú dôležitú úlohu pri infekcii FMDV, pretože sú receptorom pre FMDV v prirodzenom hostiteľovi a primárnym receptorom v bunkovej kultúre [11].

Hlbšie pochopenie bunkových rozdielov medzi adherentne rastúcimi bunkami HK a bunkami vpozastavenieotvorí nové možnosti bunkového inžinierstva a zjednoduší výber vhodných bunkových klonov na výrobu vakcínového antigénu.

V tejto štúdii sa adherentne rastúce bunky BHK a adaptované na ACFMpozastavenieBunky BHK sa skúmali s ohľadom na expresiu bunkových receptorov, ako sú integríny a heparansulfáty (HS), ich schopnosť prezentovať proteíny na bunkovom povrchu a organizáciu bunkového aktínového skeletu. Transkriptómové analýzy a kinetika rastu poskytujú informácie o diverzite testovaných bunkových línií BHK.

cistanche môže vyživovať obličky a zlepšiť funkciu obličiek

2. Materiály a metódy

2.1 Bunkové línie a bunková kultúra

Hlavnými použitými bunkovými líniami boli dva adherentné deriváty BHK{0}} klonu 13 (z American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, vedené ako CCLV-RIE 164 a 179 v Collection of Cell Lines in Veterinary Medicine , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Nemecko; v skratke: BHK164 alebo BHK179) apozastaveniebunkové línie BHK21C13-2P (BHK-2P) poskytované Európskou zbierkou overených bunkových kultúr (ECACC; 84111301) a BHK-InVitrus (BHK-InV, tiež označovaný ako „línia #8“ ako v našej predchádzajúcej publikácii [12], Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

Na kinetiku rastu sa okrem toho použili nasledujúce bunkové línie: BHK-2P udržiavané buď v Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) s 10 percentami FBS ("línia #2") alebo prispôsobené na ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) v dvoch rôznych procesoch (linky #4 a #5), plus štyri ďalšiepozastaveniebunkové línie: BHK21C13 adaptované na rast vpozastaveniepostupným odoberaním séra (riadok č. 3), BHK21-C (riadok č. 6), BHK21-Hektor (riadok č. 7) a produkčného BHK (riadok č. 9) [12]. Všetky tieto bunky poskytla spoločnosť Merck KGaA.

Všetky BHK-21 bunky použité v štúdii sú nakoniec odvodené z BHK-21 klonu 13 bunkovej línie Macphersona a Stokera [13]. Termín "bunková línia" sa používa voľne; nie všetkých jedenásť línií BHK-21 opísaných v tejto štúdii sú skutočne odlišné bunkové línie, a nie deriváty kultivované za rôznych podmienok. Pre ľahšiu orientáciu je číslovanie riadkov konzistentné s číslovaním v našej predchádzajúcej publikácii [12].

Bunková línia #1 z predchádzajúcej publikácie nebola zahrnutá v tejto štúdii a toto číslo sa preto nepoužíva. Namiesto toho akýkoľvek odkaz na bunky BHK-2P, ktorý neuvádza čísla riadkov #2, #4 alebo #5, je určenýpozastaveniebunková línia BHK21C13-2P (ECACC84111301) predstavená na začiatku tejto časti.

Adherujúce bunkové línie vaječníkov (CHO) čínskeho škrečka (Cricetulus griseus) CHO-K1 (ATCCCCL-61, označené ako CCLV-RIE 134) a CHO677 (CRL 2244, označené ako CCLV-RIE 1524), ako aj IB-RS Použili sa -2 bunky (Instituto Biologico-Rim Suı´no-2, vedené ako CCLV-RIE 103) a Madin-Darbyho bunky hovädzej obličky (v skratke: MDBK, vedené ako CCLV-RIE261). ako kontroly v experimentoch prietokovej cytometrie.

Podmienky kultivácie boli 37 ˚C, 5 percent CO2 a prepozastaveniebunky 320 ot./min. v bioreaktoroch TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Švajčiarsko) pri relatívnej vlhkosti 80 percent. Všetky adherentné bunkové línie sa kultivovali v minimálnom esenciálnom médiu Eagle (MEM) doplnenom Hanksovými a Earlovými soľami (Sigma-Aldrich) s 10 percentami FBS. Všetky suspenzné bunkové línie boli adaptované na rast v Cellvento™ BHK200 médiu (Merck KGaA) okrem bunkovej línie #2, ktorá bola kultivovaná ako je opísané vyššie.

Merania bunkovej hustoty a životaschopnosti sa uskutočňovali pomocou trypánovej modrej (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a automatického počítadla buniek (model TC20, Bio-Rad).

2.2 Analýza rastovej krivky suspenzných buniek

Analýzy rastovej krivky sa uskutočňovali ako dávkové experimenty, uskutočňované v duplikátoch, dvakrát jednotlivo, s hustotou očkovania 0,6 x 106 buniek/ml. Hustota životaschopných buniek (VCD) a životaschopnosť v percentách sa merali denne až do šiestich dní po inokulácii buniek.

Výpočty špecifické pre bunku sa uskutočnili podľa rovníc uvedených v [14]:

X: VCD (na ml); t: časové body odberu vzoriek (hodina); n a n -1: dva po sebe idúce body vzorkovania.

