Abstraktné
Účel: Táto štúdia bola vykonaná na potvrdenie použiteľnosti zmiešaného bylinného extraktu (MHE) ako analkozmetika proti starnutiuzložky skúmaním jejpleť proti starnutiuaktivity in vitro a in vivo. Metódy: V tejto štúdii sme MHE pripravili pomocou ultrazvukovej extrakcie s obsahom Forsythiae fructus, Tribuli fructus, šalamúnskeho tuleňa, sibírskeho ženšenu, Ponciri Fructus a Ginseng. Vyšetrili smeanti-aging účinok MHE na kožu v dermálnych fibroblastoch. Theaktivita proti starnutiubola určená hladinami syntézy kolagénu typu I. Hladiny mRNA matricovej metaloproteinázy-1 (MMP1) a tkanivového inhibítora metaloproteináz 1 (TIMP1) sa merali pomocou qRT-PCR. Hladiny proteínu MMP1 sa hodnotili blotovou analýzou. Klinické testy vlhkosti pokožky, elasticity, textúry a vrások boli vykonané s použitím kozmetiky obsahujúcej 1 percento MHE. Výsledky: MHE indukoval upreguláciu syntézy pro-kolagénu typu I a expresiu TIMP1 mRNA. MHE viedla k zníženiu hladín mRNA MMP1 a hladín proteínov. Okrem toho, po aplikácii kozmetiky s obsahom 1% MHE na pokožku sa 4 týždne po ošetrení zlepšila hydratácia pokožky, pružnosť, textúra a vranie. Záver: MHE má účinok proti starnutiu tým, že podporuje syntézu kolagénu a potláča expresiu génu MMP1 in vitro a má účinok na zlepšenie pokožky in vivo. Preto sa ukázalo, že MHE má hodnotu ako funkčná kozmetická prísada.
Kľúčové slová:Starostlivosť o kožu, Proti starnutiu, Proti vráskam, Prírodná kozmetika, Bylinná medicína
Bylinné doplnky Cistanche proti starnutiu
Úvod
Koža je orgán, ktorý prichádza do kontaktu s vonkajším prostredím a je životne dôležitý pre naše prežitie, pričom pôsobí ako primárna bariéraproti vonkajším útokomako sú infekčné agens a fyzické zranenia; okrem toho plní niekoľko dôležitých fyziologických úloh (Slominski et al., 2004; Vollmer et al., 2018). Ako starneme,funkcia kožepostupne sa zhoršuje s atrofickými zmenami v dôsledku ultrafialových (UV) lúčov, znečistenia a stresu a starnutím kože, ku ktorému dochádza, keď sa znižuje počet kožných buniek a hrúbka kože (Farage et al., 2013).
Starnutie pokožkymožno rozdeliť na endogénne starnutie a exogénne starnutie. K endogénnemu starnutiu pokožky dochádza časom prirodzene bez ohľadu na vonkajšie vplyvy. Dermálne-Epidermálnekrižovatka (DEJ) súdržnosť slabne as diferenciácioukeratinocytov, tvorba lipidov klesá (Makrantonakia kol., 2007). Na druhej strane, exogénne starnutie je spôsobené vonkajšímfaktory ako UV lúče, infračervené lúče (IR), fajčenie, v poriadkuprach a životný štýl. Medzi nimi je fotostarnutie spôsobené UV žiarenímlúče prenikajúce do pokožky a poškodzujúce kolagén a elastínv dermis. V tomto procese sa elastické vlákna a kolagénvlákna pokožky sú deformované, čo vedie k zníženiu elasticitya ochabnutý. Kolagén je hlavnou zložkou extracelulárnej hmotymatrice a má dôležitú úlohu pri určovaní funkcie tkaniva.
