Prehľad štruktúry a fyziologických úloh proteínu D7 v krvi kŕmiacich nematocera, časť 1

Jednoduché zhrnutie:

Vektory sú organizmy, ktoré môžu prenášať infekčné patogény z jedného hostiteľa (človeka alebo zvieraťa) na druhého. Mnoho prenášačov (vrátane komárov, pieskových mušiek a kliešťov) má jednu spoločnú vlastnosť: sú to krvoživiace (hematofágne) článkonožce. Zakaždým, keď uhryznú svojho stavovca, poranenie kože a ciev spustí sériu reakcií, ktoré na mieste môžu viesť k prerušeniu prietoku krvi do ich úst a k zvýšeniu pozornosti hostiteľa v dôsledku svrbenia a bolesti. Napriek tomu ich sliny obsahujú koktail molekúl schopných pôsobiť proti týmto reakciám hostiteľa (hemostáza, zápal a imunita), čo im umožňuje úspešne sa živiť.

Mnohokrát sú patogény, ktoré prenášajú, vstreknuté do hostiteľa so slinami. Preto je pochopenie zloženia vektorových slín kľúčové pre štúdium ich biológie a ich vektorovej kapacity, ako aj pre navrhovanie nových metód na kontrolu chorôb, ktoré prenášajú (vrátane nových kandidátov na vakcínu). Medzi dôležité rodiny slinných proteínov patrí D7, ktorý je hojne exprimovaný v krvi sajúcich dvojkrídlových a je vzdialene príbuzný s proteínmi viažucimi zápach (OBP). Tu poskytujeme rozsiahly prehľad štruktúry, funkcie a evolúcie proteínu D7, pričom diskutujeme o tom, ako duplikácia génov a modifikácie v ich doménach podobných OBP vedú k zisku a strate funkcie u rôznych hematofágnych druhov Diptera.

Infekčné patogény môžu spôsobiť infekcie a imunitný systém je zodpovedný za obranu proti týmto patogénom a za zabránenie výskytu infekcie. Imunitný systém zohráva kľúčovú úlohu pri identifikácii a ničení patogénov. Infekčné patogény indukujú imunitný systém, aby produkoval protilátky a bunkové imunitné odpovede, ktoré zabraňujú reinfekcii.

Niektoré patogény však môžu obísť alebo oslabiť obranné mechanizmy imunitného systému, čo vedie k zníženiu imunity a tým k zvýšeniu rizika infekcie. Napríklad HIV môže napadnúť CD4 plus T bunky imunitného systému, narušiť funkciu imunitného systému a uľahčiť infekciu.

Oslabená imunita môže tiež spôsobiť, že niektoré infekcie budú vážnejšie a ťažko liečiteľné. Preto je pochopenie vzťahu medzi infekčnými patogénmi a imunitou veľmi dôležité pre prevenciu a liečbu infekčných ochorení. Z tohto hľadiska musíme zlepšiť imunitu. Cistanche dokáže výrazne zlepšiť imunitu. Polysacharidy v mäse môžu regulovať imunitnú odpoveď ľudského imunitného systému, zlepšiť stresovú schopnosť imunitných buniek a zvýšiť baktericídny účinok imunitných buniek.

Kliknite na cistanche tubulosa kúpiť

Abstrakt:

Zakaždým, keď hmyz uhryzne hostiteľa stavovca, poranenie kože a ciev spôsobené piercingom spustí sériu reakcií vrátane hemostázy, zápalu a imunity. Na mieste by tento súbor nadbytočných a prepojených reakcií v konečnom dôsledku spôsobil zrážanie krvi, svrbenie a bolesť, čo by viedlo k uvedomeniu si hostiteľa, čo by v najlepšom prípade viedlo k prerušeniu kŕmenia. Napriek tomu sliny hematofágnych článkonožcov obsahujú komplexný koktail molekúl, ktoré sú rozhodujúce pre úspech kŕmenia krvou.

Medzi dôležité rodiny proteínov, ktoré boli doteraz opísané v slinách článkonožcov sajúcich krv, patrí D7, ktorý je hojne exprimovaný v krvi sa živiacich Nematocera. Proteíny D7 sú vzdialene príbuzné hmyzím proteínom viažucim zápach (OBP) a napriek nízkej sekvenčnej identite viedlo pozorovanie štruktúrnej podobnosti k názoru, že podobne ako OBP by mali viazať/sekvestrovať malé hydrofóbne zlúčeniny. Členovia patriaci do tejto rodiny sa delia na krátke formy a dlhé formy, ktoré obsahujú jednu alebo dve domény podobné OBP. Tu uvádzame prehľad štruktúry a funkcie proteínu D7, pričom diskutujeme o tom, ako duplikácia génov a niektoré modifikácie v ich doménach podobných OBP počas evolúcie vedú k zisku a strate funkcie medzi rôznymi druhmi hematofágov Diptera.

