Funkčné faktory proti starnutiu a mechanizmus Cistanche Deserticola Ⅱ

3. Výsledok

3.1 Potenciálne aktívne zložky a ciele Cistanche deserticola

Preskúmaním literatúry a spojením s predchádzajúcim výskumom tejto výskumnej skupiny bolo vybraných 12 chemických zložiek vrátane fenyletanolových glykozidov, iridoidov a lignanov ako cieľové zlúčeniny pre sieťový farmakologický výskum. Konkrétne informácie sú uvedené v tabuľke 3. Po odstránení duplikátov z databázy sa získalo celkovo 86 cieľov pre 12 potenciálnych aktívnych zložiek.

Vysokokvalitné cistanche proti starnutiu

3.2 Ciele súvisiace so starnutím

V databázach GeneCards a OMIM bolo zhromaždených 7753 a 295 cieľov súvisiacich so starnutím.

3. 3 Spoločné ciele liekov a chorôb a budovanie siete PPI

Výsledkom priesečníka cieľov pre lieky a cieľových chorôb bolo 75 cieľov priesečníkov, ktoré boli importované do platformy analýzy siete STRING, neprepojené uzly v sieti boli skryté a bola vybudovaná sieť PPI. Pozrite si rozšírené publikačné materiály. V sieti PPI je celkovo 45 uzlov a 59 spojení. Osem hlavných cieľov sa vytriedilo prostredníctvom topologickej analýzy, ako je uvedené v tabuľke 4.

3.4 Analýza obohatenia GO a analýza obohatenia KEGG

Prostredníctvom databázy OmicsBean boli kľúčové ciele podrobené funkčnému obohateniu GO a analýze dráhy KEGG. GO analýza zahŕňa tri aspekty: bunkovú zložku, molekulárnu funkciu a biologický proces. Prvých 10 položiek s najmenšou hodnotou P je zobrazených v vylepšenom publikačnom materiáli. Výsledky ukazujú, že biologické procesy zahŕňajú najmä reguláciu reaktívneho metabolizmu kyslíka, pozitívnu reguláciu imunitných odpovedí, lokalizáciu proteínov do organel, trávenie polysacharidov atď.; bunkové zložky zahŕňajú hlavne endomembránový systém, extracelulárnu oblasť, plazmatickú membránu a bunky viazané na membránu.

Orgány, extracelulárne sekrečné telieska, Golgiho aparát atď.; molekulárne funkcie súvisia najmä s aktivitou glukozidázy, regulačnou aktivitou syntázy oxidu dusnatého, väzbou uhľohydrátov, aktivitou -fruktózovej furanozidázy atď. Celkom 27 dráh súvisiacich so starnutím sa získalo prostredníctvom skríningu obohatenia KEGG a 20 najlepších dráh bolo vtiahnutých do dráhy bublinový diagram (pozri rozšírené publikačné materiály). Cistanche deserticola odďaľuje starnutie.

Tabuľka 3 Aktívne zložky Cistanche deserticola

Tabuľka 4: Hlavné ciele Cistanche deserticola na oddialenie starnutia

Zahŕňa najmä rakovinové dráhy, neurosekrečné systémy a dráhy prenosu signálu. Dráhy rakoviny zahŕňajú najmä rakovinu prostaty, rakovinu prsníka a iné dráhy; neuroendokrinný systém zahŕňa estrogénovú signálnu dráhu, GnRH signálnu dráhu a inzulínovú signálnu dráhu (inzulínová signálna dráha) atď.; signálne dráhy zahŕňajú signálnu dráhu fosfatidylinozitol 3-kináza-proteínkináza B (PI3K Akt) a signálnu dráhu fosfolipázy D (signálna dráha fosfolipázy D).

3.5 Liečivé materiály-komponenty-ciele-vybudovanie siete dráh

Aktívne zložky, ciele a cesty Cistanche deserticola, ktoré spomaľujú starnutie, boli zmapované do siete liečivých látok-zložka-cieľ-cesta prostredníctvom softvéru Cytoscape 3.8.0. V tejto sieti je celkovo 114 uzlov a 218 liniek (pozri rozšírený publikačný materiál).

