Antiproliferačné účinky cistanches salsy na progresiu benígnej hyperplázie prostaty Ⅰ
Oct 18, 2022
Abstrakt:Cistanche Tubulosasa používa v tradičnej medicíne na liečbunedostatok obličiek, neurasténia, choroby sexuálnej dysfunkcie, abenígna hyperplázia prostaty(BPH). Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať mechanizmus, ktorým extrakt z C. tubulosa (CSE) vyvoláva anantiproliferatívny účinok na tkanivo prostatypotkanov indukovaných BPH. Účinky CSE na BPH sa hodnotili z hľadiska hmotnosti prostaty, produkcie sérového dihydrotestosterónu (DHT) a expresie mRNA 5o-reduktázy typu 1 a typu 2 v tkanive prostaty potkanov indukovaných BPH. Okrem toho sa vykonalo farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E) na histologické vyšetrenie morfológie prostaty a hladiny expresie proteínov v tkanive prostaty sa skúmali analýzou Western blot. Liečba CSE znížila hmotnosť prostaty, koncentráciu DHT v sére a expresiu mRNA 5o-reduktázy typu 1 a typu 2 v tkanive prostaty potkanov indukovaných BPH. Okrem toho liečba CSE potlačila proliferáciu buniek reguláciou hladín expresie proteínov súvisiacich so zápalom (indukovateľná syntáza oxidu dusnatého a cyklooxygenáza 2) a proteínov spojených s apoptózou (proteíny rodiny kaspázy-3 a Bcl{15}}). CSE môže byť potenciálnym terapeutickým kandidátom na BPH vďaka svojej schopnosti regulovať expresiu zápalových proteínov a proteínov súvisiacich s apoptózou.
Kľúčové slová:benígna hyperplázia prostaty, Cistanche Tubulosa, dihydrotestosterón, zápal, apoptóza, Bcl-2.
Úvod
Cistanche Tubulosaje parazitická rastlina pôvodom zo severozápadu Číny. Jeho stonka je dôležitým tradičným orientálnym liekom, ktorý sa používa na liečbunedostatok obličiekaneurasténia(Deng et al.2004). C. tubulosa sa tiež uvádza ako účinná pri liečbechoroby sexuálnej dysfunkcie, ako naprimpotenciaabenígna hyperplázia prostaty(BPH) v kórejskej lekárskej knihe s názvom DonguiBogam. Fenyletanoidové glykozidy (PhG) sú hlavnými aktívnymi zložkami tejto byliny (Jimenez a Riguera 1994). Preukázalo sa, že mnohé PhG majú široké spektrum biologických vlastností, vrátane antioxidačných a protinádorových účinkov. Akteozid, PhG z C. tubulosa, inhibuje apoptózu indukovanú 1-metyl-4-fenylpyridíniovým iónom (MMP*) v neurónoch cerebelárnych granúl (Pu et al. 2003). Hoci sa uskutočnili štúdie o fyziologických funkciách C. tubulosa, molekulárny mechanizmus (mechanizmy), ktorý je základom účinkov C. tubulosa na BPH, sa neskúmal.
BPH je charakterizovaná zväčšením prostaty v dôsledku nerakovinového rastu v žľaze (Andriole et al. 2004). Nárast prevalencie a incidencie BPH sa vyskytuje v kontexte starnutia populácie. Do roku 2030 bude mať 20 percent populácie USA 65 rokov alebo viac, čo je číslo, ktoré bude zahŕňať viac ako 20 miliónov mužov (Parsons 2010). Hoci BPH je bežnou poruchou u starších mužov, etiológia a patológia BPH nie sú úplne definované a v súčasnosti neexistuje dokonalá liečba BPH (Djavan et al.2010).
Možnosti liečby BPH zahŕňajú farmakologické a chirurgické stratégie.
V posledných rokoch klesol počet chirurgických zákrokov u pacientov s BPH v prospech farmakologickej liečby (Emberton et al. 2011). Vzhľadom na povahu BPH si farmakologická liečba vyžaduje dlhodobé a nepretržité užívanie liekov. Preto je veľmi dôležitá dlhodobá a nepretržitá znášanlivosť lieku. Na liečbu BPH sa používajú rôzne druhy farmakologických činidiel, ako sú inhibítory 5a-reduktázy (finasterid a du-tasterid) a antagonisty a-adrenoceptorov (alfuzosín, terazosín, doxazosín, tamsulozín) (Lepor 2011;
Untergasser et al.2005). Hlavnými farmakologickými látkami na liečbu BPH sú inhibítory 5a-reduktázy, o ktorých je známe, že regulujú hladiny 5o-dihydrotestosterónu, a o-adrenergné blokátory (Tiwari et al. 2005). Hoci sa tieto farmakologické látky považujú za látky, ktoré významne inhibujú progresiu BPH, mnohé štúdie uvádzajú ich nežiaduce vedľajšie účinky (Patel a Chapple 2006). Napríklad sa uvádza, že finasterid spôsobuje rôzne vedľajšie účinky, vrátane závratov, zhoršeného rastu svalov a ťažká myopatia, vzhľadom na jej štrukturálnu podobnosť so steroidnými hormónmi (McConnell a kol. 2003; Uygur a kol. 1998). Pretože tieto farmakologické látky vykazujú nežiaduce vedľajšie účinky, nájdenie bylinných liekov, ktoré účinne liečia BPH, má značnú medicínsku hodnotu.