Číslo bunkového delenia (cd):

2.3 Prietoková cytometria

Analýzy prietokovou cytometriou sa uskutočnili s použitím prístroja na prietokovú cytometriu FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK). Bunkové zvyšky boli vyradené na základe vzorov rozptylu dopredu a do strán. Na farbenie aktínu sa priamo merala stredná intenzita fluorescencie v kanáli Alexa 488. Pre všetky protilátkové škvrny sa percento Alexa 488 alebo PE-pozitívnych buniek určilo pomocou intervalovej brány, ktorej spodná hranica bola nastavená na základe izotypovej kontroly. Všetky experimenty sa uskutočnili trikrát nezávisle.

2.3.1 Farbenie bunkových povrchových receptorov protilátkami.

povrch. Bunky MDBK slúžili ako pozitívna kontrola na expresiu v 3, bunky IB-RS{2}} slúžili ako pozitívna kontrola na expresiu v 8 a bunky CHO-K1 slúžili ako pozitívna kontrola na expresiu HS . Bunky CHO677 neexprimujú žiadny z testovaných integrínov ani HS, a preto slúžili ako negatívna kontrola vo všetkých experimentoch. Boli použité nasledujúce protilátky: pre v 3, PE-konjugovaný klon LM609 (riedenie 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); pre v 8, primárna protilátka 11E8, klon 68, myšacia IgG2a (riedenie 1:100) (láskavo poskytol Dr. StephenNishimura) so sekundárnou protilátkou kozia anti-myšia IgG2a (riedenie 1:1000) konjugovaná s Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); pre HS, klon 10E4, myš IgM (riedenie 1:200) (Amsbio, Abingdon, UK) so sekundárnou protilátkou kozí anti-myší IgM mu reťazec (riedenie 1:2000) konjugovaný s Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, UK) . V každom experimente bola použitá iba jedna primárna protilátka.

Suspenzné bunky sa premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Adherentné bunky sa oddelili použitím 10 mM EDTA v PBS a potom sa premyli PBS. Po premytí sa bunky prefiltrovali cez bunkové sitko (nylonová sieťka, priemer pórov 70 μm, VWR, Radnor, USA), aby sa odstránili bunkové zhluky a upravili sa na 1 × 106 buniek/ml pred 1 μl LIVE/ Farbivo mŕtvych buniek DEAD FixableViolet (Thermo Fisher Scientific) sa pridalo do 1 ml bunkovej suspenzie na 30 minút. Tento krok a všetky nasledujúce kroky boli vykonané chránené pred svetlom a pri 4 °C. Primárna protilátka bola inkubovaná 30 minút a sekundárna protilátka bola inkubovaná 20–30 minút. Po všetkých krokoch sa uskutočnil premývací krok s 2 ml FACS pufra (PBS, 0,1 percenta azidu sodného, ​​0,1 percenta BSA) a centrifugácia pri 300 x g, 5 minút, 4 °C. Nakoniec sa zafarbené bunky resuspendovali v 300 ul FACS pufra.

2.3.2 Farbenie aktínom.

Vláknitý aktín sa zafarbil pomocou činidla Phalloidin-iFluor 488 (ab176753, Abcam), pripraveného podľa údajového listu. Bunky BHK179, BHK-2P a BHK-InV boli oddelené, ako je opísané vyššie, a fixované 4-percentným formaldehydom počas 20 minút pri izbovej teplote (RT). Bunky sa dvakrát premyli PBS a 1 x 106 fixovaných buniek sa permeabilizovalo s 0,1 percentným Tritonom X-100 (Sigma-Aldrich) v PBS, nasledovala inkubácia pri teplote miestnosti počas 3 minút. Bunky sa dvakrát premyli PBS (centrifugácia pri 300 x g, 5 minút) pred pridaním pripraveného zásobného roztoku faloidínu, zriedili sa 1:1000 v FACS pufri a inkubovali sa 20 minút pri teplote miestnosti. Nakoniec sa bunky dvakrát premyli FACS tlmivým roztokom a resuspendovali sa v 300 ul FACS tlmivého roztoku. Zafarbené bunky sa analyzovali priamo fluorescenčným mikroskopom a použili sa na analýzu FACS.

2.3.3 Experimenty s transfekciou.

Bunky BHK164 a BHK-2P boli transfekované buď EGFP-N1, plazmidom exprimujúcim zosilnený zelený fluorescenčný proteín (EGFP) (Clontech), alebo v inej sérii experimentov s pVSV-G, plazmidom exprimujúcim G proteín vezikulárneho vírus stomatitídy Indiana (VSV), s použitím Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, 2 ug plazmidovej DNA a 1, 875 ul alebo 3, 75 ul lipofektamínu zriedeného v médiu Cellvento™ BHK200 sa zmiešali a inkubovali pri teplote miestnosti počas 20 minút, aby sa umožnila tvorba komplexu. Potom sa tieto zmesi preniesli do buniek v 12-jamkových doštičkách (približne 4 x 105 buniek/ml) a pridalo sa médium do objemu 200 ul. Bunky boli inkubované pri 37 °C počas 24 hodín.

