Antimelanogénny účinok etanolového extraktu z ciroku dvojfarebného na melanogenézu indukovanú IBMX v bunkách melanómu B16/F10

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo a Ho Jin Heo

Abstrakt:Vyhodnotiť možnosť ako prostriedok na bielenie pokožkyCirok dvojfarebný(S. bicolor), jehoantioxidantaktivitu a antimelanogénny účinok na indukovaný 3-izobutyl-1-metylxantínom (IBMX)melanogenézav B16/F10 melanómových bunkách. Výsledok celkového obsahu fenolov (TPC) ukázal, že 60 percent etanolového extraktuS. bicolor(ESB) má najvyšší obsah ako iné etanolové extrakty.Antioxidantaktivita bola hodnotená pomocou diamóniovej soli 2,2'-azino-bis-(3-etylbenzotiazolín-6-sulfónovej kyseliny) (ABTS)/1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl aktivity zachytávania radikálov (DPPH) a inhibičný účinok na malondialdehyd (MDA). Tieto výsledky ukázali, že ESB má významnéantioxidantčinnosti. Inhibičný účinok proti tyrozináze bol tiež hodnotený s použitím L-tyrozínu (hodnota IC50=89,25 ug/ml) a 3,4-dihydroxy-L-fenylalanínu (L-DOPA) ako substrátov. Okrem toho liečba ESB účinne inhibovala produkciu melanínu v bunkách melanómu B16/F10 indukovaných IBMX. Na potvrdenie mechanizmu anti-melanogénneho účinku ESB sme skúmali proteíny súvisiace s melanogenézou. ESB znížená reguláciamelanogenézaznížením expresie transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF), tyrozinázy a proteínu súvisiaceho s tyrozinázou (TRP)-1. Nakoniec sa 9-kyselina hydroxyoktadekadiénová (9-HODE),1,{6}}O-dikaffeoylglycerol a tricín ako hlavné zlúčeniny ESB analyzovali pomocou kvadrupólu ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie a separácie pohyblivosti iónov čas letu/tandemová hmotnostná spektrometria (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Tieto zistenia naznačujú, že ESB môže mať fyziologický potenciál na použitie ako materiál na bielenie pokožky.

Kľúčové slová:protimelanogenéza; melanómová bunka B16/F10; kyselina hydroxyoktadekadiénová;Sorghumbicolor; 3-izobutyl-1-metylxantín

Cistanche inhibuje tvorbu melanínu.

1. Úvod

Melanín vzniká procesom, tzvmelanogenézav intracelulárnych melanozómoch melanocytov a produkcia a distribúcia melanínu určujú farbu kože, očí a vlasov. Melanín navyše zohráva dôležitú úlohu pri ochrane pokožky pred rôznymi molekulami a stimulmi, ako je ultrafialové (UV) žiarenie, reaktívne formy kyslíka (ROS), hormón stimulujúci melanocyty (-MSH) a látky zvyšujúce hladinu cyklického adenozínmonofosfátu (cAMP), vrátane forskolínu a IBMX [1]. Najmä UV žiarenie priamo a nepriamo poškodzuje kožné bunky prostredníctvom tvorby ROS, ako sú hydroxylové radikály, superoxidové anióny a peroxid vodíka [2]. Generovaný ROS spôsobuje jedno- a dvojvláknové zlomy DNA a napáda dôležité bunkové štrukturálne molekuly, ako sú proteíny a lipidy [2]. Teda melanín aantioxidantenzýmy, ako je glutatiónperoxidáza, superoxiddismutáza a kataláza, udržujú konštantnú hladinu odstránením produkovaných ROS. Nadmerná produkcia ROS v dôsledku rôznych faktorov však aktivuje melanogenézu v koži a abnormálna akumulácia melanínu vyvoláva negatívne hyperpigmentačné účinky, ktoré spôsobujú starecké alebo pečeňové škvrny, škvrny a pehy [3,4]. V súčasnosti sa prírodné zlúčeniny, ako je kyselina kojová, hydrochinón, arbutín a kyselina askorbová, ktoré sú známe ako inhibítory syntézy melanínu, využívajú ako prísady do činidiel na bielenie kože. Tieto zložky však nielen zle prenikajú do kože, ale pri dlhodobom podávaní spôsobujú aj cytotoxicitu a zápal [5]. V tomto ohľade je potrebné vyvinúť nedráždivé a účinné bieliace činidlo na liečbu hyperpigmentácie ľudskej pokožky, ako aj študovať na to prírodné zdroje.

Ľudské kožné bunky bežne vytvárajú melanín ako fotoochrannú reakciu. Melanogenéza je komplexný proces, ktorý je regulovaný prostredníctvom rôznych signálnych dráh a všetky signály v konečnom dôsledku zvyšujú reguláciu MITF. Keďže aktivovaný MITF podporuje expresiu rodiny génov tyrozinázy (tyrozinázy a TRP),melanogenézazačína vážne [6]. Vo všeobecnosti je prvým krokom melanogenézy to, že tyrozináza katalyzuje oxidáciu L-tyrozínu na 3,4-dihydroxy-L-fenylalanín (L-DOPA) a následne oxiduje L-DOPA na DOPA chinón. A potom TRP-2 premení DOPA chróm na 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylovú kyselinu (DHICA) alebo 5,{13}}dihydroxyindol (DHI). Nakoniec sú DHICA a DHI oxidované TRP-1, čo nakoniec vedie k produkcii melanínu [6].