Spomedzi rôznych typov kolagénu tvorí kolagén typu 1 asi 75-80 percent celkového kolagénu (Landau, 2007; Lovell a kol., 1987; Mays a kol., 1988). Keď je pokožka vystavenáUV lúče po dlhú dobu, sú produkované voľné radikály. Tieto zadarmoradikály stimulujú expresiu matricovej metaloproteinázy-1(MMP1), ktorý podporuje degradáciu kolagénu a inhibuje kolagénsyntéza, ktorá znižuje elasticitu pokožky a vedie k vráskam.Preto na prevenciu a zlepšenie vrások pokožky spôsobenýchstarnutia, je potrebné vyvinúť zložku, ktorá podporujeprodukciu kolagénu a inhibuje expresiu a aktivituMMP1 (Wlascheka kol., 2001).
Starnutie pokožkyúzko súvisí s kvalitou života. Keďže koža je najviditeľnejším orgánom, uvedomujeme si proces starnutia (Binic et al., 2013). V oblasti medicíny, farmácie a kozmetiky prebiehajú rôzne snahypredchádzať a zlepšovať starnutie pokožky. Thevývoj zložiek proti starnutiuje jednou z najdôležitejších stratégií proti starnutiu.
Extrakty bylín sme pripravili pomocou ultrazvukovej extrakcie, aby sme vyvinuli nové zložky proti starnutiu, ktoré obsahujú Forsythiae fructus, Tribuli fructus, pečať šalamúnsky, sibírsky ženšen, Ponciri fructus a Ginseng.
Šesť bylinných liečiv bolo vybraných z rastlín s rôznymi liečivými a kožnými účinkami. Forsythiae fructus, sušené ovocie Forsythia susspense (čeľaď Oleaceae), známe ako Lian Qiaov Číne, bol prvýkrát zaznamenaný v Shennong Bencao Jing, aprestížna monografia o tradičnej čínskej medicíne (TCM)(Donga kol., 2017). Používa sa ako čistič tepla adetoxikačná TČM na liečbu infekčných ochorení, ako naprakútna nefritída, erysipel a vredy (Wanga kol., 2018). to ješiroko používaný na klinikách ako samostatný liek alebo zložený predpis.Moderná farmakológia ukázala, že má rôznebioaktivity, vrátane protizápalových, antibakteriálnych, antivírusové, antioxidačné, protinádorové, antidiabetické, antihyperlipidemické,antiandrogénna alopécia, zvracanie, starnutie aobezita aktivity a neuroprotektívne, hepato-protektívne, avazorelaxačné účinky (Donga kol., 2017). Okrem toho bolooznámil toForsythiae fructusmá bielenie pokožky, protiatopická dermatitída a účinky proti starnutiu. Podľa Taiwanuceloštátna databáza receptov,Forsythia Fructusbolpatrí medzi 10 najlepších bylín najčastejšie používaných na liečbu atopikovdermatitída (15,9 percenta), žihľavka (11.49-13,4 percenta) a akné (22,3 percenta)(Donga kol., 2017). Forsythiae fructusobsahuje saponíny,flavonoidy,a alkaloidy a kyselina oleanolová, ktorá má užitočnúfarmakologické pôsobenie. Okrem toho obsahuje arctigenín amatairesinol. Ako fyziologicky aktívne zložky pokožky súsú inhibítory tyrozinázy, ktoré pôsobia na metabolizmus melanínudráha vyvolaná - hormón stimulujúci melanocyty ( -MSH)a priťahujú pozornosť ako kozmetické bieliace materiály(Yang & Choe, 2011).Tribuli fructus, čo je sušené ovocieTribulus terrestrisL, bolo hlásené, že má farmakologické účinkyaktivity na zlepšenie sexuálnych funkcií, prevenciu a liečbukardiovaskulárne ochorenia a zlepšenie neuroprotekcie aPamäť. Má tiež antidiabetické, protizápalové aantioxidačné účinky (Chhatrea kol., 2014). Tribuli fructusextrakt obsahuje veľké množstvo diosgenínu, tigogeínu, rôznychsaponíny atď. Tieto saponíny sú najdôležitejšie bioaktívnezložky zodpovedné za rôzne biologické účinky ako naprafrodiziakálny účinok, antihypertenzívny účinok a ochranný účinokúčinok proti ischemicko-reperfúznemu poškodeniu a protirakovinovým,antibakteriálne a protiplesňové účinky (Chhatrea kol., 2014).
