Alkoholovo špecifická transkripčná dynamika obnovy pamäte a relapsu, časť 4

Okrem Arc sme zistili, že hladiny mRNA Egr1, ale nie Bdnf, sa zvýšili v DH a mPFC pomocou získavania alkoholovej pamäte.

Ako čas plynie, ľudia postupne získavajú nové chápanie tajomstva zabudnutia. V tomto procese sa obnovovanie pamäte pomocou novej technológie postupne stalo hotspotom výskumu.

Existuje teda vzťah medzi získavaním pamäte z alkoholu a výkonnosťou pamäte? Poďte sa teraz pozrieť! V prvom rade si musíme ujasniť: získavanie alkoholovej pamäte nie je samostatnou technológiou. Ide o technológiu, ktorá ovplyvňuje mozgové neuróny prostredníctvom alkoholu. Tento proces môže aktivovať niektoré „spiace“ spomienky v mozgu, čo nám umožňuje obnoviť tieto spomienky.

Po druhé, musíme vedieť, že zlepšenie pamäte nám jednoducho neumožňuje „zapamätať si“ viac vecí, ale je to proces získavania a rekonštrukcie spomienok rôznymi spôsobmi. Tento proces nám môže pomôcť lepšie upevniť a pochopiť vedomosti, ktoré sme sa naučili, a tým zlepšiť našu pamäť.

Preto môžeme konštatovať, že existuje vzťah medzi získavaním pamäte po alkohole a výkonnosťou pamäte. Keď túto technológiu použijeme na opätovné vytiahnutie predchádzajúcich spomienok po požití alkoholu, prechádzame procesom opätovného upevnenia týchto spomienok, čím sa naša pamäť do určitej miery zlepšuje.

Samozrejme, musíme tiež poznamenať, že vyhľadávanie pamäte alkoholom nie je dlhotrvajúca a spoľahlivá technika na zlepšenie pamäte. Ak chceme mať dlhodobo výbornú pamäť, musíme si neustále upevňovať a zlepšovať pamäť každodenným štúdiom a životom v kombinácii s inými technikami tréningu pamäti.

V tomto procese si musíme vždy zachovať optimistický postoj, aby sme lepšie stimulovali našu motiváciu k učeniu a pamäťový potenciál. Postavme sa preto trénovaniu pamäte aktívne, buďme neustále sami sebou a odvážne napredujme na ceste neustáleho zlepšovania pamäte! Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov. Tieto látky sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho Mäso môže tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatok živín a energie, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknutím teraz zlepšíte krátkodobú pamäť

Zvýšená expresia mRNA Egr1 bola predtým zapletená do opätovného upevnenia spomienok na strach a drogy [19, 21, 48, 61], čo zvyšuje možnosť, že tento transkripčný faktor zohráva úlohu aj pri rekonsolidácii spomienok na alkohol.

Zatiaľ čo úloha Bdnf pri rekonsolidácii pamäte zostáva kontroverzná [19, 49], je známe, že indukcia Bdnf je rozhodujúca pre učenie sa akvizície a zániku pamäte [19, 62]. Neprítomnosť zmeny v expresii Bdnf v našej štúdii by teda mohla naznačovať, že náš postup získavania pamäte neinicioval učenie zániku paralelne s vyhľadávaním pamäte.

Okrem toho sme nedávno uviedli, že aj keď sa hladiny mRNA Bdnf v DH nezvyšujú samotným získavaním alkoholovej pamäte, expresia rastového faktora bola zvýšená, keď po vyhľadávaní nasledovalo averzívne protikondicionovanie, ktoré zabránilo relapsu [44], čo naznačuje komplexnú úlohu Bdnf v dynamike alkoholovej pamäte.

Naše zistenia naznačujú, že zvýšenie expresie IEG nie je jedinečné pre opätovné konsolidovanie spomienok súvisiacich s alkoholom.