IBMX a iné metylxantíny stimulujú melanogenézu inhibíciou fosfodiesterázy, a tým zvyšujú hladiny cAMP [7]. cAMP aktivovaný IBMX fosforyluje signálne dráhy extracelulárnej signálom regulovanej kinázy (ERK) a fosfoinozitidových 3-kináz/proteínkinázy B (PI3K/Akt) a v konečnom dôsledku vedie k aktivácii MITF v procesoch melanogenézy [7]. Preto môže byť downregulácia týchto proteínov považovaná za dôležitý faktor pre anti-bieliaci účinok.

Cirok dvojfarebný(S. bicolor), ktorý patrí do čeľade Poaceae, je považovaný za dôležitú plodinu v intropických oblastiach vrátane Afriky, Strednej Ameriky a suchých oblastí a je štvrtou najdôležitejšou obilninou na svete po pšenici, ryži a kukurici [8 ]. Nedávne štúdie ukázali, že S. bicolor je prospešný pre ľudí, pretože obsahuje fytochemikálie, ako sú fenolové zlúčeniny, taníny a antokyány [9]. Tieto fytochemikálie si získali zvýšenú pozornosť vďaka ichantioxidantúčinky proti obezite, cukrovke a protizápalové účinky [10–14]. Hoci existujú rôzne výsledky výskumu, štúdie o účinku S. bicolor na bielenie pokožky ešte neboli vykonané. Preto sa táto štúdia zamerala na skúmanie antioxidačnej aktivity a antimelanogénnych účinkovS. bicolora preskúmať ich účinky na IBMX-indukovanémelanogenézav bunkách melanómu B16/F10.

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie

Folin-Ciocalteuovo činidlo, L-DOPA, L-tyrozín, kyselina L-askorbová, arbutín, akarbóza, dimetylsulfoxid (DMSO), hovädzí sérový albumín, -glukozidáza, hubová tyrozináza, hovädzí sérový albumín,3-(4,{ {6}}dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid (MTT) a IBMX boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). MITF (bsm-51339M) a tyrozináza (bs{12}}R) boli zakúpené od spoločnosti Bioss (Peking, Čína). TRP-1 (sc{14}}) a -aktín (sc{16}}) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Sekundárne protilátky (anti-králičie a anti-myšie) boli získané od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

2.2. Príprava vzorky

S. bicolor(20} g) sa extrahovalo rôznymi koncentráciami etanolu (0, 20, 40, 60, 80 a 95 percent; 1 1) pri 40 stupňoch počas 2 hodín s použitím spätného chladiča. Extrakty sa prefiltrovali pomocou filtračného papiera (WhatmanInternational Limited, Kent, UK) a skoncentrovali sa pomocou vákuovej odparky (N-1000; EYELA Co., Tokyo, Japonsko). Potom, čo sa extrakty lyofilizovali pomocou vákuovej vymrazovacej sušičky (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Kórea), sušené extrakty sa skladovali pri -20 stupňoch až do použitia.

2.3. Antioxidačná aktivita in vitro

2.3.1. Celkový obsah fenolov (TPC)

Celkový obsah fenolov sa skúmal na základe princípu, že Folin-Ciocalteuovo činidlo sa v alkalických podmienkach redukovalo na modrý reakčný produkt. Vzorka (1 ml) zmiešaná s Folin-Ciocalteuovým činidlom a 7 percentným uhličitanom sodným. Zmes sa aktivovala 2 hodiny a potom sa merala absorbancia pri 760 nm pomocou spektrofotometra (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japonsko). TPC bola vypočítaná zo štandardnej krivky kyseliny galovej a výsledky boli vyjadrené ako mg GAE g-1.

2.3.2. Radikálna upratovacia činnosť

Roztok radikálového katiónu ABTS bol vyrobený zmiešaním 2,45 mM persíranu draselného a 7 mMABTS s 1 0{{10}} mM pufrom fosforečnanu draselného (pH 7,4) obsahujúcim 150 mM a nechali reagovať 24 hodín pri izbovej teplote. Roztok ABTS sa potom zriedil destilovanou vodou, aby sa získala absorbancia 0,700 ± 0,020 pri 734 nm. Vzorka sa nechala reagovať s 980 ul roztoku ABTS počas 10 minút pri 37 stupňoch a potom sa pomocou spektrofotometra (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japonsko) merala absorbancia pri 734 nm. rozpustením 0,1 mM DPPH v 80 percentnom metanole. Roztok DPPH sa zriedil na absorbanciu 1.000 ± 0,020 pri 517 nm. 50 ul vzorky sa zmiešalo s 1,45 ml roztoku DPPH a nechalo sa reagovať 30 minút v tme. Po zreagovaní bola zmes stanovená pri 517 nm.

2.3.3. Inhibičný účinok na peroxidáciu lipidov

Na meranie inhibičného účinku na peroxidáciu lipidov v mozgovom tkanive bola použitá metóda reaktívnych látok s kyselinou tiobarbiturovou (TBA). Mozgové tkanivo bolo homogenizované v 20 mM Tris-HCl pufri (pH 7,4) a centrifugované pri 6000 x g počas 20 minút. Supernatant sa pridal k 0,1 mM kyseline L-askorbovej a 10 uM síranu železnatému 37 stupňov na 1 hodinu inkubácie. Potom sa do zmesi pridalo 30 percent kyseliny trichlóroctovej a 1 percenta TBA, ktorá sa potom inkubovala vo vodnom kúpeli pri 80 stupňoch počas 20 minút. Potom sa TBA-MDAkomplex meral pomocou spektrofotometra (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japonsko) pri 532 nm.