Ďalšie zložky zahŕňajú furostanol a spirostanol saponíny, polysacharidy, flavonoidové glykozidy, alkaloidy a amidy. Okrem toho je účinný proti atopickej dermatitíde u potkanov a má protizápalové účinky (Chhatre et al., 2014). Bolo hlásené, že účinok extraktu Tribuli fructus proti starnutiu zvyšuje produkciu prokolagénu typu I a elastínu v bunkách HS68, podporuje akumuláciu lipidov v adipocytoch a v konečnom dôsledku zlepšuje vrásky a elasticitu pokožky (Kim et al., 2016 ). Sibírsky ženšen (Acanthopanax senticosus) je opadavý ker patriaci do čeľade Oga spolu so ženšenom a divokým ženšenom. Sibírsky ženšen má veľa podobností so ženšenom a používa sa ako bylinný liek na mŕtvicu, vysoký krvný tlak a cukrovku. Extrakt sibírskeho ženšenu sa v orientálnej medicíne používa už dlho a donedávna boli v rôznych štúdiách uvádzané farmakologické a fyziologické výsledky. Zložky sibírskeho ženšenu, ktoré boli doteraz identifikované, zahŕňajú eleuthero strany A, B, C, D, E, I, K, L a M, a sezamín, chiisanosid, kyselinu kávovú, kyselinu chlorogenovú, kampesterol, vitamíny a minerály (Park a kol., 2010).
Obsahuje triterpenoidné saponíny, lignany, kumaríny aflavonoidy, medzi ktorými sú fenolové zlúčeniny považované za najaktívnejšie zložky (Huang et al., 2011). Existuje mnoho správ o účinnosti extraktu zo sibírskeho ženšenu na pokožku.Účinok proti vráskam,antioxidačný účinok,syntéza kolagénua bola hlásená inhibičná aktivita kolagenázy proti fotostarnutiu (Park et al., 2010). Bolo publikované, že extrakt sibírskeho ženšenu reguluje syntézu kolagénu typu IV, ovplyvňuje proliferatívnu kapacitu epidermálnych kmeňových buniek a zhrubňuje epidermis (Choi et al., 2016). Tuleň šalamúnsky je oddenok Polygonatum odoratum (synonymum: P.officinale), ktorý má tonizujúci účinok a používa sa na liečbu srdcového zlyhania a cukrovky v orientálnej medicíne. Šalamúnova pečať je anticyklická a antitusická; uvoľňuje srdcové napätie a je diuretikum, energizér, hypoglykemický, sedatívum a tonikum; používa sa na liečbu pľúcnych ochorení vrátane tuberkulózy a gastrointestinálnych porúch (Haroon et al., 2012). Okrem toho sa široko používa pri liečbe krvných porúch; má priaznivé účinky na obličkové cesty a zabraňuje šediveniu vlasov, problémom so zrakom, závratom a lišajom. Je to nervínové tonikum a používa sa pri liečbe cukrovky (Haroon et al., 2012). Tuleň šalamúnsky má vysoký obsah fenolu a antioxidačnú aktivitu. Homoizoflavanóny zo Šalamúnovej pečate inhibujú tvorbu pokročilých konečných produktov glykozylácie. Solomon's seal preukázal silnú regulačnú aktivitu črevného imunitného systému a schopnosť indukovať diferenciáciu osteoklastov a lektínom indukovanú apoptózu. V prípade extraktu z listov P. odoratum sa ako príklad uvádza funkcia hojenia rán (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus immatures je nezrelý plod Poncirus trifoliata Rafinesque, patriaci do čeľade Rutaceae (Jung et al., 2016). Nedávno boli hlásené protizápalové a antihypersenzitívne účinky a bol hlásený účinok extraktu z tukového kalu na indukciu apoptózy rakovinových buniek (Lee