V skutočnosti sa ARC a EGR1 predtým podieľali na konsolidácii niekoľkých typov spomienok, vrátane spomienok strachu [19, 46, 47, 62], spomienok na rozpoznávanie [21] a spomienok spojených s rôznymi drogami [20, 22, 61].

Existuje však stále viac dôkazov, že niektoré z mechanizmov, ktoré sú základom hľadania alkoholu, sa môžu líšiť od tých, ktoré kontrolujú prirodzené hľadanie odmeny [5, 27, 28, 63]. Existuje tiež dôkaz, že spomienky na rôzne odmeny (a najmä na rôzne lieky) sú spracované rozdielne [29–32]. Naše zistenia analýzy RNAseq skutočne odhalili jedinečný transkriptomický podpis vyvolaný vyhľadávaním alkoholovej pamäte.

Konkrétne sme našli 44 génov v DH a inú sadu 9 génov v nich PFC, ktoré vykazovali významné zmeny po získaní alkoholovej pamäte. Po ďalšej validácii údajov sme sa zamerali na jeden gén v mPFC (Fkbp5) a tri gény v DH (Adcy8, Scl8a3 a Neto1) a zistili sme, že ich expresia nebola ovplyvnená získavaním spomienok spojených so sacharózou.

To naznačuje, že na rozdiel od Arc a Egr1 tieto 4 špecifické gény pravdepodobne nehrajú všeobecné úlohy pri spracovaní spomienok na odmenu, ale môžu skôr hrať selektívne úlohy pri spracovaní alkoholových spomienok.

Je zaujímavé, že tieto štyri gény sa predtým podieľali na poruche užívania alkoholu a učenia a pamäti. Fkbp5 teda kóduje FK506 väzbový proteín 5, regulátor stresového neuroendokrinného systému [64].

Varianty FKBP5 modulujú závažnosť abstinenčného syndrómu od alkoholu [65] a predpovedajú sklon k ťažkému pitiu u ľudí [66–68]. Ukázalo sa, že delécia Fkbp5 zvyšuje závažnosť odvykania od alkoholu [65] a pitie alkoholu [67] u myší, zatiaľ čo farmakologická inhibícia proteínu znížila miernu konzumáciu alkoholu a obnovenie CPP u myší [69] a znížilo pitie alkoholu u stresovaných samcov potkanov [70].

Hladiny mRNA Adcy8, kódujúcej adenylatcyklázu 8 (AC8), ktorá katalyzuje tvorbu cAMP v reakcii na prílev vápnika a ktorá bola nedávno označená za možný regulátor príjmu alkoholu [28, 71], boli znížené v krvinkách dlhodobo abstinujúcich alkoholikov [72].

Už skôr sa ukázalo, že delécia Adcy8 znižuje pitie alkoholu a zvyšuje citlivosť na sedatívne účinky alkoholu u myší [73]. Okrem toho chronická expozícia alkoholu u potkanov upregulovala mozgovú expresiu nosiča solutu z rodiny 8 (výmenník sodík/vápnik), člena 3 (NCX3), proteínu kódovaného Scl8a3 [74, 75].

Konzumácia alkoholu u potkanov bola tiež spojená so zníženou expresiou Neto1 v mozgovom kmeni [76], ktorý kóduje neuropilín tolloid-like 1 (NRP1), zložku komplexu NMDA-receptor [77].

Tento proteín sa podieľa na synaptickej reorganizácii a prenose v hipokampe [78] a je potrebný pre priestorové učenie a pamäť [77].

Naše zistenia teda ukazujú, že samotné vyhľadávanie spomienok na alkohol, dokonca aj bez akýchkoľvek farmakologických účinkov alkoholu, ovplyvňuje expresiu týchto génov. Ich špecifickú úlohu pri rekonsolidácii alkoholovej pamäte a relapse však treba ešte otestovať.