2.4. Inhibičný účinok tyrozinázy

Inhibičný účinok tyrozinázy bol stanovený použitím L-tyrozínu ako substrátu. Vzorka sa pridala do 96-jamkovej platne a zmiešala sa s 0.1 M pufrom fosforečnanu sodného, ​​tyrozinázou a 0,1 mML-tyrozínovým substrátom, aby reagovala pri 37 stupňoch. Po inkubácii sa merala aktivita enzýmu pomocou čítačky mikrodoštičiek (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) pri 490 nm. L-DOPA sa tiež použila ako substrát na meranie inhibičnej aktivity tyrozinázy. Ku vzorke sa pridal 67 mM pufor fosforečnanu sodného, ​​tyrozináza a 10 mML-DOPA substrát, aby reagovali pri 37 stupňoch počas 10 minút. Aktivita tyrozinázy sa merala pri 415 nm.

Cistanche inhibuje tvorbu melanínu

2.5. - Inhibičný účinok na glukozidázu

Inhibičný účinok na -glukozidázu bol meraný zmiešaním 0.1 M tlmivého roztoku fosforečnanu sodného a -glukozidázy pri 37 stupňoch počas 10 minút. Po aktivácii sa zmes pridala k 5 mM 4-nitrofenyl- -D-glukopyranozidu v pufri pri 37 stupňoch počas 5 minút a potom sa merala absorbancia pri 405 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.6. Test bunkovej životaschopnosti

Cytotoxicita vzorky bola odhadnutá pomocou MTT testu. Bunky melanómu B16/F10 sa kultivovali v množstve 1 x 104 buniek/jamku na 96-jamkovej platni počas 24 hodín. Potom sa vzorky ošetrili na koncentrácie 1, 2, 5 a 10 ug/ml. Vzorky boli ošetrené počas 48 hodín, potom boli bunky ošetrené 10 ug/ml zásobného roztoku MTT počas 3 hodín. Nakoniec sa médium odstránilo a pridal sa DMSO na solubilizáciu formazanu. Množstvo formazanu sa kvantifikovalo pomocou čítačky mikrodoštičiek (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) pri 570 nm (excitačná vlnová dĺžka) a 655 nm (emisná vlnová dĺžka).

2.7. Meranie obsahu bunkového melanínu

Na meranie množstva melanínu sa bunky melanómu B16/F10 kultivovali na 24-jamkovej doštičke pri hustote 4 x 104 buniek/jamku vyššou počas 24 hodín. Potom boli bunky ošetrené 100 mM IBMX a ESB alebo pozitívnou kontrolou (arbutín) počas ďalších 48 hodín. Po ošetrení sa bunky premyli a zozbierali s použitím fosfátového pufra (PBS). Zozbierané bunky sa potom centrifugovali pri 16, 000 x g počas 10 minút a získaná peleta sa rozpustila v 1 N hydroxide sodnom obsahujúcom 10 percent DMSO pri 90 stupňoch počas 20 minút. Obsah melanínu sa meral pri 490 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.8. Western Blot analýza

Vopred ošetrené B16/F10 melanómové bunky boli premyté PBS a lyzované pomocou RIPA pufra obsahujúceho 1 % inhibítorov proteázy na ľade. Koncentrácie proteínov boli stanovené Bradfordovým proteínovým testom a rovnaké proteíny boli denaturované Laemmliho pufrom počas 10 minút pri 95 stupňoch. Denaturované proteíny sa oddelili elektroforézou na 10 percentnom dodecylsulfátovom polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) a potom sa preniesli na polyvinylidéndifluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Billerica, MA, USA). Ďalej sa membrány blokovali 5 percentným odstredeným mliekom v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku s 0,1 percentami Tween20 (TBST) počas 1 hodiny a potom reagovali s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 °C. Membrány reagovali so sekundárnymi protilátkami počas 1 hodiny a imunitné komplexy sa vizualizovali s použitím zosilneného chemiluminiscenčného činidla (Bionote, Hwaseong, Kórea). Obrázky pásov boli detegované a analyzované spoločnosťou Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

2.9. Analýza UPLC-IMS-QTOF/MS2

Hlavné zlúčeniny v 60 percentných etanolových extraktoch zS. bicolorsa analyzovali pomocou UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, USA). Chromatografická separácia sa uskutočnila s použitím kolóny Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 10{{10}} mm, veľkosť častíc 1,7 um; Waters Corp.) pri prietoku 0,35 ml/min. Mobilné fázy pozostávali z rozpúšťadla A (0,1 percenta kyseliny mravčej v destilovanej vode) a B (acetonitril) a podmienky analýzy zahŕňali nasledujúci časový gradient: 1 percento B pri 0 – 1 min, 1 – 100 percent B po 1 – 7 min. 100 percent B po 7-8 minútach, 100-1 percent B po 8-8,2 minútach, 1 percento B po 8,2-10 minútach. Hmotnostná spektrometria sa uskutočňovala v negatívnom režime elektrosprejovej ionizácie (ESI) za nasledujúcich podmienok: teplota zdroja, 100 ◦C; teplota desolvatačnej línie, 400 ◦C; energia nárazu rampy, 10–30 V; kapilárne napätie, 2,5 kV. Fenolové zlúčeniny boli detegované úplným skenovaním v rozsahu od m/z 50 do 1500.