Na vyhodnotenie účinku C. tubulosa na BPH sme demonštrovali, že extrakt z C. tubulosa (CSE) by mohol modulovať nerovnováhu medzi rastom prostatických buniek a apoptózou v modeloch potkanov BPH vyvolaných testosterónom.
Materiály a metódy Materiály a činidlá
C. tubulosa bola zakúpená od Omniherb Co.Ltd. (Daegu, Kórejská republika) a finasterid sa získal od spoločnosti Merck and Co. Inc. (New Jersey, USA). Testosterón, fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), Triton X-100, propídiumjodid (PI), Nonidet P-40(NP-40) a kokteil inhibítorov proteínov (PIC) boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Oligonukleotidové priméry GAPDH a 5o-reduktáza typu 1 a typu 2 boli zakúpené od spoločnosti Bioneer (Deajeon, Kórea) a SYBR Primix Ex Taq od spoločnosti Takara (Shuzo, Shiga, Japonsko). Protilátky proti iNOS(M{{9} }), COX-2(C-20),poly(ADP-ribóza)polymeráza-1(PARP-1,(D-1),kaspáza{{ 16}} (H-277), Bcl-2(C-2), Bcl-xL(H-5),Bax(B-9) a anti- -aktín (ACTBD11B7) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornia, USA). Protilátka pre anti-PCNA bola zakúpená od BD Biosciences, Pharmingen (San Diego, Kalifornia, USA). Príprava C extrakt z tubulózy (CSE)
Byliny C. tubulosa boli zakúpené od Omniherb Co.Ltd. (Yeongcheon, Kyungpook, Kórejská republika). Obsahovali vlhkosť<13% by="" weight="" and="" were="" air-dried.="" afterward,="" herbs="" underwent="" extraction="" with="" 50%(v/v)="" ethanol-water="" at="" 60="" ℃for="" 8="" h.="" the="" extract="" obtained="" was="" filtered="" through="" 20="" μm="" cartridge="" paper,="" and="" ethanol="" was="" removed="" by="" vacuum="" rotary="" evaporation="" (eyela,="" japan).="" the="" concentrate="" was="" subsequently="" freeze-dried,="" and="" the="" yield="" was="" found="" to="" be="" 12%="" w/w.="" the="" experiment="" was="" performed="" by="" dissolving="" the="" dry="" extract="" in="" distilled="" water,="" and="" the="" rest="" of="" extract="" was="" stored="" at="" -20="" ℃.="" the="" identities="" of="" the="" active="" components="" of="" the="" extract,as="" determined="" by="" hplc,="" were="" reported="" previously(jiang="" and="" tu="">
Zvieratá
Desaťtýždňové samce potkanov Sprague-Dawley (200 ± 20 g) boli zakúpené od Daehan Biolink (Daejeon, Kórejská republika). Zvieratá boli chované v podmienkach, ktoré boli v súlade so smernicami pre starostlivosť o laboratórne zvieratá a ich používanie, ktoré prijal a vyhlásil Inštitucionálny výbor pre starostlivosť o zvieratá Univerzity Sangji (reg. č.2014-09). Potkany sa aklimatizovali na laboratórne podmienky počas 2 týždňov pred začatím experimentu. Bol im poskytnutý voľný prístup k potrave a vode počas 4 týždňov a počas experimentu boli udržiavané v cykle 12 hodín svetlo/12 hodín tma pri konštantnej teplote 22 ± 2 stupne a relatívnej vlhkosti 55 ± 9 percent. Potkany boli náhodne rozdelené do jednej zo 4 skupín (n=6): kontrolná skupina (Con, normálna prostata s vehikulovým roztokom: fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) 200 μl, po）; skupina indukovaná BPH (BPH）), Skupina indukovaná BPH liečená finasteridom (5 mg/kg/deň, po, (Fina)); skupina indukovaná BPH liečená CSE (200 mg/kg/deň; po). Potkany v kontrolnej skupine boli rozrezané a potom zašité bez odstránenia semenníkov po anestézii zoletilom@ 50 (20 mg/kg, ip); potkany v ostatných skupinách boli kastrované. Po 3 dňoch zotavenia sa skupinám indukovaným BPH injikoval testosterón propionát (10 mg/kg /deň,ip, rozpustené v kukuričnom oleji) samostatne alebo spolu s CSE alebo finasteridom denne počas 4 týždňov. Dvadsaťštyri hodín po poslednom podaní boli všetky potkany usmrtené po anestézii zoletilom® 50 (20 mg/kg,ip). Vzorky krvi sa odobrali z kaudálnej dutej žily a sérum sa oddelilo centrifugáciou a skladovalo sa pri -80 stupňoch. Odstránila sa celá prostata a odvážila sa (Guo a kol.2004).