Kľúčové slová:

D7 proteíny; proteíny viažuce zápach; vektorová biológia; hematofágia; vektorové sliny; hemostázu; zápal.

1. Úvod

Ochorenia prenášané vektormi sú veľmi rôznorodé, pokiaľ ide o symptómy, charakteristiky, etiologické agens a ich vektory. Napriek tejto rozmanitosti je spoločným znakom väčšiny známych vektorov skutočnosť, že ide o hematofágne článkonožce. Schopnosť živiť sa krvou predstavuje mnoho výziev vrátane schopnosti nájsť hostiteľa, prepichnúť jeho kožu a nájsť zdroj krvi, vysať krv, aby ju neskôr strávila, a vysporiadať sa s oxidačným stresom spôsobeným jej trávením (prehľad v [1–3] ).

Zakaždým, keď hmyz uhryzne svojho stavovca, poranenie kože a ciev spustí sériu reakcií vrátane hemostázy, zápalu a imunity [1,2,4–8]. Tieto zložité a nadbytočné biologické procesy sú vzájomne prepojené a schopné sa šíriť vďaka produkcii/sekrécii mnohých tried mediátorov, vrátane eikosanoidov, biogénnych amínov, koagulačných a komplementových faktorov.

Na mieste by spôsobili prerušenie prietoku krvi do ústnej časti hematofágneho článkonožca (v dôsledku vaskulárnej konstrikcie, agregácie krvných doštičiek a zrážania krvi) a spustili pozornosť hostiteľa (kvôli svrbeniu a bolesti). Napriek tomu sliny článkonožcov, ktorí sa živia krvou, obsahujú rovnako zložitú a nadbytočnú zmes molekúl schopných pôsobiť proti obrane hostiteľa, ktorá hrá kľúčovú úlohu v úspechu hematofágie (prehľad v [1,2,4–8]). V skutočnosti, ako už uviedol Ribeiro, hematofágne článkonožce sú „živé striekačky“ a ich sliny sú stále relatívne nevyužitým zdrojom farmakologicky aktívnych molekúl [4].

Prítomnosť antikoagulačných molekúl v slinách hematofágnych článkonožcov bola prvýkrát zaznamenaná na začiatku minulého storočia [9,10] a dôkaz dôležitosti sekrécie slín pri kŕmení krvou bol prvýkrát navrhnutý v 800. rokoch [11–13]. . Zloženie slín a špecifická funkcia ich zložiek však bola stále zle pochopená. Použitie rozsiahleho sekvenovania a proteomiky v posledných desaťročiach umožnilo lepšie pochopiť zloženie slín, ale tiež odhalilo jeho zložitosť a to, ako málo je známe [2,14]. Pretože hematofágia vznikla niekoľkokrát nezávisle počas evolúcie článkonožcov, objavilo sa mnoho spôsobov, ako sa vysporiadať s výzvami, ktoré tento zvyk prináša, medzi rôznymi radmi hmyzu alebo dokonca v rámci toho istého rodu, čo viedlo k veľkým variáciám v repertoári proteínov, aby pôsobili proti obrane hostiteľa. uhryznutie [2,4,5,7,15,16].

Medzi dôležité rodiny proteínov opísaných doteraz v slinách článkonožcov sajúcich krv patrí D7, hojne exprimovaný v hematofágnych dvojkrídlových [17–19] a vzdialene príbuzný hmyzím proteínom viažucim zápach (OBP)/ proteínom viažucim feromóny (PBP). .

U hmyzu sa OBP typicky pohybujú od 100 do 160 zvyškov, ale ako bolo pozorované u niektorých členov patriacich do „atypických/dvoch domén“ alebo podrodín „Plus C“ opísaných v Diptera, ktoré môžu mať až 300 aminokyselín [20–22 ]. Sú prítomné v rôznych poradiach a počet anotovaných génov OBP sa medzi rôznymi druhmi veľmi líši, rovnako ako aminokyselinová sekvencia.