3.6 Vplyv Cistanche deserticola na dĺžku života háďatiek

Výsledky testu toxicity sú znázornené na obrázku 1. V porovnaní s kontrolnou skupinou, Cistanche deserticola 25 a 50 ug·mL–1

Môže predĺžiť životnosť háďatiek. 100 ug·mL–1 nemá zjavný účinok. 200 a 500 ug·mL-1

Má určitú toxicitu pre háďatká a skracuje ich životnosť. Na základe výsledkov testu toxicity vyberte

Cistanche deserticola sa podávala v hmotnostných koncentráciách 25, 50, 75 a 100 ug·mL–1 na určenie dĺžky života háďatiek N2. Výsledky sú uvedené v tabuľke 5. V porovnaní s kontrolnou skupinou, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

Životnosť háďatiek v skupine sa výrazne predĺžila, takže následné experimenty sa uskutočnili pri 25, 50 a 75 ug·mL–1.

Obrázok 1 Krivka prežitia nematód po podaní rôznych hmotnostných koncentrácií Cistanche deserticola

• Legenda:

• Červená: Kontrolná skupina
• Modrá: Skupina Cistanche 25 ug.mL-1
• Zelená: Skupina Cistanche 50 ug.mL-1
• Fialová: Skupina Cistanche 100 ug.mL-1
• Oranžová: Skupina Cistanche 200 ug.mL-1
• Hnedá: Skupina Cistanche 500 ug.mL-1

• Osy:

• Os Y: Miera prežitia (%)

• Os X: čas (t/d)

  
  

3.7 Vplyv Cistanche deserticola na stresovú schopnosť háďatiek

V podmienkach oxidačného stresu vyvolaného H2O{1}} sa v porovnaní s kontrolnou skupinou predĺžila životnosť háďatiek v skupine liečenej Cistanche deserticola (obrázok 2A). Priemerná dĺžka života háďatiek v kontrolnej skupine bola (1,44±0.07) h a Cistanche deserticola 75 ug·mL– Priemerná dĺžka života nematód v skupine 1 bola (2. 02 ±0 05) h a životnosť sa výrazne predĺžila (P<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tabuľka 5 Vplyv rôznych hmotnostných koncentrácií Cistanche deserticola na dĺžku života háďatiek (xˉ±s, n=100)

Poznámka:V porovnaní s kontrolnou skupinou, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Účinok Cistanche deserticola na akumuláciu lipofuscínu a schopnosť háďatiek ohýbať telo

Lipofuscín sa vekom postupne hromadí. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa hladiny modrej fluorescencie háďatiek v skupinách Cistanche deserticola 25, 50 a 75 ug·mL–1 znížili o 15,09 %, 28,7 % a 39, 86 %. na 7. deň (obrázok 3A-B); Na 11. deň sa hladiny modrej fluorescencie znížili o 8,55 %, 22,36 % a 36,84 %, čo naznačuje, že Cistanche deserticola inhibovala akumuláciu lipofuscínu.

Účinok Cistanche deserticola na schopnosť nematód ohýbať telo je znázornený na obrázku 3C. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa počet časov ohybu tela háďatiek v skupine Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 zvýšil o 25 % a 36 % do 30 s na 3. a 7. deň. 17 %, čo naznačuje, že Cistanche deserticola môže podporovať ohýbanie tela háďatiek.

3.9 Účinok Cistanche deserticola na schopnosť prehĺtania a reprodukčnú schopnosť háďatiek

Na 3. a 7. deň v porovnaní s kontrolnou skupinou nebol žiadny štatisticky významný rozdiel v rýchlosti hltanového čerpania (počet hltanových púmp v priebehu 60 s) háďatiek v skupine, ktorej sa podávala Cistanche deserticola (obrázok 4A), čo naznačuje, že Cistanche deserticola nezmenilo faryngálnu rýchlosť čerpania N2 háďatiek. Príjem potravy, účinky na dlhovekosť sprostredkované Cistanche deserticola nezávisia od diétnych obmedzení. Neboli žiadne významné zmeny v počte vajíčok (obrázok 4B) a počte potomkov (obrázok 4C) háďatiek liečených liekom v porovnaní s kontrolnou skupinou, čo naznačuje, že Cistanche deserticola neovplyvnila reprodukčnú schopnosť háďatiek.

