Účinky extraktu Piper Cambodianum Cistanche proti starnutiu na normálne ľudské dermálne fibroblastové bunky a model hojenia rán u myší Ⅱ

Cistancheextrahovať chránené bunky NHDF pred účinkami UV žiarenia

Kožné bunky reagujú rýchlo, keď sú vystavené UV žiareniu alebo cytokínom, ako je interleukín (IL)-4 a IL-13.19Pri vystavení UV žiareniu sú stimulované rôzne faktory, vrátane EGFR,20,21 TNFR,22mitogénom aktivované proteínové (MAP) kinázy, ERK a c-Jun amino-terminálna kináza (JNK).23JNK aj p38 fosforylujú a aktivujú transkripčný faktor c-Jun, ktorý naopak zvyšuje c-Fos a zvyšuje hladiny proteínu aktivujúceho transkripčný faktor-1,24ktorý je potrebný na prepis MMP. Tieto receptory sú aktivované fosforyláciou MAP kinázy a iných downstream proteínov.25MAP kinázy sú aktivované fosforyláciou špecifických treonínových a tyrozínových zvyškov.24,26Vystavenie UV žiareniu vedie k vysokej expresii c-Jun a c-Fos heterodimérov, početných cytokínov a rastových faktorov, ktoré sú fosforylované JNK a p38.27,28Podobne boli zvýšené hladiny proteínu p53, počnúc od 2,5 hodiny do 24 hodín po vystavení UV žiareniu.29Preukázali sme, že bunky vystavené UV žiareniu počas 24 hodín exprimovali hladiny proteínov TNFR1 a EGFR, ktoré sa znížili v závislosti od dávky, keď boli bunky ošetrenéCistanche. Skúmali sme vplyv UV žiarenia na fosforyláciu aj aktivitu p38 (Thr180/Tyr182). Hladiny proteínov c-Jun a p53 boli dramaticky zníženéCistanche-ošetrené bunky (obrázky 4A a B).

Kliknite sem a získajte viac informácií o Cistanche pre ošetrenie proti starnutiu

Extrakt Cistanche chránil bunky NHDF ožiarené UV žiarením pred ROS

UVB svetlo stimuluje produkciu ROS,30,31a vystavenie UV žiareniu na koži produkuje ROS, ako je O2 ⋅−, H2 O2, a1 O2. 32Neliečená aCistanche-ošetrené bunky boli vystavené UV žiareniu počas 24 hodín a generovanie ROS bolo merané fluorescenciou aktivovaným triedením buniek (FACS).

Obrázok 3Regulácia ECM proteínov vCistanche-ošetrené bunky.Poznámky: (A) NHDF bunky boli ošetrené sCistanchepočas 24 hodín. Bunkové lyzáty sa analyzovali imunoblotovaním s použitím anti-kolagénových, anti-elastínových, anti-MMP-3 a anti-ERK-2 protilátok. Výsledky reprezentujú tri nezávislé experimenty. (B) Aktín, kolagén, elastín, MMP-3 a ERK-2 v imunoprecipitátoch boli kvantifikované metódou Western blotting. Výška tyčí je príslušný priemer± SD troch nezávislých experimentov. *P,0.05; **P,0.01. skratky:Conc, koncentrácia; ECM, extracelulárna matrica; ERK, extracelulárnym signálom regulovaná kináza; MMP, matricová metaloproteináza; NHDF, normálny ľudský dermálny fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; SD, štandardné odchýlky.

Obrázok 4Cistanche extrakt inhibícia produkcie ROS v bunkách ožiarených UV žiarením.Poznámky: (A) NHDF bunky boli vystavené UV žiareniu pri 40 J počas 180 sekúnd a ošetrenéCistanchepočas 24 hodín. Bunkové lyzáty sa analyzovali imunoblotovaním s použitím protilátok anti-TNFR6, anti-c-Jun, anti-c-Fos, anti-pp38 alebo anti-p-JNK. Výsledky reprezentujú tri nezávislé experimenty. (B) Celkový a tyrozín-fosforylovaný p38, JUK, aktín a TNFR6 v imunoprecipitátoch boli kvantifikované pomocou Western analýz. Výška tyčí je priemer± SD troch nezávislých experimentov. *P,0.05; **P,0.01. skratky:Conc, koncentrácia; EGFR, receptor epidermálneho rastového faktora; JNK, c-Jun amino-terminálna kináza; JNK, c-Jun N-koncová kináza; NHDF, normálny ľudský dermálny fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktívne formy kyslíka; SD, štandardná odchýlka; TNFR, receptor tumor necrosis factor; UV, ultrafialové.