Napriek tomu sú ich cysteíny vysoko konzervované – klasicky 6, hoci tento počet sa môže meniť od 4 v mínus C OBP po 8 v plus OBP až po 9 alebo 10 – umiestnené v polypeptidovom reťazci s charakteristickou vzdialenosťou medzi niektorými z nich [20,21 ,23]. Na rozdiel od OBP stavovcov, čo sú všetky proteíny patriace do nadrodiny lipokalínov (SCOP: 3001332), hmyzie OBP sú klasifikované ako všetky proteíny a patria do nadrodiny hmyzu viažuce feromóny/odoranty (SCOP ID: 4000957). Napriek nízkej sekvenčnej identite medzi členmi majú klasické hmyzie OBP veľmi charakteristickú terciárnu štruktúru s 6 -závitnicami typicky stabilizovanými 3 disulfidovými väzbami tvoriacimi väzbovú dutinu (obrázok 1A), obklopenú hydrofóbnymi zvyškami [20,24–26 ]. Veľký počet a rôznorodosť ich primárnej štruktúry pri zachovaní celkovej architektúry z nich urobili veľmi všestranné, pokiaľ ide o ligandy, ale všetky majú jednu spoločnú vlastnosť: ich schopnosť/potenciál viazať malé hydrofóbne molekuly.

Proteíny D7 sú však obmedzené na krvné nematocery, kde sú hojne exprimované v ich slinných žľazách. Členovia tejto rodiny sú klasifikovaní v (1) krátkych formách (D7S), tiež známych ako D7 príbuzné (D7r), s molekulovou hmotnosťou okolo 15–17 kDa, ktoré obsahujú jednu doménu podobnú OBP (obrázok 1B); (2) dlhé formy (D7L) s molekulovými hmotnosťami okolo 30–38 kDa, zložené z dvoch domén podobných OBP (obrázok 1C). Ako prvýkrát navrhli Arcà a kolegovia [27] a neskôr pozorované röntgenovou difrakčnou kryštalografiou [7,28–30], napriek ich nízkej sekvenčnej podobnosti s OBP je architektúra proteínových domén D7 veľmi podobná OBP a pozostáva z - helixov (všeobecne 7–{23}} helixov, aj keď namiesto 6), tvoriacich hydrofóbnu kapsu (obrázok 1B, C) vhodnú na viazanie hydrofóbnych molekúl, ako bude ďalej diskutované nižšie.

Väčšina doteraz charakterizovaných proteínov D7 bola nájdená v slinách dvojkrídlovcov sajúcich krv, kde pôsobia ako antihemostatické a/alebo protizápalové molekuly, ktoré uľahčujú kŕmenie krvou. V tomto článku poskytujeme komplexný prehľad štruktúry, funkcie a evolúcie proteínov typu D7 a D{5}}, pričom niektoré aspekty porovnávame s OBP článkonožcov a inými rodinami proteínov relevantnými pre fyziológiu vektorov.

2. D7s: Od opisu prvého génu k kľúčom týkajúcim sa ich diverzity, distribúcie a funkcií

Prvý gén kódujúci proteín D7 bol izolovaný a opísaný v roku 1991 v Aedes aegypti [31], pričom sa ukázalo, že je hojne a výlučne exprimovaný v ženských slinných žľazách produkujúcich proteín s veľkosťou 37 kDa. In situ hybridizácia s použitím vypreparovaných ženských slinných žliaz sondovaných antisense RNA pre kódujúcu oblasť tohto génu odhalila, že jeho expresia bola hlavne v distálnych laterálnych a mediálnych lalokoch, oblastiach, ktoré sú veľmi dobre diferencované u samíc (hematofágne) v porovnaní so samcami (fytofágne) , čo naznačuje, že jeho produkt sa veľmi pravdepodobne podieľal na kŕmení krvou. Neskôr, v priekopníckej štúdii zameranej na identifikáciu génov, ktoré boli exprimované výlučne v slinnej žľaze Anopheles gambiae a ktorých produkty obsahovali signálne peptidy, bolo izolovaných šesť cDNA.

Tri z nich, u ktorých sa ukázalo, že sú hojne exprimované v ženských slinných žľazách, kódovali transkripty podobné, aj keď kratšie, ako predtým opísané Aedes aegypti D7, čo naznačuje, že ide o novú rodinu proteínov. Všetky tri sú úplne zarovnané s Aedes D7 C-terminálnou doménou, preto sa nazývajú D7-príbuzné proteíny (D7r): D7r1–D7r3 [32]. Podobne boli exprimované v ženských distálnych laterálnych lalokoch, hoci len jeden z nich (D7r1) bol exprimovaný aj v mediálnych lalokoch [32].