2.10. Štatistická analýza

Všetky výsledky boli prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Štatistický rozdiel medzi skupinami bol určený jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím Duncanovho nového testu s viacerými rozsahmi (p < 0.05)="" so="" softvérom="" sas="" verzie="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" usa)="" .a="" vzájomný="" vzťah="">antioxidantúčinky (aktivita zachytávania radikálov ABTS/DPPH a inhibičný účinok MDA) a inhibičný účinokmelanogenéza-sprostredkované enzýmy (tyrozináza a -glukozidáza) bola hodnotená Pearsonovou korelačnou analýzou.

3. Výsledky

3.1. Celkový obsah fenolov

Pre porovnanieantioxidantaktivita každého etanolového extraktu zS. bicolorAko je znázornené na obrázku 1, TPC sa medzi etanolovými extraktmi líšili; 60 percentný etanolový extrakt (150,08 ± 1,13 mg GAE/g) bol výrazne vyšší ako pri iných extrakciách (0 percent; 70,83 ± 1,18, 20 percent; 100,42 ± 0,72, 40 percent 114,67 ± 1,46, 80 percent, 118,33 ± 3,17 a 95 percent, 73,67 ± 1,46 mg GAE/g). Preto sa 60 percentný etanolový extrakt použil na ďalšie experimentálne analýzy.

3.2. Radikálna upratovacia činnosť

Theantioxidantaktivita 60 percentného etanolového extraktu zS. bicolor(ESB) bola meraná pomocou testu ABTS/DPPH a testu MDA a výsledky sú znázornené na obrázku 2. Aktivita ESB na zachytávanie radikálov ABTS bola vykázaná na 97,98 percent pri koncentrácii 1000 ug/ml a vitamín C (99,82 percent) , ktorý sa používa ako pozitívna kontrola a má tiež podobnú aktivitu zachytávania radikálov pri rovnakej koncentrácii (obrázok 2A). A ESB vykazoval 50 percentný inhibičný účinok (hodnota IC50) ABTS radikálu pri koncentrácii 409,71 ug/ml. Ako je znázornené na obrázku 2B, aktivita ESB zachytávajúca radikály DPPH bola 79,44 percent pri koncentrácii 1000 ug/ml a hodnota IC50 bola indikovaná pri 612,53 ug/ml. Inhibičný účinok produkcie MDA ESB ukázal inhibičný účinok 89,54 percent pri koncentrácii 50 ug/ml a ukázal vyšší inhibičný účinok ako katechín (71,03 percent), čo je pozitívna kontrola, pri rovnakej koncentrácii (obrázok 2C). Okrem toho sa hodnota IC50 MDA pozorovala pri koncentráciách ESB 16,56 ug/ml.

3.3. Inhibičný účinok enzýmov sprostredkovaných melanogenézou

Inhibičný účinokmelanogenéza-sprostredkované enzýmy sa hodnotili pomocou tyrozinázy a -glukozidázy (obrázok 3). Na meranie inhibičnej aktivity tyrozinázy proti syntéze melanínu sa uskutočnili experimenty s použitím L-tyrozínu a L-DOPA ako substrátu v podmienkach bez buniek. Výsledkom bolo, že hodnota IC50 bola 89,25 µg/ml, keď L -tyrozín bol použitý ako substrát (obrázok 3A), ale L-DOPA nemohla pozorovať viac ako 50 percent inhibičného účinku (obrázok 3B). V tomto čase bola hodnota IC50 pozitívnej kontroly (arbutín) pre L-tyrozín 74,35 ug/ml, čo bolo vyššie ako ESB. Zistilo sa, že ESB má lepší inhibičný účinok na tyrozinázu pri použití L-tyrozínu ako pri použití L-DOPA ako substrátu. Preto na základe výsledkov testu s použitím dvoch substrátov sa predpokladá, že inhibičný účinok ESB na tyrozinázu súvisí skôr s oxidáciou L-tyrozínu na L-DOPA než s oxidáciou L-DOPA na DOPA chinón v melanogenéze. Inhibičný účinok na tyrozinázu s použitím L-DOPA ako substrátu a aktivita zachytávania radikálov (ABTS; 0,943, p < 0,05,="" dpph;="" 0,952,="" p="">< 0,05)="" indikovali="" pozitívne="" silné="" korelácie="" v="" tabuľke="">

Na meranie inhibičného účinkumelanogenézaenzýmom, bola meraná inhibičná aktivita ESB proti -glukozidáze. Ako je znázornené na obrázku 3C, ESB inhiboval -glukozidázu o 33,72 percent pri koncentrácii 200 ug/ml. A IC50 ESB bolo 46,29 ug/ml, čo je asi päťkrát viac ako u akarbózy (216,05 ug/ml). Tieto výsledky naznačujú, že ESB má lepšiu inhibičnú aktivitu na glukozidázu ako akarbóza ako pozitívna kontrola. A inhibičný účinok -glukozidázy odhalil silné pozitívne korelácie s inhibičným účinkom MDA (0,966, p < 0,05)="" v="" tabuľke="">