Na analýzu FACS sa celý obsah jamiek zozbieral po 24 hodinách. Bunky transfekované pEGFP sa trikrát premyli PBS a resuspendovali sa v 30}0 ul FACS pufra. Jeden duplikát buniek transfekovaných pVSV-G bol permeabilizovaný PBS s 0,1 percentami (objem/objem) TritonX-100 počas 5 minút pri teplote miestnosti pred farbením protilátkou, zatiaľ čo druhý zostal nepermeabilizovaný. Farbenie protilátok sa uskutočnilo tak, ako je opísané vyššie, s polyklonálnym králičím sérom VSV 274/E (riedenie 1:500, láskavo poskytol Dr. Stefan Finke) a sekundárnou kozou protilátkou proti králikom (H plus L) konjugovaným s Alexa Fluor 488 (riedenie 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Štatistická analýza

Údaje boli analyzované pomocou GraphPad Prism verzie 07.04 pre Windows (GraphPad Software, La Jolla, USA). Obyčajná jednosmerná analýza rozptylu bola vykonaná s Tukeyho post-hottest na vyhodnotenie rozdielov medzi liečebnými skupinami. Prah štatistickej významnosti bol stanovený na p-hodnotu 0,001.

2.5 Analýza transkriptómu

2.5.1 Extrakcia RNA, príprava knižnice a sekvenovanie.

Na analýzu transkriptómu sa použili tri nezávislé šarže každej z adherentných bunkových línií BHK179 a suspenzných bunkových línií BHK-2P a BHK-InV. V priemere 8,3×105 buniek BHK179, 1,6×107 BHK-2Pbuniek a 1,4×107 buniek BHK-InV bolo lyzovaných v TRIzolovom činidle (Thermo Fisher Scientific). Po pridaní 0,2 objemu trichlórmetánu do bunkového lyzátu, inkubácii a odstredení sa vodná fáza oddelila a zmiešala s jedným objemom 100 percentného etanolu. Z toho sa extrahovala celková RNA pomocou súpravy RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) so štiepením DNázou na kolóne pomocou súpravy DNázy bez RNázy (Qiagen) podľa pokynov výrobcu. Pridal sa ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) a použil sa ako vnútorná kontrola pre všetky nasledujúce kroky. Ďalej bola polyadenylovaná mRNA izolovaná z 1–3 ug vysokokvalitnej celkovej RNA pomocou súpravy Dynabeads mRNA DIRECT Micro kit (ThermoFisher Scientific). mRNA sa následne fragmentovala a použila na syntézu cDNA a prípravu knižnice s použitím súpravy TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, USA) podľa pokynov výrobcu. Sekvenovanie sa uskutočnilo v Heinrich-Pette-Institut, Hamburg, s použitím zariadenia NextSeq 500 (2x75 bp) a HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina).

2.5.2 Štatistická analýza diferenciálnej génovej expresie.

Kontrola kvality nespracovaných čítaní z každej sekvenčnej knižnice bola vykonaná pomocou FastQC (verzia {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, UK) s dôrazom na distribúciu čítacej dĺžky a kontamináciu adaptéra pred a po adaptéri orezanie pomocou Trim Galore (verzia 0.6.{5}}dev, Babraham Institute) a Cutadapt (verzia 2.10) [15]. Pomocou lososa [16] boli orezané surové údaje potom kvázi mapované do genómu sýrskeho zlatého škrečka.

Stručne povedané, genómové a transkriptové referencie GCF{{0}}.1_MesAur1.0 boli získané z Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI) a skombinované s referenčnými sekvenciami ERCC spike- v kontrolách. Skonštruoval sa index transkriptómu s vedomím návnady [17], aby sa umožnilo selektívne porovnanie s lososom. Na kvantifikáciu sa použilo desať bootstrap replikátov a umožnila sa kompenzácia pre sekvenčne špecifické odchýlky, GC odchýlky a 5' alebo 3' polohové odchýlky.

Následne boli kvantifikačné údaje pre ERCC spike-in kontroly korelované s ich teoretickou koncentráciou, aby sa zistili problémy počas prípravy vzorky.

Okrem toho boli génovo špecifické kvantifikačné údaje najprv filtrované (iba gény, ktoré sa objavujú vo viac ako jednom replikáte s viac ako 15 počtami), normalizované pomocou regulovanej log transformácie (rlog) a použité na prieskumnú analýzu údajov, napr. s PCA. Identifikovali sa rozdielne exprimované gény a následne sa použili na analýzu dráhy pomocou DESeq2 [18]. Údaje o expresii sa analyzovali na významne rozdielne exprimované gény medzi pármi bunkových línií BHK-2P a BHK179, BHK-InV a BHK-2P a BHK-InV a BHK179. Následne bola výsledná binárna logaritmická (log2) násobná zmena upravená pomocou funkcií "lfcShrink" a "apglm" v DESeq2, aby sa kompenzovali nízke alebo premenlivé počty čítaní, ktoré môžu viesť k nadhodnoteniu rozptylu [19].

Kritériá pre výrazne odlišne exprimovaný gén boli nastavené na maximálnu upravenú hodnotu {{0}}.05 a minimálnu absolútnu hodnotu zmenšenej log2 násobnej zmeny 1. Cesta a kritériá pre významne odlišne exprimovaný gén boli nastavené na maximálnu upravenú hodnotu 0,05 a minimálnu absolútnu hodnotu zmenšenej log2 násobnej zmeny na 1. Analýza dráhy a obohatenia sa uskutočnila pomocou funkcie "obohacovať" v klastrovom profile (verzia 3.16.0).