O niekoľko rokov neskôr bola štvrtá D7r (D7r4) nájdená aj v ženských slinných žľazách Anopheles gambiae a ukázalo sa, že sa nachádza blízko ostatných troch foriem tvoriacich zhluk na chromozóme 3R [27]. Keď boli zarovnané, tieto 4 transkripty mali medzi sebou podobnosti v rozmedzí od 53 do 73 percent, a čo je veľmi dôležité, mali nízku úroveň podobnosti s OBP a proteínmi viažucimi feromóny (PBP), ale ich 4 cysteíny sa nachádzali v konzervovaných pozíciách súvisiacich s anténou. a neanténne OBP. Napriek nízkej sekvenčnej podobnosti predikcia sekundárnej štruktúry naznačovala štrukturálne podobnosti s OBP, a preto sa predpokladalo, že D7 môžu mať aj hydrofóbnu väzobnú kapsu obklopenú -helixami a byť schopné viazať alebo niesť malé hydrofóbne molekuly, pravdepodobne mediátory zapojené do reakcií hostiteľa (ako napr. zápal a hemostáza), vzhľadom na skutočnosť, že boli hojné a výlučne sa vyskytovali v ženských slinách [27].

Skutočnosť, že tieto An. gambiae krátke formy zarovnané s C-koncom Ae. aegypti D7L a že testy Southern blot našli iných členov v blízko príbuzných druhoch zvýšili možnosť, že členovia tejto génovej rodiny môžu byť prítomní v iných druhoch komárov a že proteíny s rôznymi dĺžkami kódovanými týmito génmi by mohli mať podobné funkcie, ale odlišné ciele v dôsledku na rozdiel v ich primárnej štruktúre [27].

Suwan a spolupracovníci po prvý raz uviedli, že gény kódujúce jednu D7L a 2 D7-príbuzné (krátke) formy v slinnej žľaze Anopheles stephensi a Western blot s polyklonálnou protilátkou produkovanou na rozpoznanie dlhej formy proteínu sa krížili reaktivita aj s D7rs [33]. Toto bola prvá správa, ktorá ukázala, že skutočne dlhé a krátke formy možno nájsť u toho istého druhu. Nasledujúce štúdie potom hlásili prítomnosť ďalších členov tejto čeľade v rôznych druhoch komárov (čeľaď Culicidae) vrátane Anopheles arabiensis, Aedes aegypti a Anopheles darlingi [17,18], ako aj v iných hematofágnych Diptera patriacich do čeľade Psychodidae ( pieskové mušky) [17].

Celkovo tieto štúdie silne naznačujú, že: (1) D7 bola rodina proteínov pravdepodobne rozšírená u hematofágnych dvojkrídlovcov, exprimovaných výlučne v ženských slinných žľazách, a preto by mohli mať dôležitú úlohu pri kŕmení krvou; (2) D7 proteíny rôznej dĺžky a aminokyselinovej sekvencie boli prítomné v rôznych druhoch av rámci toho istého druhu, pravdepodobne v dôsledku génovej duplikácie vytvárajúcej diverzitu; (3) ich predpokladanými cieľmi by mali byť malé hydrofóbne molekuly, ako sú mediátory zápalu a/alebo hemostázy [27,33]. Napriek tomu bola ich funkcia stále nepolapiteľná.

3. Slinné proteíny D7 sú protizápalové a antihemostatické molekuly

D7 a ďalšie proteíny podobné OBP prítomné v slinách nematocera sajúceho krv môžu mať variabilitu vo svojej primárnej štruktúre, čo vedie k získaniu a strate funkcie napriek zachovaniu niektorých kľúčových vlastností a všeobecnej architektúry, ako bolo pozorované pri mnohých OBP. Tabuľka 1 sumarizuje proteíny podobné D7 a D{5}}, ktoré boli doteraz opísané v slinách rôznych druhov a ich ligandy, a tam, kde je to vhodné, uvádza ich prístupové číslo v databáze proteínov (PDB). Podrobnosti a fyziologický význam sú diskutované nižšie.

3.1. Kontaktujte inhibítory cesty

Prvá D7, ktorá mala svoju funkciu charakterizovanú, bola krátka forma (D7r), nazvaná Hamadarin [35], vyjadrená v SG samíc Anopheles stephensi. Jeho najbližšia D7 je vyjadrená v An. gambia by bola D7r1. Ukázalo sa, že hamadarín viaže faktor XII (FXII) a vysokomolekulárny kininogén (HMWK), čím inhibuje aktiváciu kontaktnej dráhy a následne produkciu bradykinínu, pričom pôsobí ako protizápalová molekula. Napriek tomu sa v oboch prípadoch interakcia s FXII a HMWK, študovaná povrchovou plazmónovou rezonanciou (SPR), vyskytla iba v prítomnosti Zn2 plus a neovplyvnila amidolytickú aktivitu aktivovaných faktorov. Jeho inhibičný účinok na aktiváciu kontaktnej dráhy bol skôr spôsobený jeho interferenciou s recipročnou aktiváciou FXII a kalikreínu, ku ktorej by malo dôjsť pri ich interakcii s nabitými povrchmi [35]. O niekoľko rokov neskôr bol charakterizovaný ďalší inhibítor aktivácie kontaktnej dráhy prítomný v slinách Anopheles stephensi (Anophensin) a ukázalo sa, že má podobné ciele ako Hamadarin, ale patrí do úplne inej rodiny proteínov [42].