et al., 2008). Je známe, že Ponciri fructus je účinný pri liečbe atopickej dermatitídy. Prostredníctvom aplikácie extraktu Ponciri fructus na kožu boli hlásené jeho účinky proti atopickým dermatitíde, ako je epidermálna hyperkeratóza, dermálny edém a cytokíny. Najmä bol zaznamenaný významný pokles svrbenia, počtu žírnych buniek, produkcie IgE a expresie nervového rastového faktora. Extrakty Ponciri fructus preukázali účinný protizápalový účinok proti atopickej dermatitíde a účinnosť proti svrbeniu reguláciou imunitných mechanizmov. Okrem toho je známe, že orálne podávanie extraktu Ponciri fructus je užitočné pri liečbe a prevencii alergických ochorení (Hwang et al., 1997). Ženšen je široko používaný tradičný bylinný liek s multifunkčnými aktivitami. Ženšen sa používa pre svoje protizápalové, antioxidačné, protinádorové a anti-aging aktivity (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Bolo vykonaných mnoho štúdií o účinnosti ženšenu na pokožku (He et al., 2018). Medzi nimi existuje veľa správ o saponínoch a ginsenosidoch, ktoré sú reprezentatívnymi zložkami ženšenu. Saponíny sú zlúčeniny nachádzajúce sa vo veľkej miere vo väčšine rastlín a existujú v rôznych formách. Saponíny môžu urýchliť rôzne biologické aktivity, ako je hemolýza a antibakteriálne, antivírusové a antioxidačné funkcie. Okrem toho majú saponíny protizápalové vlastnosti, ktoré môžu znížiť opuch a zápal kože. Ginsenozidy zvyšujú interleukín (IL)-1, jeden zo zápalových cytokínov, o ktorých je známe, že podporujú angiogenézu a indukujú vaskulárny endotelový rastový faktor a akumuláciuna miestach spálenia kože u myší. Bol tiež zaznamenaný ich účinok na odstránenie makrofágov z kožných rán a podporu hojenia rán (Kim et al., 2011).
Cieľom tejto štúdie bolo objasniť účinok zmiešaného bylinného extraktu (MHE) proti starnutiu pokožky in vitro a in vivo.
Metódy
1. Hodnotenie účinnosti in vitro
1) Príprava MHE
Sušené ovocie Forsythia suspense, sušené plody Tribulus Terrestris L., sibírsky ženšen (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) koreň), tuleň šalamúnsky (podzemok a koreň Polygonatum Officinale), plody Poncirus Trifoliata Rafinesque (Panaxin) zakúpené na miestnom trhu. Na základe teórie „Jin-Jang“ a „Piatich elementov“ tradičnej čínskej medicíny (TCM), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. a Poncirus trifoliata Rafinesque zodpovedajúce „Yang“ a sibírsky ženšen, ženšen a Šalamúnova pečať zodpovedajúca Bol vybraný "Yin". Šesť liečivých bylín bolo opäť rozdelených podľa vlastností zodpovedajúcich piatim živlom (drevo, oheň, voda, kov alebo zlato a zem alebo pôda). Tieto liečivé byliny boli zmiešané v rovnakom pomere pre rovnováhu každého prvku a Poncirus trifoliata a ženšen zodpovedajúci Zemi sa skombinovali s ostatnými prvkami tak, aby zodpovedali pomerom (tabuľka 1). Šesť liečivých rastlín bolo extrahovaných v 30 percentnom etanole pomocou ultrazvuku (20 kHz, 2 h). Po zahustení na rotačnej odparke sa pridalo 30 % (obj./obj.) butylénglykolu a roztok sa zriedil, čím sa pripravil extrakt obsahujúci 1 % obsahu pevnej látky.