UV ožarovanie zvýšilo produkciu ROS, pričomCistanche extrakt znížil produkciu ROS v bunkách NHDF. Hladiny ROS H2 O2 boli merané pomocou bunkových permeantov 2′,7′dichlórdihydrofluoresceín diacetát (CM-H2 DCFDA) (obrázok 5A). UV ožarovanie zvýšilo hladiny ROS H2 O2 , zatiaľ čo hladiny ROS boli znížené oCistanche extrahovať spôsobom závislým od dávky (obrázok 5B). Tieto výsledky tomu nasvedčovaliCistancheextrakt chráni dermálne fibroblasty pred UV žiarením znížením tvorby ROS.

Makroskopické pozorovanie hojenia rán u myší

Na chrbtoch myší boli vytvorené rany a následne ošetrenéCistancheextrakt (0, 1, 10 a 50µg/ml); oblasti rany sa merali každý deň počas 4 dní. Na 4. deň sa oblasti obklopujúce ranyCistanche- liečené myši vykazovali znížené začervenanie v závislosti od dávky v porovnaní s neošetrenými oblasťami rany (obrázok 5). Oblasti rany ošetrené extraktom boli menšie ako neošetrené oblasti rany, čo vykazovalo vzorec závislý od dávky. Na 4. deň boli oblasti rany ošetrené 50µg/mlCistancheboli úplne pokryté novým epitelom. Neboli infikované žiadne oblasti rany (obrázok 6A a B). Vypočítali sa pomery plôch poranení v dňoch 0 a 4 (obrázok 6C).

Diskusia

Používanie rastlinných materiálov a rôznych častí rastlín sa zvyšuje so sprievodným pokrokom vo fytoterapii. Rastlinné materiály sa používajú v rôznych formách, ako sú mono- alebo polybylinné drogy, potravinové doplnky a zložky stravy, a mnohé sa stali známymi a bezpečnými komerčnými komoditami.33Rôzne rastliny, vrátaneCistanche, boli skúmané z hľadiska ich potenciálnych farmakologických vlastností, ale predtým sa s nimi neuskutočnila žiadna porovnávacia štúdiaCistanche extrakt. Táto štúdia bola vykonaná na určenieúčinkyCistanche extrakt o činnostiach pri hojení rán pomocou modelov rezných rán u myší. Hojenie rán zahŕňa obnovenie integrity tkaniva prostredníctvom procesov spojených so zápalom, proliferáciou a štádiami remodelácie.34 Štádium remodelácie pokožky je charakterizované preformulovaním a pretvorením zložiek kolagénových vlákien, ktoré zlepšujú pevnosť v ťahu.35Proces hojenia je regulovaný najmä biosyntézou a ukladaním nového kolagénu a následným dozrievaním.36V našej štúdii rán,Cistanche extrakt vykazoval zvýšené účinky na hojenie rán v porovnaní s kontrolou (obrázky 1C a 6). Takéto hojenie môže byť spôsobené zvýšenou koncentráciou kolagénu a stabilizáciou vlákien. V procese opravy tkaniva zápalové bunky zosilňujú migráciu a proliferáciu endotelových buniek, čo vedie k neovaskularizácii buniek spojivového tkaniva, ktoré syntetizujú extracelulárne matrice, vrátane kolagénu a keratinocytov, čo vedie k reepitelizácii poraneného tkaniva.37Vyššia rýchlosť kontrakcie rany môže zvýšiť intracelulárnu komunikáciu medzibunkového spojenia vo fibroblastoch a zvýšiť rýchlejšie dozrievanie granulačného tkaniva.38V modeli reznej rany boli myši liečené sCistancheextrakt vykazoval rýchlejšie hojenie rán v porovnaní s kontrolami (obrázok 6). Početné štúdie odhalili, že downregulácia dráhy kinázy p38 chráni rôzne bunkové línie exprimujúce p53- divokého typu pred genotoxickým stresom.39,40Naše údaje ukázali, že expresia p38 v bunkách ožiarených UV žiarením bola znížená oCistanche liečbe. pretoCistanche extrakt získaný z listov a stoniek preukázal účinnú liečbu pri hojení rán.Cistancheextrakt znížil produkciu ROS z UV ožiarenia vychytávaním ROS v bunkách NHDF (obrázky 5A a B). navyšeCistancheextrakt urýchlil hojenie rán po ožiarení kože ((obrázok 6A–C). Tieto výsledky nasvedčujú tomuCistanche extrakt chráni pokožku pred poškodením UV žiarením a môže byť užitočný ako nová surovina v kozmetických aplikáciách.