Pozoruhodné je, že medzi najviac exprimované proteíny v slinách piesočných múch [43–45] patrí skupina proteínov, ktoré tiež patria do superrodiny OBP, nenachádzajú sa v komároch a líšia sa od proteínov D7. Najprv získali pozornosť nielen pre ich početnosť, ale aj preto, že boli identifikovaní ako kandidáti na vakcínu proti leishmanióze [46,47]. Len o viac ako desať rokov neskôr boli dvaja členovia tejto skupiny charakterizovaní v slinách Phlebotomus duboscqi: PdSP15a a PdSP15b (P. duboscqi slinný proteín 15a a b, v tomto poradí). Obidve sú si navzájom veľmi podobné a inhibujú aktiváciu kontaktnej dráhy a produkciu bradykinínu [41], ale prostredníctvom mechanizmu odlišného od mechanizmu opísaného pre hamadarin [35]. PdSP15a a b sa neviažu na žiadny koagulačný faktor (zymogény alebo aktivované formy), kalikreín alebo prekalikreín. Ich pôsobenie však spočíva v naviazaní negatívne nabitých polymérov, ako je dextránsulfát (DS), polyfosfát (PP) a heparín, čím sa zabráni ich interakcii s FXII, ktorá je potrebná na jeho autoštiepenie, ktoré spúšťa jeho aktiváciu, a následné šírenie aktivácie kontaktnej dráhy cez recipročná aktivácia FXII a plazmatického prekalikreínu (PK), ako aj aktivácia FXI trombínom a FXIIa. Dôležité je, že zatiaľ čo klasické OBP a D7 majú hydrofóbnu kapsu, kde sa viaže ich malý hydrofóbny ligand, štrukturálne údaje naznačujú, že jeho mechanizmus účinku je skôr prostredníctvom elektrostatickej interakcie medzi jeho aniónovým povrchom a záporne nabitými ligandami, než akoukoľvek väzbou vo vnútri hydrofóbnej dutiny [41,47]. .

Plazmatická koagulačná kaskáda môže byť iniciovaná dvoma odlišnými vetvami: (1) vonkajšia dráha, ktorá sa spustí, keď sa faktor VII (FVII) aktivuje po väzbe na subendoteliálny tkanivový faktor (TF) exponovaný po vaskulárnom poškodení. (2) Kontaktná dráha, tiež známa ako vnútorná dráha, sa iniciuje aktiváciou FXII na FXIIa, ktorá sa spustí jeho kontaktom so záporne nabitými povrchmi. Obe dráhy po sérii reakcií konvergujú k spoločnej dráhe prostredníctvom aktivácie FX, ktorá nakoniec vedie k štiepeniu fibrinogénu na fibrín, ktorý je nevyhnutný pre tvorbu zrazeniny [48,49]. V posledných rokoch sa intenzívne skúmali lieky zamerané na zložky vnútornej (kontaktnej) dráhy, ako sú FXII a FXI, pretože sa ukázalo, že myši bez FXII boli chránené pred tvorbou trombu, pričom nemali žiadne závažné poruchy krvácania [50–52], čo naznačuje, že táto dráha je dôležité pre patologickú koaguláciu.

Po aktivácii faktor XII štiepi plazmatický prekalikreín (PK) generujúci kalikreín, ktorý okrem recipročnej aktivácie s FXII katalyzuje aj hydrolýzu HMWK generujúceho bradykinín (kalikreín-kinínový systém) [53]. Bradykinín je silný prozápalový mediátor, ktorý zvyšuje permeabilitu endotelu [48,54] a bolesť [55]. Preto by prítomnosť inhibítorov kontaktnej dráhy v slinách hematofágnych článkonožcov zohrávala dôležitú úlohu ako protizápalové molekuly znížením produkcie bradykinínu (ako je ukázané pre proteíny podobné D7s/OBP hamada v [35] a PdSP15s [41]). a inhibíciou/zabránením úniku plazmy vyvolanému aktiváciou kontaktnej dráhy, ako sa uvádza pre PdSP15s [41].

For more information:1950477648nn@gamil.com