3.10 Vplyv Cistanche deserticola na obsah ROS, MDA a aktivitu antioxidačných enzýmov

Akútna stresová toxicita má za následok zvýšené hladiny ROS. Ako je znázornené na obrázkoch 5A a 5B, v porovnaní s kontrolnou skupinou bola hladina akumulácie ROS háďatiek v skupine Cistanche deserticola významne znížená na 7. deň podávania (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Legenda:

• Červená: Kontrolná skupina
• Modrá: Skupina Cistanche 25 ug.mL-1
• Zelená: Skupina Cistanche 50 ug.mL-1
• Fialová: Skupina Cistanche 100 ug.mL-1
• Oranžová: Skupina Cistanche 200 ug.mL-1
• Hnedá: Skupina Cistanche 500 ug.mL-1

3.11 Účinok Cistanche deserticola na expresiu mRNA génov súvisiacich so starnutím

Inzulínová (IIS) signálna dráha medzi 20 top dráhami analyzovanými KEGG úzko súvisí so starnutím C. elegans a výskum mechanizmu je relatívne zrelý [10], čím sa overuje expresia génov súvisiacich so starnutím na inzulínovej signálnej dráhe. Peptidy podobné inzulínu (ILP) uvoľnené v C. elegans sa viažu na ich receptor DAF-2 a aktivujú konečný produkt pokročilej glykácie-1 (AGE-1), ktorý ďalej aktivuje proteínkinázu B{{ 7}/2 (Akt -1/2). fosforyluje transkripčný faktor DAF-16, čo vedie k aktivite DAF{12}} a

Jeho migrácia do jadra je inhibovaná [11]. Ako je znázornené na obrázku 6, v porovnaní s kontrolnou skupinou boli hladiny expresie mRNA DAF-2, AGE-1 a Akt{4}} v nematódach v Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 skupine boli výrazne znížené (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). Ukázalo sa, že účinok predlžovania života sprostredkovaný Cistanche deserticola závisí od signálnej dráhy IIS. Gén sir-2.1 hrá dôležitú úlohu vo fyziologických aktivitách, ako je starnutie háďatiek, stres a apoptóza. Upregulácia expresie génu sir-2.1 predĺži životnosť háďatiek [12], ale po podaní lieku sa nedostaví žiadny účinok. Výrazne zmenila úroveň výrazu SIR-2. 1 mRNA (obrázok 6). HSF-1 a SKN{13}} hrajú dôležitú úlohu pri regulácii oxidačného stresu a starnutia u C. elegans [11]. Výsledky ukázali, že v porovnaní s kontrolnou skupinou Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

Úrovne expresie HSF-1, HSP-16. 1, HSP-16. 2 a SKN-1 mRNA v skupine C. elegans boli významne zvýšené (obrázok 6). Transkripčné faktory DAF-16/forkhead box protein (FOXO) a SKN-1/faktor 2 súvisiaci s jadrovým transkripčným faktorom E2-sú aktivované a môžu regulovať mnohé gény kódujúce súvisiace s antioxidantmi proteíny [13]. V porovnaní s kontrolnou skupinou boli hladiny expresie SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2 a MTL{18}} mRNA nematód v Skupina Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 sa významne zvýšila, čo naznačuje, že Cistanche deserticola môže zvýšiť antioxidačnú kapacitu. predĺžiť si život. Diétne obmedzenie môže zlepšiť mitochondriálne funkcie a predĺžiť životnosť obmedzením príjmu potravy [14]. Neexistoval žiadny štatisticky významný rozdiel v expresii EAT-2 mRNA v nematódach v každej skupine, čo naznačuje, že účinok predlžujúci život sprostredkovaný Cistanche deserticola sa nevyskytuje cestou obmedzenia stravy (obrázok 6).