Tabuľka 1. Zloženie zmiešaných bylín
2) Bunkové kultúry a činidlá
Ľudské primárne fibroblastové bunky (HDFn) boli získané od PromoCell (normálna ľudská dermálna fibroblastová juvenilná predkožka, C-12300; PromoCell, Nemecko). Bunkové kultúry s Dulbeccommodifikovaná Eaglova stredne vysoká glukóza (DMEM vysoká glukóza, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) obsahujúca 10 percent (v/v) fetálneho hovädzieho séra (FBS, SH30084.03, Hyclone) a 1 percento antibiotikaantimykotiká (Anti-anti, 15240-062, Gibco, USA) boli kultivované pri 37 stupňoch v 5-percentnom CO2 inkubátore.
3) Test životaschopnosti buniek (MTT test)
MTT test meral životaschopnosť buniek a určil cytotoxicitu MHE. Bunky sa vysiali v množstve 5 x 103 buniek/jamku na 96-jamkovú doštičku a kultivovali sa 24 hodín pod bunkovou kultúroupodmienky. Potom sme médium zlikvidovali, bunky sme premyli roztokom fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom (PBS, 21-040-CV; Corning, USA), umiestnili bunky do nového média bez séra aošetrili bunky koncentráciami {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 a 1.{15} percent vzoriek a bunky sa inkubovali 24 a 48 hodín. Potom sme pridali 100 ul roztoku MTT(0,5 percenta, 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5 difenyl-2H tetrazóliumbromid) ku každému dobre a inkubovali bunky ďalšie 2 hodiny. Po odstránení kultivačného média sme pridali 100 μl 100-percentného dimetylsulfoxidu (DMSO), bunky sme pretrepávali 10 minút a merali absorbanciu pri 590 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Epoch 2 microplate reader, BioTek, USA).
4) Meranie generácie prokolagénu I. typu
Koncentrácia prokolagénu typu I v kultivačnom médiu pre bunky sa merala pomocou komerčne dostupnej súpravy ELISA (súprava prokolagénu typu I C-peptid EIA, MK101, TaKaRaBio, Japonsko) podľa pokynov výrobcu. Každá vzorka sa analyzovala v troch replikátoch.
5) Meranie hladín expresie mRNA pomocou kvantitatívneho
Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qRT PCR) Bunky sa vysiali v množstve 1x105 buniek/jamku na 6-jamkové platne. HDFn bunky sa kultivovali 24 hodín; potom sa bunky synchronizovali s DMEM s vysokou glukózou bez FBS počas 24 hodín. Médium bolo nahradené médiom bez séra a ošetrené koncentráciami 0.{11}}5, 0.10, 0,25, 0,5 a 0,75 percent vzoriek počas 24 a 48 hodín. Extrakcia RNA sa uskutočnila s HDFn bunkami s použitím súpravy na extrakciu RNA (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit, 9767A, Takara Bio, USA) a vzorky sa purifikovali podľa protokolov výrobcu. Izolovaná RNA (1 ug) sa syntetizovala do cDNA pomocou súpravy TR reagencií (PrimeScriptTM RT reagent Kit s gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Pomocou SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) a QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR prístroj, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA) PCR stroja v reálnom čase, hladiny génovej expresie boli štandardizované podľa prevádzkového génu glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH). Priméry použité v tejto štúdii sú uvedené v tabuľke 2. Experimenty sa uskutočnili duplicitne pre tri nezávislé opakovania. Analýza krivky topeniasa uskutočnilo pre každú sadu primérov.