cistanche môže vyživovať obličky a zlepšiť funkciu obličiek

3. Výsledky

3.1 Citlivosť bunkovej línie na FMDV je nezávislá od jej individuálnej rýchlosti rastu a počtu bunkových delení

Dávkové experimenty s deviatimi rôznymi suspenznými bunkovými líniami BHK sa uskutočňovali počas obdobia šiestich dní a hustota životaschopných buniek (VCD) a životaschopnosť sa merali denne. Na základe predchádzajúcich pozorovaní, že bunkové línie sa líšili vo svojej citlivosti na sérotyp FMDV Ázia{{0}} [12], sa skúmalo, či zvýšený bunkový metabolizmus a rýchlosť rastu súvisí so zníženou náchylnosťou na infekciu týmto vírus (tabuľka 1). Dve z troch suspenzných bunkových línií BHK sú pomaly rastúce bunky s malým počtom delených buniek (cd) 0,60 (#3) a 0,70 (#9), zatiaľ čo tretia citlivá bunková línia (#8) má najvyššiu rýchlosť rastu a cd (μ=0.035, cd=1.62) spomedzi všetkých testovaných bunkových línií.

Odstránenie séra a prispôsobenie sa rastu v ACFM nemalo vplyv na citlivosť na FMDV v našom súbore skúmaných bunkových línií. Bunková línia #2 je pomaly rastúci, na sére závislý prekurzor bunkových línií BHK-2P, udržiavaný v suspenzii s GMEM s fetálnym hovädzím sérom. Počas adaptácie na rast v ACFM boli bunky vybrané na vysokú VCD, spojenú s vysokou rýchlosťou rastu a cd. Rovnako ako hlavná bunková línia BHK-2P použitá na štúdiu, bunkové línie #4 a #5 sú tiež odvodené z bunkovej línie #2, ale líšia sa v spôsobe adaptácie na ACFM. Všetky BHK-2P bunkové línie udržiavané v ACFM vykazovali veľmi podobný rastový profil. Citlivosť na sérotyp FMDV Asia-1 nezískala žiadna z týchto bunkových línií počas adaptácie na ACFM, pravdepodobne preto, že pôvodná línia #2 už bola rezistentná. Podobne nebola pozorovaná žiadna zmena v citlivosti pre suspenznú bunkovú líniu #3. Pri adherentnom raste (porovnaj bunkovú líniu č. 1 v [12]) boli bunky citlivé na FMDV Asia-1 a túto vlastnosť si zachovali počas adaptácie na rast v suspenzii. Zároveň nezískali rýchly rastový profil iných suspenzných buniek.

3.2 Suspenzné bunky prezentujú na svojom povrchu menej primárnych receptorov, ale viac sekundárnych receptorov pre FMDV ako adherentné BHK bunky

Prvým krokom, aby vírus úspešne infikoval bunku, je väzba vírusovej častice na receptorové molekuly na bunkovom povrchu. Na analýzu rozdielov medzi adherentne rastúcimi bunkami BHK a bunkami BHK v suspenzii sa testovali protilátky proti bunkovým receptorom zapojených do interakcie extracelulárnej matrice, o ktorých je známe, že hrajú dôležitú úlohu pri infekcii FMDV. Integríny v 3 a v 8 sa skúmali ako reprezentatívne bunkové receptory, ktoré rozpoznávajú väzbový motív RGD (Arg-Gly-Asp) a interagujú so zložkami séra a extracelulárnou matricou, ale FMDV ich používa aj ako svoje prirodzené primárne receptory. Žiadna z testovaných suspenzných bunkových línií (BHK-InV a BHK-2P) neexprimovala integrín v 3 alebo v 8 na bunkovom povrchu. Zatiaľ čo rozdiel medzi adherentným BHK a suspenzným BHK nebol významný pre integrín v 8 (obr. 1b), významne vyššie percento adherentného BHK179 exprimovalo integrín v 3 v porovnaní so suspenznými bunkovými líniami BHK-InV a BHK-2P ( Obr. 1a).

Vysoké množstvá HS boli prítomné na povrchu oboch suspenzných bunkových línií. Expresia HS bola veľmi odlišná medzi replikovanými kultúrami adherentných buniek BHK179. V porovnaní so suspenznými bunkovými líniami bolo menej buniek v kultúrach BHK179 HS-pozitívnych, aj keď rozdiel nebol významný na vopred stanovenej hladine významnosti (obr. 2).

Farbenie a mikroskopická analýza odhalili veľké rozdiely v usporiadaní aktínového cytoskeletu medzi adherentnými a suspenznými bunkami (obr. 3). Aktínové vlákna v adherentných bunkách BHK179 sú rovnomerne distribuované po celej bunke v jemnom retikulárnom vzore (obr. 3a), zatiaľ čo bunky rastúce v suspenzii mali difúzne farbenie aktínu (obr. 3b). Je zaujímavé, že množstvo filamentózneho aktínu sa líšilo medzi suspenznými bunkovými líniami BHK-InV a BHK-2P. Stredná intenzita fluorescencie (MFI) po farbení faloidínom bola významne vyššia v bunkách BHK-InV v porovnaní s BHK-2P, čo naznačuje vyšší obsah filamentózneho aktínu v týchto bunkách (obr. 3c).