Obrázok 5Cistanche-sprostredkovaná inhibícia produkcie ROS v bunkách ožiarených UV žiarením.Poznámky: (A) Bunky boli ošetrené UVB žiarením (40 J) počas uvedeného času a potom inkubované s 2′,7′-dichlórdihydrofluoresceín diacetát počas 30 minút. Generovanie ROS sa meralo pomocou FACS. (B) Bunky boli vystavené UVB (40 J) na 180 sekúnd a ošetrené uvedenou koncentráciouCistanchepočas 24 hodín. Produkcia ROS bola odhadnutá s farbením 2′,7′-dichlórdihydrofluoresceín diacetát a analyzované pomocou FACS.skratky:FACS, fluorescenciou aktivované triedenie buniek; FITC, fluoresceín izotiokyanát; NHDF, normálny ľudský dermálny fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktívne formy kyslíka; UV, ultrafialové; UVB, ultrafialové B.

Obrázok 6Účinky na hojenie rán na poškodenú kožu myší.Poznámky: (A) Rany s priemerom 5- mm sa vytvorili na dorzálnej koži 7-týždňových samcov myší C57Bl/6 (n=3). Obnova rán bola hodnotená pomocouCistancheliečba v rôznych koncentráciách (negatívna kontrola a ošetrenie po rane sCistanchena 1, 10 a 50µg/ml). (B) Oblasť rany sa určila meraním priemeru otvorených rán. (C) Oblasť rany sa vypočítala pomocou rozmeru otvorených rán; *P,0.05; **P,0.01. skratky:Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn; Konc, koncentrácia.

Záver

Táto štúdia skúmalapotenciálne účinky extraktu zo stonky a listov Cistanche proti starnutiu a hojeniu ránv bunkách NHDFa myšací model hojenia rán. Theošetrenie buniek NHDF pomocou Cistanche extraktypodporuje obnovu poškriabanej oblastispôsobom závislým od dávky, ako aj zvýšením expresie génu ECM. Okrem toho Cistancheextraktymohli stechrániť bunku pred UV žiarením znížením produkcie ROS. Nakoniec sú tieto pozorovania ďalej hodnotené a potvrdené na modeli myší na hojenie rán in vivo. pretoExtrakt z cistanche predstavuje sľubnú novú terapeutickú látku na ošetrenie proti starnutiu a hojeniu rán.

Poďakovanie:Táto štúdia bola podporená Programom základného vedeckého výskumu prostredníctvom Národnej výskumnej nadácie Kórey (NRF), financovaného ministerstvom školstva (NRF-2014R1A1A3050752). Autori by sa chceli poďakovať Kórejskému výskumnému inštitútu pre bioscience a biotechnológiu (KRIBB) za poskytnutieCistancheextrakty.

Zverejnenie Autori neuvádzajú v tejto práci žiadne konflikty záujmov.

Referencie

1. Slominski AT, Zmijewski MA, Semak I, et al. Cytochrómy p450 a rakovina kože: úloha lokálnych endokrinných dráh.Protirakovinové Látky Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Gilchrest BA. Starnutie pokožky a fotostarnutie.Dermatol Nurs. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ha TY. Vývoj funkčných potravinových materiálov pre zdravý život.Kórejský J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zouboulis CC. Molekulárne mechanizmy starnutia kože: najnovší stav techniky.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MY, Chung SY, Choi WK a kol. Účinok proti starnutiu ryžového vína v kultivovaných ľudských fibroblastoch a keratinocytoch.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Kligman AM. Včasný deštruktívny účinok slnečného žiarenia na ľudskú pokožku.JAMA. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Zmeny spojivového tkaniva v koži vystavenej prirodzenému a terapeutickému UV-žiareniu.Photodermatol. 1985;2(1):15–26. 

8. Bech-Thomsen N, Wulf HC. Karcinogénne a melanogénne účinky filtrovaného kovového halogenidového UVA zdroja a trubicového fluorescenčného UVA opaľovacieho zdroja s alebo bez dodatočného UV žiarenia simulovaného slnkom u bezsrstých myší.Photochem Photobiol. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Štúdie na listoch Piper betle.Býk Kalkata Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ferreres F, Oliveira AP, Gil-Izquierdo A, Valentão P, Andrade PB. Listy Piper betle: profilovanie fenolových zlúčenín pomocou HPLC/DAD-ESI/MS(n) a anticholínesterázovej aktivity.Fytochem Análny. 2014;25(5): 453–460.