6) Analýza Western blot
Proteínové lyzáty z fibroblastových buniek boli extrahované lyzačným pufrom (EzRIPA Lysis Kit, WSE{0}}; ATTO Corporation, Japonsko). Na kvantifikáciu proteínov sa použila Bradfordova metóda.Rovnaké množstvá proteínov boli zmiešané s 5X vzorkovým pufrom (TLP-102-01, TransLab, Kórea) a denaturované pri 99 stupňoch počas 10 minúty. Proteíny sa oddelili pomocou 10 percent SDS-PAGE pri 150 V počas 150 minút a preniesli sa na PVDF membrány (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japonsko). Membrány boli blokované 0,5 percentným hovädzím sérovým albumínom (BSA, A4503-10G; Sigma) počas 1 hodiny a premyté Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom, ktorý obsahoval Tween-20 (10X TBS s Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Kórea) trikrát; membrány sa potom inkubovali s primárnymi protilátkami proti MMP-1 (rekombinantná anti-MMP1 protilátka [EP1249Y], ab134184, Abcam, USA), -Aktín (Anti{24}}aktín (N-tern) a PA0207 (Abfrontier , Kórea) pri 4 stupňoch cez noc. Po opláchnutí boli membrány ošetrené anti-králičím IgG-chrenovou peroxidázou (HRP) (anti-králičí IgG, protilátka spojená s HRP, #7074; Cell Signaling Technology, USA) ako sekundárna protilátka Chemiluminiscenčná detekcia sa uskutočňovala pomocou detekčného činidla ECL Prime Western blotting (GE Healthcare, USA) a ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Japonsko). Na kvantitatívnu analýzu sa zachytené obrázky analyzovali pomocou Image softvér (CS analyzátor 4, korporácia ATTO, Japonsko).
7) Štatistická analýza
Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou GraphPad Prism verzie 3.03 pre Windows (GraphPad Software, USA). Výsledky sú prezentované ako priemer ± SD z 3 experimentov. NespárovanýPoužil sa Studentov t-test a hodnoty p<0.05 were considered statistically significant.
2. Hodnotenie účinnosti in vivo
1) Činidlá a kozmetické výrobky
Testovanými produktmi boli pleťové mlieko, esenciový krém a očný krém; tieto krémy obsahovali 1 percento MHE ako aktívnej zložky uvedenej v tabuľke 3.
2) Ľudskí účastníci
Všetci dobrovoľníci súhlasili s účelom a obsahom testu a pred začatím testu podpísali písomný informovaný súhlas. Nesmeli používať žiadne iné produkty starostlivosti o pleť a testované produkty boli aplikované na tvár v poradí pleťový krém (iba na labky) – esencia krém – pleťová voda. Štúdia bola vykonaná v súlade s usmerneniami Helsinskej deklarácie a schválená Inštitucionálnou revíznou radou Kórejského národného inštitútu pre politiku bioetiky (#P01-202108-13-001).
3) Test účinnosti
Tejto štúdie sa zúčastnilo 21 žien vo veku od 45 do 55 (priemer ±SD 50,81±2.86) rokov s normálnou pokožkou. Testované produkty sa aplikovali dvakrát denne (ráno a večer) počas 4 týždňov. Účastníci navštívili výskumné centrum každé 2 týždne a testovacie miesta sa merali v laboratóriu, kde sa teplota okolia a relatívna vlhkosť udržiavali na 22 ± 2 stupňoch a 50 ± 5 percent. Účastníci sa aklimatizovali 20 minút v laboratóriu po umytí tváre a bola hodnotená hydratácia pokožky, elasticita, textúra a vrana. Hydratácia pokožky sa merala pomocou Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Kolín nad Rýnom, Nemecko); elasticita sa merala s použitím Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Kolín, Nemecko) a textúra a krídlo sa merali pomocou DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, Francúzsko).
4) Hodnotenie nežiaducich reakcií kože
Nežiaduce reakcie boli kontrolované pri každej návšteve dotazníkom a pozorovaním. V hodnotení boli subjektívne parametre klasifikované ako svrbenie, pichanie, šteklenie, pálenie, štípanie,stuhnutosť a napnutie a objektívne parametre boli klasifikované ako erytém, edém, šupina a papula.
5) Štatistická analýza
Dáta sa analyzovali pomocou softvéru SPSS®. Štatistická významnosť rozdielov medzi časovými bodmi bola stanovená pomocou analýzy opakovaných meraní; p-hodnota<0.05 bol považovaný za štatisticky významný. Miera zmeny ( percentá ) zo základnej hodnoty sa vypočítala takto:
Miera zmien=((po základnej liečbe)/základná hodnota)×100 percent