3.4. Životaschopnosť buniek a syntéza bunkového melanínu

Na potvrdenie cytotoxicity ESB boli bunky melanómu B16/F10 ošetrené ESB počas 24 hodín pri koncentráciách 1, 2, 5, 10 a 20 ug/ml. Výsledky ukázali, že ESB neovplyvnil životaschopnosť buniek v uvedených koncentráciách v porovnaní s kontrolou (obrázok 4A). Preto sa experimenty uskutočňovali výberom koncentrácií 2, 5 a 10 ug/ml. Následne boli bunky melanómu B16/F10 ošetrené IBMX, aby sa analyzoval účinok ESB na produkciu melanínu. Ako je znázornené na obrázku 4B, hladina obsahu melanínu sa pri liečbe IBMX zvýšila na 316,85 percent. Na druhej strane skupina liečená ESB (108,60 percent) pri koncentrácii 10 ug/ml vykazovala významne znížený obsah melanínu v porovnaní so skupinou liečenou IBMX a podobný obsah melanínu v porovnaní so skupinou liečenou arbutínom (101,79 percent) ako pozitívna kontrola.

3.5. Melanogenéza v bunkách melanómu B16/F10

Melanogenézaje nevyhnutný proces na ochranu ľudskej pokožky pred vonkajšími podnetmi a tento proces je regulovaný rôznymi mechanizmami. V tejto štúdii sme merali hladinu expresie molekúl regulujúcich melanogenézu, aby sme potvrdili potenciálny inhibičný mechanizmus ESB na produkciu melanínu indukovanúIBMX v bunkách melanómu B16/F10 (obrázok 5). Výsledky ukázali, že ESB účinne znížil expresiu MITF indukovanú IBMX (obrázok 5A, B). Expresia tyrozinázy (obrázok 5A, C) a TRP-1 (obrázok 5A, D) bola teda znížená znížením MITF s liečbou ESB. Výsledkom bolo, že ošetrenie ESB znížilo expresiu príbuzných proteínov v bunkách melanómu melanogenézy B16/F10 indukovanej IBMX.

3.6. Analýza UPLC-IMS-QTOF/MS2

Profil hlavných zlúčenín ESB sa skenoval pomocou LC/MS v rozsahu m/z 50–1500 a chromatogramy základných píkov sú znázornené na obrázku 6. Ďalšia identifikácia a charakterizácia zlúčenín sa uskutočnila v porovnaní s údajmi z literatúry použitím Údaje o fragmentácii MS2 (tabuľka 2). Na základe fragmentov v predchádzajúcej literatúre bol vrchol 2 1-0-kafeoylglycerol (m/z 253,07, 179,03, 161,02 a 135,04) [15]; pík 3, dikafeoylglyceridy (m/z 415,10, 253,07, 179,03 a 135,04) [16]; vrchol 4, 1, 3-0-dikaffeoylglycerol (m/z 415,10, 253,07, 179,03, 161,02 a 135,04) [16]; vrchol 5, p-kumaroyl-kafeoylglycerol, 215,01,039, 179,03 m/z 179,03 a 135,04) [17]; pík 6, feruloyl-kafeoylglycerol (m/z 429,12, 253,07, 193,05, 161,02 a 134,03) [18]; pík 7, tricín (m/z 329,23, 314,04, 299,01 a 271,02) [19]; a vrchol 9, kyselina 9-hydroxyoktadekadiénová (9-HODE) (m/z 295,22, 277,21 a 171,10) [20]. Medzi nimi boli ako hlavné zlúčeniny identifikované 1,3-0-dikaffeoylglycerol (obrázok 6B), tricín (obrázok 6C) a 9-HODE (obrázok 6D).

účinky cistanche:antioxidačné

4. Diskusia

Melanogenézasa uvádza, že je spôsobený zvýšeným oxidačným stresom z vonkajších stimulov. Oxidačný stres spôsobuje oxidáciu DNA a proteínov, peroxidáciu lipidov a zvýšené množstvo nenasýtených mastných kyselín. Tento stres tiež vedie k zbytočnému zvýšeniu syntézy melanínu v melanocytoch na koži. Nadmerná tvorba melanínu teda môže spôsobiť pigmentáciu a môže viesť k rakovine kože. IBMX stimuluje melanogenézu inhibíciou fosfodiesterázy a tým zvyšuje hladiny cAMP [7]. Keď sa hladina cAMP v bunkách zvyšuje, spôsobuje aktiváciu signálnych dráh ERK a PI3K/Akt, ktoré podporujú tvorbu proteínov spojených s melanogenézou. Preto sme skúmali bieliaci účinok ESB na melanogenézu indukovanú IBMX v bunkách melanómu B16 / F10.