Obmedzením tejto štúdie je to, že test RNA-seq sa uskutočňoval na hromadných tkanivách mPFC a DH, a nie na jednotlivých bunkách aktivovaných vyhľadávaním pamäte. Konkrétne nedávne štúdie naznačujú, že spomienky vo všeobecnosti [79, 80] a konkrétne spomienky súvisiace s alkoholom [32, 81, 82] sú kódované prostredníctvom aktivácie neuronálnych súborov zložených z malého počtu neurónov, ktoré možno identifikovať pomocou markerov neuronálnej aktivácie ( napr. cFOS) [80].

V skutočnosti sa podobné vzorce aktivácie IEG (cFOS) pomocou získania spomienok na alkohol a sladkú odmenu našli v mPFC a ďalších mezolimbických oblastiach v mozgu potkana [32, 81]. Je teda možné, že vykonanie testu RNA-seq selektívne na súbore neurónov aktivovanom obnovením pamäte by prinieslo presnejšie výsledky.

Stručne povedané, naše zistenia naznačujú, že vyhľadávanie alkoholovej pamäte vyvoláva dva paralelné transkripčné programy. Jeden program, prenášaný prostredníctvom bežných molekulárnych mechanizmov učenia a pamäte, vrátane IEG Arc a Egr1, sa vo všeobecnosti zaoberá konsolidáciou spomienok.

Iný transkripčný program, spustený pri získavaní alkoholovej pamäte, je riadený génmi, ktoré špecificky podporujú správanie súvisiace s alkoholom. Tento model dvojitého spracovania pre spomienky na alkohol zvyšuje možnosť, že rekonsolidácia pamäte pre rôzne spomienky môže mať podobné molekulárne mechanizmy s dvojitým spracovaním, pričom niektoré zložky zdieľajú viaceré pamäte a iné sú jedinečné pre každý typ pamäte.

Tento hypotetický model je ešte potrebné posúdiť testovaním, či manipulácia s týmito génmi ovplyvňuje rekonsolidáciu pamäte alkoholu a sacharózy odlišne. Ak áno, naznačovalo by to, že by bolo možné zamerať sa na molekulárne ciele špecifické pre odmenu pri liečbe porúch súvisiacich s patogénnymi spomienkami, ako je závislosť, a nie narušiť hlavné molekulárne mechanizmy nevyhnutné pre mnohé funkcie nad rámec opätovného upevnenia pamäte alkoholu.

MATERIÁLY A METÓDY

Podrobnosti o prístroji, liekoch a činidlách, návrhu a príprave oligodeoxynukleotidov (ODN), analýzach Westernblot a qRT-PCR a príprave knižnice RNA-seq nájdete v Doplnkových informáciách.

Zvieratá

Samce a samice myší C57BL/JRccHsd (25–30 g), umiestnené 3–4 v klietke, boli chované v Tel-Aviv University Animal Facility (Izrael) a chované v 12-hodinovom cykle svetlo-tma (svetlo sa rozsvieti o 7:00), s potravou a vodou dostupným adlibitum.

V experimentoch zahŕňajúcich úpravu miesta sacharózy bol prístup k potrave obmedzený na 6 hodín pred tréningom, aby sa zvýšila motivácia myší zbierať pelety sacharózy. Toto krátke trvanie nedostatku potravy je založené na zisteniach, že počas dňa 2–6-hodinové hladovanie neovplyvňuje stravovacie návyky [83] a nespúšťa významný posun inmetabolických markerov [84], čím sa minimalizujú účinky potravinového obmedzovania. .

Myši sa vážili dvakrát týždenne, aby sa kontrolovala strata hmotnosti. Všetky experimentálne protokoly boli schválené a boli v súlade s pokynmi Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Univerzite v Tel Avive a usmerneniami NIH (číslo záruky dobrých životných podmienok zvierat A5010-01). Vyvinulo sa maximálne úsilie na minimalizáciu počtu použitých zvierat.