3.3 Suspenzné bunky sa líšia v účinnosti transfekcie, ale nie v schopnosti zobrazovať povrchové proteíny

Kvôli rozdielom v aktínovej konformácii medzi adherentnými a suspenznými bunkami boli bunky skúmané s ohľadom na ich prenosnosť a schopnosť prezentovať proteíny na svojom povrchu. Vo všeobecnosti je účinnosť transfekcie, meraná expresiou EGFP, v suspenzných bunkách znížená (obr. 4a). Pri použití nízkej dávky transfekčného činidla výrazne vyššie percento adherentných buniek exprimovalo EGFP v porovnaní so suspenznými bunkami. Keď sa použila vysoká dávka transfekčného činidla, úspešne sa transfekovalo vyššie percento suspenzných buniek, hoci rozdiel medzi vysokými a nízkymi dávkami nebol významný. Na zodpovedanie otázky, či sú suspenzné bunky stále schopné prezentovať na svojom povrchu proteíny, ako sú bunkové receptory, boli bunky transfekované plazmidom kódujúcim VSV G proteín (obr. 4b). Jedna séria buniek bola pred farbením permeabilizovaná, aby sa zohľadnila možnosť, že G proteín bol exprimovaný, ale nebol zobrazený na bunkovom povrchu. Nezistil sa žiadny významný rozdiel v schopnosti exprimovať a prezentovať VSV G proteín medzi adherentnými a suspenznými bunkami, a to ani pri použití nízkej alebo vysokej dávky transfekčného činidla.

3.4 Analýza transkriptómu odhaľuje rozdiely v expresii génov súvisiacich s extracelulárnou matricou medzi suspenznými bunkami

Uskutočnila sa transkriptómová analýza, aby sa ďalej preskúmali rozdiely medzi adherentne rastúcimi bunkami BHK a bunkami BHK v suspenzii a aby sa objasnilo, prečo sa suspenzné bunky líšia vo svojej citlivosti na FMDV. Adherentná bunková línia BHK (BHK179) kultivovaná v MEM doplnenom o FBS, ako aj rýchlo rastúca bunková línia citlivá na FMDV (BHK-InV) a rýchlo rastúca rezistentná bunková línia (BHK-2P), obe prispôsobené na ACFM, boli vybrané na analýzu.

Analýza hlavnej zložky (PCA) zdôraznila úzky vzťah medzi biologickými replikátmi jednotlivých bunkových línií (obr. 5a). Všetky replikáty tej istej bunkovej línie sú umiestnené tesne vedľa seba na grafe s malým náznakom účinkov medzi jednotlivými dávkami. Prvá hlavná zložka (ktorá predstavuje 81 percent rozptylu v normalizovanom súbore údajov) bola interpretovaná ako transkripčný rozdiel medzi bunkami rastúcimi v suspenzii a bunkami rastúcimi v adherencii, zatiaľ čo druhá hlavná zložka (15 percent rozptylu) predstavovala rozdiel medzi suspenzné bunkové línie BHK-2P a BHK-InV, pravdepodobne spojené s náchylnosťou na infekciu FMDV. Prvé dve hlavné zložky spolu dokázali vysvetliť 96 percent rozptylu zistených v súbore údajov, čo naznačuje, že analýza transkriptómu identifikovala relevantné rozdiely medzi tromi bunkovými líniami.

Najmenší počet rozdielne exprimovaných génov sa zistil pri porovnaní BHK-InV s BHK-2P (590 up-regulovaných; 304 down-regulovaných). Podobné čísla boli pozorované pri porovnaní buď BHK-2P alebo BHK-InV jednotlivo s BHK179 (1527 a 1519 regulované smerom nahor; 1308 a 943 regulované nadol) (obr. 5b). Keď sa spojili dve suspenzné bunkové línie (BHK-InV a BHK-2P) a porovnali sa s adherentnou bunkovou líniou BHK179, rozdielne sa exprimovalo 1814 génov. Zatiaľ čo 411 génov je výlučne odlišne exprimovaných pri porovnaní BHK179 s BHK-InV, takmer dvakrát toľko (701 génov) je výlučne odlišne exprimovaných medzi BHK179 a BHK-2P. Medzi dvoma suspenznými bunkovými líniami bolo výlučne odlišne exprimovaných iba 104 génov.

Pri porovnaní súboru rozdielne exprimovaných génov bunkových línií BHK179 a BHK-InV citlivých na FMDV s bunkovou líniou BHK-2P rezistentnou na FMDV sa zistilo, že podskupina 553 génov je v oboch porovnaniach exprimovaná odlišne ( Obr. 5c). Keďže tieto gény sa môžu podieľať na citlivosti na FMDV, uskutočnila sa analýza obohatenia termínom GO a odhalila sa, že mnohé z týchto génov súvisia s bunkovými zložkami extracelulárnej matrice (ECM), bunkovými membránami a spojeniami bunka-bunka (obr. 5d). .

Pretože sme pozorovali rozdiely medzi bunkovými líniami súvisiacimi s interakciami ECM, transkriptóm bol opätovne analyzovaný so zameraním na expresiu integrínov v 1, v 3, v 6, v 8, ako aj aktínu, ktoré sú všetky potenciálne relevantné pre citlivosť na infekciu FMDV. (Obr. 5e). S výnimkou ACTA2 nebol žiadny významný rozdiel v expresii génov súvisiacich s aktínom medzi BHK-InV a BHK-2P bunkami na úrovni mRNA. Počty normalizovaných génov pre všetky skúmané gény súvisiace s aktínom boli významne vyššie v adherentnej bunkovej línii BHK179 ako v suspenzných bunkových líniách (obr. S1).