Fenolové zlúčeniny ako sekundárne metabolity rastlín majú tú vlastnosť, že sa pri reakcii s radikálmi stabilizujú rezonančnou štruktúrou [21]. Fenolové zlúčeniny tiež pôsobia ako dôležité faktory pre antioxidačnú aktivitu, ako je aktivita zachytávania radikálov ABTS/DPPH a pôsobia ako inhibítory tvorby pigmentu, pretože majú chemickú štruktúru podobnú štruktúre L-tyrozínu [22,23]. Test ABTS/DPPH je najbežnejšia a najjednoduchšia metóda na odhad in vitroantioxidantčinnosť. V tejto štúdii ESB preukázal vysokú aktivitu TPC (obrázok 1) a ABTS/DPPH radikálovú aktivitu (obrázok 2A, B). Najmä ESB bola vyššia v aktivite zachytávania radikálov ABTS ako aktivita zachytávania radikálov DPPH. Test DPPH sa používa na meranie aktivity zachytávania radikálov hydrofóbnych zlúčenín, zatiaľ čo test ABTS umožňuje merať aktivitu zachytávania radikálov proti hydrofóbnym, ako aj hydrofilným zlúčeninám [24]. Preto sa potvrdilo, že aktivita ESB zachytávajúca radikály bola viac ovplyvnená hydrofilnou zlúčeninou.

Expozícia UV žiareniu spôsobuje produkciu ROS a má priame a nepriame účinky na kožu. ROS najmä indukuje peroxidáciu lipidov napadnutím nenasýtených mastných kyselín, ktoré sú súčasťou bunkových membrán [2]. Akumulácia lipidových peroxidov vedie k deštrukcii antioxidačného systému kože, čo spôsobuje pigmentáciu, zápal a starnutie [25]. V tejto štúdii ESB preukázal vynikajúcu inhibíciu peroxidácie lipidov (obrázok 2C). Uvádza sa, že fenolové zlúčeniny obsiahnuté v prírodných rastlinách sú spojené s aktivitou zachytávania radikálov [26]. Tiež Maresca a kol. [27] uviedli, že odstránenie ROS pomocou antioxidantov je účinné pri inhibícii biosyntézy melanínu. Nedávna štúdia uvádza, že etylacetátové a aglykónové frakcie listu Dendropanax morbifera môžu pôsobiť ako protektory kožných buniek a prírodné antioxidanty tým, že chránia bunky HaCaT pred oxidačným stresom [28]. Okrem toho liečba rovnakými frakciami preukázala lepší antimelanogénny účinok ako arbutín, ktorý sa použil ako pozitívna kontrola, proti nadmernej tvorbe melanínu indukovanej MSH v bunkách melanómu B16/F10 [28].

Je spojených niekoľko mechanizmovmelanogenézaa spoločným cieľom činidiel na bielenie kože je regulácia tyrozinázy, ktorá je dôležitým enzýmom v melanogenéze. Tyrozináza, enzým obsahujúci meď, katalyzuje dve reakcie v tejto dráhe: hydroxyláciu L-tyrozínu na L-DOPA a oxidáciu L-DOPA na DOPA chinón [6]. Pri vystavení veľkému množstvu UV alebo ROS sa zvyšuje aktivita tyrozinázy a zvyšuje sa aj syntéza melanínu. Preto výsledky merania inhibičného účinku tyrozinázy vo vzťahu k syntéze melanínu ukázali, že sa zistilo, že ESB má lepší inhibičný účinok na tyrozinázu pri použití L-tyrozínu ako pri použití L-DOPA ako substrátu (obrázok 3A,B). Nedávna štúdia uvádza koreláciu medzi TPC a inhibíciou tyrozinázy, pretože fenolové zlúčeniny majú chemickú štruktúru podobnú štruktúre L-tyrozínu, substrátu tyrozinázy. Podľa Choi et al. [29] bolo pozorované, že účinnosť zachytávania voľných radikálov a inhibičného účinku tyrozinázy sa zvyšovali úmerne s časom fermentácie Cheonggukjangu, čo bolo spôsobené množstvom TPC, ktoré sa s časom fermentácie zvyšuje. Im & Lee [30] pozorovali, že etylacetátová frakcia 75 percentného etanolového extraktu z Taraxacum core num mala bohatú TPC a antioxidačnú aktivitu a inhibičný účinok tyrozinázy bol lepší ako u iných frakcií (hexán, chloroform, butanol a vodná).

Tyrozináza, jeden z glykoproteínov, je glykozylovaná, keď sa polypeptidové reťazce translokujú do endoplazmatického retikula. Na tomto procese sa podieľajú rôzne enzýmy a medzi nimi inhibícia -glukozidázy môže inhibovať skladanie tyrozinázy za vzniku neaktívnej štruktúry bez medi. Výsledkom je, že tyrozináza nie je schopná transportu do melanozómu a inhibuje produkciu melanínu. Prítomný polyfenol v rastlinách je schopný nielen znižovať oxidačný stres, ale väzbou na proteíny inhibuje aj enzýmy hydrolyzujúce uhľohydráty, ako je -glukozidáza [31]. Predchádzajúca štúdia naznačila, že bunky melanómu B16/F10 v prítomnosti inhibítorov glykozylácie vedú k zníženiu melanogenézy znížením celkového obsahu tyrozinázy [32]. A Choi a spol. [33] uviedli, že deoxynojirimycín, jeden z inhibítorov -glukozidázy, blokoval glykozyláciu tyrozinázy a inhiboval migráciu tyrozinázy do melanozómov. Ando a spol. [34] ukázali, že je možné inhibovať syntézu melanínu v melanómových bunkách riadením glykozylácie tyrozinázy inhibítormi -glukozidázy, ako je glutatión, feritín a geldanamycín. Kim a spol. [35] uviedli dobré korelácie pre včelí peľ ako prirodzenýantioxidantmedzi TPC a inhibičným účinkom tyrozinázy ({{0}}.973,p < 0.05)="" a="" tiež="" tpc="" poskytlo="" pozitívnu="" koreláciu="" s="" aktivitou="" zachytávania="" radikálov="" dpph="" (0,897,="" p="">< 0,05).="" a="" výsledky="" naznačujú,="" že="" polyfenoly="" ako="" prírodné="" antioxidanty="" by="" mohli="" byť="" potenciálne="" účinné="" pri="" bielení="" pokožky="" na="" základe="" ich="" vynikajúcej="" antioxidačnej="" aktivity.="" v="" našej="" štúdii="" sa="" ukázalo,="" že="" antioxidačný="" účinok="" esbin="" na="" proces="" inhibície="" účinku="" tyrozinázy="" vysoko="" koreluje="" prostredníctvom="" inhibície="" oxidácie="" l-dopa="" na="" dopa="" chinón="" a="" glykozylácie="" tyrozinázy="" (tabuľka="" 1).="" z="" tohto="" dôvodu="" antioxidant="" účinok="" esb="" má="" vplyv="" na="" účinok="" bielenia="" pokožky="" ovplyvnením="">melanogenéza- sprostredkované enzýmy.