Behaviorálne postupy

Umiestnite klimatizáciu

Alkoholom podmienená preferencia miesta (CPP): Všetky myši si počas 3 dní zvykli na denné ip injekcie fyziologického roztoku.

Základný test (deň 1): Prvý deň boli posuvné dvere zasunuté a myši mohli voľne skúmať celý prístroj počas 30 minút. Kondicionovanie alkoholom (dni 2 – 9): Tréning sa začal 24 hodín po základnom teste jedným sedením podávané denne počas 8 dní so zatvorenými posuvnými dverami. V dňoch 3, 5, 7 a 9 dostali myši alkohol (1,8 g/kg, 20 % v/v; ip) a boli okamžite obmedzené na spárované oddelenie na 5 minút.

Predtým sa ukázalo, že táto dávka a trvanie kondicionovania produkujú alkoholom indukovaný CPP [42, 85]. Každý druhý deň (t. j. 2., 4., 6. a 8. deň) myši dostávali fyziologický roztok a držali sa v nepárovom oddelení na rovnakú dobu ako v deň kondicionovania alkoholom.

Párové kompartmenty boli vyvážené. Test preferencie miesta 1 (10. deň): Test preferencie miesta bol taký, ako je opísané pre základný test, a slúžil na indexovanie alkoholu-CPP [41]. Preferencia bola definovaná ako zvýšenie percenta času stráveného v oddelení s alkoholom počas testu preferencie miesta 1 v porovnaní so základným testom.

Získavanie pamäte (11. deň): Pred týmto štádiom boli myšiam priradené rôzne experimentálne podmienky (zodpovedajúce skóre CPP a pohlaviu). Počas relácie získavania pamäte boli myši obmedzené na 3 minúty v oddelení s alkoholom a potom sa vrátili do svojich domácich klietok. Kontrolné myši boli krátko ošetrené. Test preferencie miesta 2 (deň 12): Myši boli podrobené testu preferencie miesta identickému s testom preferencie miesta 1.

Sacharóza CPP: Predtréning so sacharózou (1. – 6. deň): V dňoch 1 – 3 si myši zvykli zbierať 5 – 6 sacharózových peliet (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) v domácich klietkach . V dňoch 4 až 6 boli myši trénované tak, aby počas 30-minútových stretnutí zhromaždili 3 pelety do prázdnej škatule z plexiskla. Myši, ktoré zhromaždili menej ako šesť peliet (z celkového počtu 9 peliet počas 3 dní) počas tréningu so sacharózou, boli vylúčené z experimentu (2 myši z 32).

Základný test (7. deň): Siedmy deň boli posuvné dvere v komore CPP zatiahnuté a myšiam sa umožnilo skúmať celé zariadenie počas 30 minút. Bol tu tiež prijatý nezaujatý prístup prístroja/nezaujatého priraďovania, ako je opísaný v procedúre alkohol-CPP. Kondicionovanie sacharózou (8. – 15. deň): Tréning sa začal 24 hodín po základnom teste s jedným sedením denne počas 8 dní, s kĺzavým dvere zatvorené. Na 9., 11., 13. a 15. deň boli myši umiestnené do párového oddelenia ao minútu neskôr boli na podlahu rozptýlené tri pelety sacharózy.
Myši boli vrátené do svojich domovských klietok o 15 minút neskôr. V alternatívne dni (t. j. 8., 10., 12. a 14. deň) sa myši umiestnili do nepárového kompartmentu na 15 minút bez rušenia.

Párové kompartmenty boli vyvážené. Test preferencie miesta 1 (deň 16): Test preferencie miesta bol taký, ako je opísané pre základný test, a slúžil na indexovanie sacharóza-CPP. Preferencia bola definovaná ako zvýšenie percenta času stráveného v oddelení so sacharózou počas testu preferencie miesta 1 v porovnaní so základným testom. Obnovenie pamäte (17. deň): Postup obnovenia pamäte sacharózy bol identický s postupom obnovenia pamäte alkoholom (pozri vyššie ).