Všetky tri bunkové línie exprimovali podobné množstvá ITGAV transkriptov, kódujúcich integrínovú podjednotku v, ale vykazovali rozdielnu expresiu pre integrínové podjednotky. Podrobnejšie, suspenzné bunkové línie BHK{0}}P a BHK-InV exprimovali významne menej ITGB1, ITGB3 a ITGB6 v porovnaní s adherentnou bunkovou líniou BHK179. ITGB3 a ITGB8 boli významne rozdielne exprimované medzi suspenznými bunkovými líniami BHK-2P a BHK-InV. Je zaujímavé, že ITGB8 bol jediným génom kódujúcim podjednotku integrínu, ktorý bol vysoko nadmerne exprimovaný v bunkových líniách BHK179 a BHK-InV citlivých na FMDV v porovnaní s bunkovou líniou BHK-2P rezistentnou na FMDV (obr. 5e).

cistanche môže vyživovať obličky a zlepšiť funkciu obličiek

4. Diskusia

Adaptácia buniek na rast v suspenzii a v médiu bez séra je časovo náročný a postupný, ale nevyhnutný proces v biotechnológiách na vytvorenie vysoko výnosných bunkových línií používaných na produkciu protilátok, vakcínových antigénov alebo iných proteínov [1, 8 ]. V skutočnosti je tento proces vždy spojený s rizikom, že bunky získajú nežiaduce vlastnosti v porovnaní s pôvodným bunkovým materiálom [7]. V prípade produkcie vakcínového antigénu má hlavný význam citlivosť bunkovej línie na cieľový vírus. V prípade vírusu slintačky a krívačky (FMDV) je dobre známym javom, že určité bunkové línie BHK sú rezistentné voči infekcii alebo strácajú svoju citlivosť počas opakovanej subkultivácie [20–22]. Antigénne vlastnosti vírusu sa navyše môžu meniť v závislosti od hostiteľskej bunky [9].

Suspenzné bunky rastú nezávisle od povrchu a sú pohltené živnými médiami bohatými na kyslík, čo im umožňuje rýchly rast. Rýchle množenie buniek je požadovaná vlastnosť na jednoduché a v krátkom čase zväčšenie kultúry na veľké objemy. Odstránenie séra z média je nevyhnutné na zníženie nákladov, rizika kontaminácie a na zjednodušenie procesov downscale [23, 24].

Vsádzková analýza rastu rôznych suspenzných bunkových línií BHK bola určená na určenie, či selekcia smerom k rýchlo rastúcej bunkovej populácii v podmienkach bez séra je škodlivá pre propagáciu FMDV. V skutočnosti dve z troch citlivých bunkových línií rástli pomaly, ale zistilo sa, že ich citlivosť na FMDV je nezávislá od ich rastového metabolizmu. Je pravdepodobnejšie, že citlivosť na FMDV je už stratená (alebo zachovaná) počas počiatočnej adaptácie na rast v suspenzii. Oddelenie buniek od povrchu a stiahnutie séra v nasledujúcich krokoch adaptácie na rast suspenzie vedie k zmenám v úrovni expresie povrchových proteínov a proteínov zapojených do cytoskeletu [7].

Integríny sú dôležitou rodinou receptorov bunkového povrchu, ktoré sú integrované do bunkovej membrány a sprostredkúvajú medzibunkovú signalizáciu, ako aj silné spojenie medzi bunkou a povrchom prostredníctvom väzby zložiek extracelulárnej matrice (ECM) [10, 25 ]. Regulácia bunkového cyklu, organizácia cytoskeletu a translokácia molekúl vznikajúcich receptorov do bunkovej membrány závisí od integrínov [25]. V prípade mnohých integrínov je väzba ECM, ako aj väzba ligandov poskytnutých bunkám pridaním séra do kultivačného média sprostredkovaná motívom RGD [6, 25] a pravdepodobne sa zmení, keď sa bunkový prechod z adherentného na suspenzný rast. Rozpoznanie RGD motívu integrínmi využíva aj FMDV na spustenie receptorom sprostredkovanej endocytózy vírusovej častice [26]. Motív RGD vo VP1 FMDV je vysoko konzervovaný [27] a integríny v 1, v 3, v 6 a v 8 sú známe receptory používané FMDV in vivo a in vitro [28–31]. Pretože predpokladané rozdiely v proteóme bunkového povrchu medzi adherentnými a suspenznými bunkami môžu byť rozhodujúce pre rozdiely v citlivosti na infekciu FMDV, protilátky viažuce sa na integrín v 3 a v 8 sa použili na farbenie adherentnej bunkovej línie BHK, ako aj citlivú a rezistentnú suspenznú bunkovú líniu BHK. Neuskutočnilo sa žiadne farbenie v6, pretože sa už predtým ukázalo, že tento integrín nie je exprimovaný na povrchu buniek BHK [32], aj keď je mRNA ITGB6 detegovateľná. Podobne, napriek vysokej úrovni expresie ITGB8 mRNA detegovanej v bunkách BHK179 a BHK-InV, integrín v8 sa nezdá byť prítomný na povrchu buniek BHK vo všeobecnosti. Integrín v 3 bol nájdený v menšej miere na adherentnej bunkovej línii, ale nie na suspenzných bunkových líniách.