prírodný antioxidant: cistanche tubulosa

Signálna dráha PKA je hlavným procesom zapojeným do melanogenézy a je aktivovaná pomocou IBMMX, čo je činidlo zvyšujúce cAMP. Signálna dráha PKA môže regulovať transkripčné faktory, ako je MITF a proteín viažuci prvok reagujúci na cAMP, ktoré sa podieľajú na expresiimelanogenézaregulátory ako tyrozináza, TRP-1 a TRP-2. V dôsledku toho liečba IBMX zvyšuje expresiu MITF a rodiny génov tyrozinázy (tyrozináza a TRP-1) prostredníctvom aktivácie cAMP [7]. Park a kol. [36] ukázali, že množstvo syntézy melanínu z etanolového extraktu PapenfusiellaCuomo (65,17 ± 13,40 percenta) pri koncentrácii 40 µg/ml bolo podobné kyseline kojovej (72,30 ± 3,92 percenta) ako pozitívnej kontrole a uviedli, že vykazuje potenciál ako prírodný bieliaci materiál. V tejto štúdii ESB preukázal účinný inhibičný účinok na syntézu melanínu podobný účinku pozitívnej kontroly pri nízkych koncentráciách (obrázok 4). Potom sa na vyhodnotenie podrobného antimelanogénneho účinku ESB uskutočnila analýza westernovým prenosom na proteíne sprostredkovanom melanogenézou s použitím buniek melanómu B16/F10.

Akt, ktorý sa podieľa na rôznych mechanizmoch, hrá kľúčovú úlohu vo viacerých bunkových procesoch, ako je apoptóza, glukóza a metabolizmus kože. Najmä zvýšenie cAMP liečbou IBMX znižuje fosforyláciu Akt a jej aktiváciu. Inaktivovaný Akt tiež indukuje aktiváciu GSK-3, čo znamená, že sa nedosiahne fosforylácia, to znamená, že hladina p-GSK-3 je znížená [7]. Podľa predchádzajúcej literatúry vzdušná časť Pueraria thunbergia znižuje MITF aktiváciou signálnej dráhy Akt/GSK-3 v bunkách melanómu B16/F10 [37]. Tiež Huang a kol. [38] ukázali, že [6]-škola podporuje expresiu p-Akt a inhibuje signalizáciu melanogenézy v bunkách melanómu B16/F10. Aktivovaný GSK-3 upreguluje rodinu génov tyrozinázy fosforyláciou Ser289 MITF, čím následne podporuje melanogenézu. MITF je hlavný transkripčný faktor, ktorý sa viaže na promótor génu tyrozinázy a následne zvyšuje expresiu enzýmov súvisiacich s proliferáciou melanocytov amelanogenéza[7]. Keď je expresia tyrozinázy podporovaná MITF, vedie to následne k zvýšeniu hladín TRP-1 a TRP-2 a výsledkom je, že tieto melanogénne enzýmy produkujú melanín [6]. Oxidačný stres spôsobený UV svetlom stimuluje pigmentáciu melanínu v pokožke. Preto je vychytávacia aktivita radikálov alebo ROS účinná na potlačenie produkcie melanínu a polyfenoly s antioxidačnou aktivitou môžu mať vynikajúce bieliace účinky [38]. Choi a kol. [39] ukázali, že stonky kórejského bambusu (henosis odroda Phyllostachys nigra) znížili reguláciu MITF sprostredkovaného PKA/CREB prostredníctvom vychytávania radikálov ABTS/DPPH. A 70-percentný etanolový extrakt Nelumbo nucifera G. Leaf inhiboval expresiu MITF, tyrozinázy a TRP s antioxidačnými aktivitami, ako je schopnosť darcovstva elektrónov a inhibícia xantín oxidázy [40]. V tomto experimente sa ukázalo, že liečba ESB znížila expresiu MITF a tyrozinázovej génovej rodiny (tyrozináza a TRP-1), ktoré podporujú oxidáciu DHICA na DHI v dráhe melanogenézy (obrázok 5). Na základe týchto výsledkov sa ukázalo, že ESB znižuje melanogenézu sprostredkovanú IBMX na základe svojej vynikajúcejantioxidantúčinky.