Validácia oligodeoxynukleotidov (ODN).

Dizajn oblúkových antisense ODN (AS-ODN) a kódovaných ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Izrael) sa riadil skôr popísanými smernicami [56, 86].

Funkčná validácia Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0 0,25 µl/min) bol infúzne podaný do DH v jednej hemisfére a SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}}.5 ul, 0.25 ul/min) sa infúziou podávalo do druhej hemisféry (strany boli vyvážené). O dve alebo štyri hodiny neskôr liečené myši skúmali neznámy kontext (kompartment CPP, pozri opis prístroja vyššie) počas 5 minút, aby vyvolali expresiu ARC závislú od novosti. Myši boli usmrtené o hodinu neskôr (tj 3 alebo 5 hodín po infúzii ODN), mozgové tkanivá boli odobraté a hladiny proteínu ARC boli hodnotené Western bloanalýzou (obrázok S4).

Chirurgický zákrok a intrahipokampálna mikroinfúzia Chirurgický zákrok a mikroinfúzie sa uskutočňovali tak, ako už bolo opísané [42, 87].

Chirurgia. Stereotaxické operácie sa uskutočňovali v anestézii izofluránom. Myši boli umiestnené do stereotaxického rámu (RWD Life Science, Shenzhen, Čína) a bilaterálne vodiace kanyly (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) boli namierené na DH na nasledujúce súradnice (-2 mm posterior od bregmy, ±1,3 mm mediolaterálne, -1,45 mm ventrálne od povrchu lebky). Kanyly boli zaistené dentálnym akrylom. Do vodiacej kanyly sa vložili zodpovedajúce fiktívne kanyly (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) a na vrchu sa umiestnili prachové nádoby, aby sa miesto injektora udržalo zakryté a zbavené nečistôt. Myši sa nechali zotaviť 7 až 10 dní pred tréningom alkohol-CPP.

Intrahipokampálne infúzie. Aktinomycín D (4 µg/µl, 0,5 µl na stranu, 0,25 µl/min, v DMSO) [19] alebo ekvivalentný objem vehikula bol mikroinjikovaný do DH ihneď po načítaní pamäte . Ukázalo sa, že infúzia aktinomycínu D do hipokampu v podobnej koncentrácii narúša rekonsolidáciu pamäte [19]. Oblúkový AS-ODN alebo kontrolný SCR-ODN (2nmol/ul, 0,5 ul/strana, 0,25 ul/min; v PBS) bol mikroinjektovaný do DH 4 hodiny pred alebo 4 hodiny po načítaní pamäte.

Po odstránení kanyly proti prachu a figuríny sa počas 2 minút vykonala mikroinfúzia myšiam, ktoré boli v bdelom stave, pomocou injekčných kanýl (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) siahajúcich 0,5 mm za vodidlo hrot kanyly. Injekčné kanyly boli ponechané na mieste ďalšie 2 minúty. Po infúzii sa do vodiacich kanýl vložili slepé kanyly, zaistili sa nádobkou na prach a zvieratá sa vrátili do svojich domácich klietok. Kanylyelokácie boli overené v 30 μm hrubých koronálnych rezoch tkaniva fixovaného paraformaldehydom zafarbeného kresylovou fialovou.

Analýza dát

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75 % času v ktoromkoľvek z kompartmentov počas základného testu bolo vylúčených zo štúdie (9 z 267). Stanovenie CPP sa potvrdilo porovnaním skóre CPP medzi základnou hodnotou a testom CPP 1 a analyzovalo sa párovým t-testom. Pretože na získanie pamäte je potrebná expresia CPP (tj tvorba pamäte), údaje od myší, ktoré nevykazovali CPP (minimálne 5% zvýšenie preferencie medzi základnou hodnotou a testom 1), boli z experimentu vylúčené (48 z 258).