Okrem integrínov môže byť väzba ligandu, procesy internalizácie a intracelulárna signalizácia sprostredkované proteoglykánmi heparánsulfátu (HS) [33] a získanie HS ako sekundárneho receptora sa často pozoruje po opakovanom pasážovaní FMDV v kultúre [34]. Špecifické farbenie protilátkou odhalilo hojnú HS na oboch suspenzných bunkových líniách a v menšej miere aj na adherentných BHK bunkách. Je známe, že mutácie v genóme FMDV, ktoré vedú k zmenám vo vírusových kapsidových proteínoch umožňujúcich použitie HS ako receptora, oslabujú vírus v prirodzenom hostiteľovi [35]. Dostupnosť HS môže byť preto kľúčovým faktorom pre zmenenú antigenicitu nezávislosti FMDV bunkovej línie, na ktorú bol vírus adaptovaný.

Pretože bunkové odlúčenie je spojené so zmenami v kontraktilnom mechanizme aktín-myozín [7] a kultivácia buniek v suspenzii prináša rôzne požiadavky na prežitie, napr. odolnosť voči vysokému šmykovému napätiu v dôsledku miešania kultivačnej tekutiny [6], aktínový skelet bol veľký záujem o túto štúdiu. Mikroskopická analýza odhalila konformačné preskupenie cytoskeletu z retikulárnej distribúcie v adherentných rastúcich bunkách na hustú sférickú štruktúru v podmienkach suspenzie. Toto môže byť mechanizmus prispôsobenia vyššie uvedenému vysokému šmykovému namáhaniu a je tiež známe, že sa vyskytuje v CHO bunkách za rovnakých podmienok [6]. Je však tiež pozoruhodné, že zatiaľ čo medzi BHK-InV a BHK-2P bunkami na úrovni mRNA nebol významný rozdiel v expresii väčšiny aktínových génov, v BHK citlivom na FMDV sa detegovalo podstatne viac vláknitého aktínového proteínu. -InV ako v prípade BHK odolnej voči FMDV-2P. To môže súvisieť s rôznymi rýchlosťami polymerizácie globulárneho aktínu na filamentózny aktín.

Prinajmenšom v adherentných bunkách závisí vstup FMDV od dynamiky aktínu. Vstup vírusu indukuje aktínové rufle a narušenie siete aktínových filamentov prostredníctvom premeny filamentózneho aktínu na globulárny aktín bolo opísané vo včasnom štádiu infekcie [36–38]. Súdiac podľa cytopatického efektu (CPE) pozorovaného v adherentných BHK bunkách, keď sú infikované FMDV, cytoskelet prechádza intenzívnymi prestavbami mnohých jeho komponentov [38]. Takýto CPE sa v suspenzných bunkách nepozoruje kvôli ich už guľovitému tvaru, ale zvýšený obsah aktínu môže poskytnúť vírusu určitú výhodu. Kvôli rozdielom v aktínovom cytoskelete sa uskutočnili transfekčné experimenty na porovnanie účinnosti transfekcie medzi suspenziou a adherentným BHK a na určenie, či hustý cytoskelet suspenzných buniek bráni prezentácii proteínov na bunkovom povrchu. Je všeobecne známe, že suspenzné bunkové línie sa veľmi ťažko transfekujú, čo je spôsobené zníženým pripojením transfekčného komplexu na bunkovú membránu a následne zníženým vychytávaním užitočného zaťaženia DNA [39]. Potvrdili to aj naše experimenty. Ale hoci účinnosť transfekcie bola znížená v BHK-2P bunkách v porovnaní s adherentnou BHK bunkovou líniou, nebol žiadny rozdiel v schopnosti zobraziť transfekovaný VSV G proteín na bunkovom povrchu. Rozdiel v percentách zafarbených buniek bol pozorovaný medzi expresnými plazmidmi pEGFP-N1 a pVSV-G v BHK-2P bunkách. Toto sa ďalej neskúmalo, ale môže to byť spôsobené odlišným limitom detekcie medzi imunofluorescenčným farbením používaným na vizualizáciu VSV-G a vrodenou fluorescenciou EGFP.

Nakoniec sa uskutočnila transkriptómová analýza, aby sa poskytlo viac informácií o transkripčných rozdieloch medzi adherentnými a suspenznými bunkami BHK na jednej strane a medzi bunkovými líniami BHK citlivými na FMDV a bunkovými líniami BHK rezistentnými na FMDV na strane druhej. Naše výsledky sú v súlade s inými štúdiami transkriptomických zmien v bunkách CHO, MDCK alebo HEK počas prechodu z adherentného rastu na suspenzný. Vo všeobecnosti väčšina zmien súvisí s cytoskeletálnou štruktúrou, bunkovým metabolizmom a interakciami zložiek ECM a sú upregulované pre suspenzné bunky [7, 40, 41]. Prekvapivo suspenzná bunka BHK-2P rezistentná na FMDV vykazovala downreguláciu týchto génových súborov, čo by mohlo tiež vysvetliť znížené hladiny aktínu v BHK-2P v porovnaní s bunkami BHK-InV. Špecifická analýza expresie integrínovej podjednotky odhalila podobné hladiny transkriptov integrínovej podjednotky V vo všetkých troch bunkových líniách. Najvyššia expresia vo všetkých bunkových líniách bola zistená pre integrínovú podjednotku 1. Je dôležité poznamenať, že integrín 1 môže tvoriť heterodiméry s desiatimi rôznymi reťazcami a je konštitutívne exprimovaný väčšinou cicavčích buniek [6, 42]. Podobne je podjednotka V schopná tvoriť heterodimér s piatimi rôznymi reťazcami, ale 6 a 8 sú na bunkovom povrchu prítomné iba v kombinácii s V [42]. Toto sa presne odráža v pozorovanom množstve transkriptov jednotlivých integrínových podjednotiek. Zvýšená transkripcia 3 v adherentných bunkách tiež dobre koreluje s vyšším signálom pre integrín v 3 v experimentoch s farbením protilátky. Na druhej strane pozorované rozdiely v hladinách mRNA ITGB3 a ITGB8 medzi BHK-2P a BHK-InV sa neodrazili vo farbení povrchu. Neboli sme schopní vyriešiť, či to bolo len kvôli rozdielnej citlivosti medzi metódami kvantifikácie mRNA a proteínov alebo či to svedčí o post-transkripčnom bloku expresie proteínu alebo povrchovej prezentácie [43]. Suspenzné bunkové línie BHK-2P a BHK-InV celkovo exprimovali významne menej mRNA ITGB1, ITGB3 a ITGB6 v porovnaní s adherentnou bunkovou líniou.