Na základe predchádzajúcej literatúry boli identifikované hlavné fenolové zlúčeniny v ESB, že1,3-O-di-kafeoylglycerol (obrázok 6B), tricín (obrázok 6C) a 9-HODE (obrázok 6D) [16 ,19,20]. Medzi nimi 9-HODE, ktorá je najrozšírenejšou zlúčeninou v ESB, je jedným z metabolitov kyseliny linolovej a vykazuje bieliaci účinok na podráždenú pokožku inhibíciou tyrozinázy [41]. Na rozdiel od iných alifatických zlúčenín sa uvádza, že 9-HODE je stabilný vo všetkých oxidačných experimentoch a má bieliaci účinok na poškodenie ROS [41]. Medzitým tricín (5,7-dihydroxy- 2-(4-hydroxy-3,5-di-metoxyfenyl)-4H-chromen{{24 }}one) je už dlho uznávaný pre svoje priaznivé účinky na zdravie, ako sú antioxidačné, antivírusové a protinádorové/protirakovinové aktivity [42–44]. Mu a kol. [45] uviedli, že tricín vykazoval lepší inhibičný účinok na aktivitu tyrozinázy v porovnaní s arbutínom ako pozitívnou kontrolou. Navyše Meng a kol. [46] uviedli, že tricín izolovaný z metanolového extraktu mladého zeleného jačmeňa (Hordeum vulgare L.) inhiboval biosyntézu melanínu a aktivitu tyrozinázy v bunkách melanómu B16/F10 prostredníctvom hydroxylovej skupiny v polohe C-4' a metoxy skupín v Polohy C-3',5' tricínovej kostry. Fenylpropanoidy ako 1-O-kafeoylglycerol, dikafeoylglyceridy a 1,{37}}-Dikafeoylglycerol sú organické zlúčeniny, ktoré si rastliny syntetizujú z fenylalanínu a tyrozínu. Fenylpropanoid a ich glykozylované formy boli hlásené ako silné antioxidanty buď tým, že priamo vychytávajú ROS, alebo pôsobia ako lapače peroxylových radikálov, ktoré prerušujú reťazec [47].

Kyselina p-kumarová, ktorá má chemickú štruktúru podobnú L-tyrozínu, súťaží s L-tyrozínom o aktívne miesta na tyrozináze [48]. Je známy ako silný inhibítor tyrozinázy a uvádza sa, že jeho antimelanogenézny účinok je silnejší ako štrukturálne podobné zlúčeniny, ako je kyselina škoricová [48]. Okrem toho An a kol. [48] ​​uviedli, že kyselina p-kumarová, zložka Sasa quelpaertensisNakai, inhibovala aktivitu tyrozinázy použitím L-DOPA ako substrátu a znížila produkciu melanínu v bunkách melanómu B16/F10. Preto sa ESB môže považovať za látku s vynikajúcim bieliacim účinkom prostredníctvom kyseliny p-kumarovej. Okrem toho MS spektrá 1-O-kafeoylglycerolu a 1-3-O-dikafeoylglycerolu vykazovali podobné fragmentačné vzory pri m/z 179, 161 a 135 a tieto fragmenty boli zaznamenané ako zvyšky kyseliny kávovej. Majú UV spektrum podobné spektru derivátov kyseliny kávovej s λmax pri približne 326 nm, a preto sa považujú za deriváty kyseliny kávovej [48]. Uvádza sa, že kyselina kávová, derivát rôznych zlúčenín, je silným antioxidantom in vitro/in vivo a znižuje aktivitu tyrozinázy amelanogenézav bunkách melanómu B16/F10. V dôsledku toho možno antimelanogénny účinok ESB považovať za spôsobenýantioxidantya látky na bielenie pokožky, ako sú alifatické a fenolové zlúčeniny.

účinky cistanche: antioxidačné

5. Závery

Vyhodnotiť možnosť ako prostriedok na bielenie pokožkyCirok dvojfarebný, antioxidačné a anti-melanogénne účinky ESB na melanogenézu indukovanú IBMX sa hodnotili v melanómových bunkách B16/F10. ESB vykázala významnéantioxidantaktivity v ABTS/DPPH radikálovej aktivite a inhibičný účinok MDA. ESB zabránila prvému krokumelanogenézainhibíciou -glukozidázy a tyrozinázy použitím L-tyrozínu a L-DOPA ako substrátov. Antimelanogénne účinky ESB na indukované IBMMXmelanogenézaboli hodnotené v bunkách melanómu B16/F10 a výsledky ukázali, že ESB inhibuje melanogenézu indukovanú IBMX v bunkách melanómu B16/F10. Akumulácia melanínu bola inhibovaná downreguláciou expresie MITF a rodiny génov tyrozinázy (tyrozináza a TRP-1) v melanogenéze indukovanej IBMX. Hlavné zlúčeniny ESB sa analyzovali ako 1,{8}}O-di-kafeoylglycerol, tricín a 9-HODE. V dôsledku toho sa ESB ukázalo in vitroantioxidantaktivitu a antimelanogénny účinok v bunkách melanómu B16/F10, a preto by sa mohol použiť ako činidlo na bielenie kože na kozmetickom trhu.

antioxidačnécistanche tablety