Alkohol-CPP po interferencii s rekonsolidáciou pamäte sa analyzoval zmiešaným modelom ANOVA s faktorom liečby medzi subjektmi (aktinomycín D alebo ODN) a faktorom testu medzi subjektmi (test CPP 1, test CPP 2). Významné interakcie boli analyzované post hoc testom Student-Newman-Keuls. Hustoty hladín western blotimunoreaktívneho proteínu ARC boli normalizované na hodnoty GAPDH a analyzované jednosmernou ANOVA s faktorom liečby medzi subjektmi, po čom nasledoval Dunnettov post hoc test. Údaje o expresii mRNA qRT-PCR boli normalizované na Gapdh a vyjadrené ako percento expresie kontrolnej skupiny.

Údaje zo všetkých génov pre každú oblasť mozgu sa analyzovali jednosmernou analýzou ANOVA s faktorom liečby medzi subjektmi, po ktorej nasledoval Dunnettov test pre každý gén na porovnanie s údajmi získanými z kontrolnej skupiny (bez vyhľadávania). Pre RNA-sekv. zhromaždili sme tkanivá z 3 zvierat pre každý replikát a pripravili sme nasledujúci počet replikátov: 3 pre dorzálny hipokampus (DH) – bez vyhľadávania, 2 pre DH – vyhľadávanie, 3 pre prefrontálny kortex (PFC) – bez vyhľadávania a 2 pre ( PFC)-vyhľadávanie. Po úplnej izolácii RNA pomocou Trizolu sa pomocou metódy, ktorú sme vyvinuli, vytvorili sekvenačné knižnice [88].

Knižnice boli podrobené 50 bp jednokoncovému sekvenovaniu pomocou IlluminaHiseq 2000. Po potvrdení kvality sekvenčných údajov pomocou FastQC boli čítania mapované do mm9 referenčného genómu pomocou Bowtie2 [89] a označené pomocou Tophat2 [90].

Čítania mapované na gény boli kvantifikované pomocou FeatureCounts [91]. Vylúčili sme Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a a themitochondriálny chromozóm, aby sme sa vyhli množstvu nadmerne amplifikovaných génov, ktoré by mohli skresliť normalizáciu knižnice, ako už bolo opísané [92]. DESeq2 [58] sa použil na identifikáciu rozdielne exprimovaných génov (DEG) v retrievalovej skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou bez retrievalu, s hodnotou p upravenou o medzu významnosti (p(adj) < 0,05).

DOSTUPNOSŤ ÚDAJOV Údaje RNA-seq sú dostupné v NCBI Gene Expression Omnibus na adrese https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) s kontrolným tokenom:knyfwwiorbutvuv.

LITERATÚRA

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Veľké výzvy pre globálne duševné zdravie. Príroda. 2011;475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Farmakologická liečba závislosti od alkoholu: cieľové symptómy a cieľové mechanizmy. Pharmacol Therap. 2006;111:855–76.

3. Sinha R. Nové poznatky o biologických faktoroch predpovedajúcich náchylnosť k relapsu závislosti. Curr Psychiatry Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reaktivita na stimuly súvisiace s alkoholom v laboratóriu a v teréne: prediktory túžby u liečených alkoholikov. Závislosť.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V a kol. Narušenie spomienok súvisiacich s alkoholom inhibíciou mTORC1 zabraňuje relapsu. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Pitie, drogy a rozrušenie: manipulácia s pamäťou na liečbu závislosti. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. Jeden štandard pre pamäť: prípad pre konsolidáciu. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Rekonsolidácia: výhoda nového zamerania. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Rekonsolidácia pamäte po jej opätovnej aktivácii. Behav.Brain Res. 1997;84:241–6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Spomienky na strach vyžadujú syntézu proteínov v theamygdale na opätovné upevnenie po získaní. Príroda. 2000;406:722–6.

For more information:1950477648nn@gmail.com