5. ZáveryIn

Záverom možno povedať, že pri príprave suspenzných buniek je mimoriadne dôležité použiť rodičovský bunkový klon s dobre známymi charakteristikami a starostlivo skrínovať výslednú bunkovú populáciu počas adaptačného procesu, aby sa zabezpečilo, že si bunková línia zachová základné vlastnosti, v tomto prípade , náchylnosť na FMDV. Okrem toho by sa na ďalšiu charakterizáciu produkčných bunkových línií mali použiť moderné metódy, ako je analýza FACS a transkriptomika.

cistanche môže vyživovať obličky a zlepšiť funkciu obličiek

Poďakovanie

Ďakujeme Patrickovi Zitzowovi za jeho vynikajúcu technickú podporu.

Autorské príspevky

Konceptualizácia:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Formálna analýza:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Akvizícia financií:Aline Zimmer, Martin Beer.

Vyšetrovanie:Veronika Dill.

Metodológia:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Administrácia projektu:Martin Beer. Zdroje: Aline Zimmer.

Dohľad:Michael Eschbaumer.

Vizualizácia:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Písanie – pôvodný návrh:Veronika Dill.

Písanie – kontrola a úprava:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, MichaelEschbaumer.

Referencie

1. Merten OW. Pokroky v bunkovej kultúre: závislosť od ukotvenia. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Rekombinantné terapeutické proteíny: produkčné platformy a výzvy. Biotechnol J.2008; 3(1):90-7.

3. Hernandez R, Brown DT. Rast a udržiavanie obličkových buniek škrečka (BHK). Curr ProtocMicrobiol. 2010; Kapitola 4: Dodatok 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D a kol. Adaptácia BHK buniek produkujúcich rekombinantný proteín na médium bez séra a médium bez proteínu. Cytotechnológia. 1998; 26 (1): 59-64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Adaptácia buniek BHK-21 na rast v kultúre na trepačke a následná expozícia vírusom japonskej encefalitídy. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433-8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.{11}}.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Význam interakcie medzi integrínom a aktínovým cytoskeletom pri adaptácii suspenzie CHO buniek. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178 (7): 1286-302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Monitorovanie zmien v proteóme počas postupnej adaptácie MDCK bunkovej línie od adherencie k rastu v suspenzii. Vakcína. 2015; 33(35):4269-80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R a kol. Vplyv adaptácie buniek na podmienky bez séra na profil glykozylácie monoklonálnej protilátky produkovanej bunkami vaječníkov čínskeho škrečka. N Biotechnol. 2013; 30(5):563-72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR a kol. Výber hostiteľských buniek antigénnych variantov vírusu slintačky a krívačky. J Gen Virol. 1989; 70 (Pt 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Interakcie integrínu a aktínu. Cell Mol Life Sci. 2005; 62(10):1081-99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Analýza expresie integrínového receptora vírusu slintačky a krívačky v tkanivách naivného a infikovaného dobytka. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. Adaptácia FMDV Asia-1 na suspenznú kultúru: Bunková rezistencia je prekonaná zmenami kapsidov vírusu. Vírusy. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Polyomová transformácia bunkových klonov škrečka – skúmanie genetických faktorov ovplyvňujúcich bunkovú kompetenciu. Virológia. 1962; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Proces kultivácie buniek na mikronosičoch na množenie vírusu besnoty v bunkách Vero pestovaných v miešanom bioreaktore za podmienok úplne bez živočíšnych zložiek. Vakcína. 2007; 25(19):3879-89.

15. Martin M. Cutadapt odstraňuje sekvencie adaptérov z vysokovýkonných sekvenčných čítaní. EMBnetjournal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon poskytuje rýchlu a skreslenú kvantifikáciu expresie transkriptu. Metódy Nat. 2017; 14(4):417-9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. Metodika zarovnania a mapovania ovplyvňuje odhad hojnosti transkriptov. Genome Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Moderovaný odhad násobnej zmeny a disperzie pre dáta RNA-seq s DESeq2. Genome Biol. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Láska MI. Ťažké predchádzajúce distribúcie údajov o počte sekvencií: odstránenie šumu a zachovanie veľkých rozdielov. Bioinformatika. 2019; 35(12):2084-92.

20. Clarke JB, Spier RE. Rozdiely v citlivosti populácií BHK a klonovaných bunkových línií na tri kmene vírusu slintačky a krívačky. Arch Virol. 1980; 63 (1): 1-9.