Obrázok 4 Vplyv Cistanche deserticola na schopnosť prehĺtania a reprodukčnú schopnosť háďatiek (xˉ±s, n=5)

Legenda:

• 对照组: Kontrolná skupina
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Skupina Cistanche 25 ug/ml
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Skupina Cistanche 50 ug/ml
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Skupina Cistanche 75 ug/ml

Graf B:

• 30 s内水平游泳距离/次: horizontálna vzdialenosť preplávania za 30 sekúnd/čas
• 第3日: Deň 3
• 第7日: Deň 7

Graf C:

• 相关水平的百分率: Percento zodpovedajúcej úrovne
• 第7日: Deň 7
• 第11日: Deň 11

Graf A:

• 60 s内爬壁次数: Počet prelezení steny za 60 sekúnd
• 第{{0}}日: Deň 0
• 第3日: Deň 3
• 第7日: Deň 7

Graf B:

• 广泛测试得分: Skóre testu v otvorenom poli
• 第1日: Deň 1
• 第2日: Deň 2
• 第3日: Deň 3
• 第4日: Deň 4
• 第5日: Deň 5

Graf C:

• 千元迷宫次数: Chyby Y-bludiska
• 第1日: Deň 1
• 第2日: Deň 2
• 第3日: Deň 3
• 第4日: Deň 4
• 第5日: Deň 5

3. 12 Účinok Cistanche deserticola na dĺžku života háďatiek s príbuznými génovými mutantmi

V porovnaní s kontrolnou skupinou bola krivka životnosti génových mutantných háďatiek daf{{0}}, skn{1}} a hsf{2}} v skupine Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 sa po liečbe výrazne neposunuli doprava (obrázok 7A~C). Priemerná dĺžka života mutantných háďatiek v géne eat -2 sa zvýšila o 16,45 % (P < 0,001, obrázok 7D).

Výsledky ukázali, že účinok predlžovania života sprostredkovaný Cistanche deserticola súvisel s génmi daf-16, hsf-1 a skn-1, ale nie s génom eat-2 .

3. 13 Účinok Cistanche deserticola na jadrovú translokáciu proteínov DAF-16 a SKN-1

Reprezentatívne obrázky expresie proteínu DAF{0}} v cytoplazme, medzibunkovom priestore a jadre sú znázornené na obrázku 8A. V porovnaní s kontrolnou skupinou bol pomer jadrovej lokalizácie DAF-16 proteínu v hlístach významne zvýšený a pomer cytoplazmatickej lokalizácie bol významne znížený po podaní Cistanche deserticola (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Obrázok 5 Účinky Cistanche deserticola na ROS, obsah MDA a aktivitu antioxidačných enzýmov u háďatiek (xˉ±s, n=100)

Legenda:

• 对照组: Kontrolná skupina
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Skupina Cistanche 25 ug/ml
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Skupina Cistanche 50 ug/ml
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Skupina Cistanche 75 ug/ml

Graf B:

• 30 s内水平游泳距离/次: horizontálna vzdialenosť preplávania za 30 sekúnd/čas
• 第3日: Deň 3
• 第7日: Deň 7

Graf C:

• 相关水平的百分率: Percento zodpovedajúcej úrovne
• 第7日: Deň 7
• 第11日: Deň 11

Graf A:

• 60 s内爬壁次数: Počet prelezení steny za 60 sekúnd
• 第{{0}}日: Deň 0
• 第3日: Deň 3
• 第7日: Deň 7

Graf B:

• 广泛测试得分: Skóre testu v otvorenom poli
• 第1日: Deň 1
• 第2日: Deň 2
• 第3日: Deň 3
• 第4日: Deň 4
• 第5日: Deň 5

Graf C:

• 千元迷宫次数: Chyby Y-bludiska
• 第1日: Deň 1
• 第2日: Deň 2
• 第3日: Deň 3
• 第4日: Deň 4

• 第5日: Deň 5

  
  

3. 14 Účinok Cistanche deserticola na proteínovú expresiu SOD-3, GST-4 a HSP-16.2 u háďatiek

Hladiny expresie proteínov SOD-3, GST{1}} a HSP{2}}.2 sa vizualizovali a kvantifikovali pomocou transgénnych háďatiek CF1553, CL2166 a TJ375 (obrázok 9). V porovnaní s kontrolnou skupinou boli hladiny proteínovej expresie SOD-3 a GST-4 v nematódach v každej skupine hmotnostnej koncentrácie Cistanche deserticola významne zvýšené (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).