Pomer hmotnosti prostaty k telesnej hmotnosti
Prostatické tkanivá boli vyrezané, opláchnuté a okamžite zvážené. Pomer hmotnosti prostaty k telesnej hmotnosti (pomer PW/BW) sa vypočítal tak, ako je opísané nižšie.
pomer PW/BW
= (každá hmotnosť prostaty zvieraťa z experimentálnej skupiny/každá telesná hmotnosť zvieraťa z experimentálnej skupiny) x 100 Inhibícia rastu hmotnosti prostaty
Po dokončení štúdie boli prostaty odstránené a zvážené. Percento inhibície rastu sa vypočítalo nasledovne:100-[(liečená skupina-kontrolná skupina)(BPH skupina-kontrolná skupina)×100]. Analýza sérových koncentrácií dihydrotestosterónu (DHT).
Sérové koncentrácie DHT boli stanovené komerčnou ELISA (ALPCO Diagnostics, Salem, New Hampshire, USA). Testy boli uskutočnené podľa pokynov výrobcu.
Histologická analýza
Tkanivo prostaty v každej skupine bolo fixované v 4-percentnom formalínovom roztoku, zaliate do parafínu a potom narezané na 4 pm rezy. Rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E) na histologické vyšetrenie. Snímky boli získané pomocou mikroskopu SZX10 (Olympus, Tokio, Japonsko). Histologickú analýzu a hrúbku epitelového tkaniva z prostaty (TETP) meral profesionálny histológ zo Soul Medical Science Institute (Soul, Kórea) pomocou Softvér Leica Application Suite (LAS, ver. 3.3.0) na objektívne hodnotenie pri histologickej analýze. Kvantitatívna analýza polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase
Prostatické tkanivo z každého zvieraťa sa homogenizovalo a celková RNA sa izolovala s použitím Easy-Blue@ Reagent (Intron Biotech-nology Inc., Gyeongi-do, Kórejská republika) podľa inštrukcií výrobcu. Celková RNA sa kvantifikovala pomocou mikroobjemového spektrofotometrického systému Epoch@ (BioTek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, USA). Celková RNA z pečene a viscerálneho tukového tkaniva bola konvertovaná na cDNA pomocou vysokokapacitnej cDNA reverznej transkripčnej súpravy (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). ). Oligonukleotidové priméry pre 5o-reduktázu typu 1, navrhnuté z potkana, boli GGAAGG TTT CAT GGCCTT CG (dopredu) a TCG AGG GCA GCT GTA TG (reverzný), 5o-reduktázové priméry typu 2, navrhnuté z potkana, boli ATG GGG ACC CTG ATC CTG TG (dopredu) a CGA CAC CACAAA GGA AGG CA (reverzný) a priméry GAPDH, použité ako domáci gén a navrhnuté z potkana, boli TGA TTC TAC CCA CGG CAA GT (dopredu) a AGC ATC ACC CCA TTT GAT GT (reverzná). Reverzná transkripcia sa uskutočnila pomocou termocykléra (Gene Amp⑧ PCR system 9700, Applied Biosystems) a výsledky sa vyjadrili ako pomer optimálnej hustoty ku GAPDH. Western blot analýza
Tkanivo prostatyz každého zvieraťa sa homogenizovalo v komerčnom lyzovacom pufri PRO-PREP⑧ (Intron Biotechnology Inc.) a inkubovalo sa 25 minút na ľade, aby sa vyvolala lýza buniek. Tkanivové extrakty sa 20 minút centrifugovali pri 16 000g (4 stupne) a supernatant sa preniesol do čistej skúmavky. Koncentrácia proteínu bola odrazená od typických histologických zmien, vrátane zhrubnutého glandulárneho epitelu, vakuolizovanej cytoplazmy smerujúcej k glandulárnemu lúmenu a zmenšenej glandulárnej luminálnej oblasti (obr. 3A). Podávanie CSE počas 4 týždňov potlačilo tieto typické hyperplastické vzorce, ktoré predstavujú histologickú zmenu z normálneho prostatického tkaniva na hyperpláziu prostaty. Stručne povedané, histologické vyšetrenie skupín liečených finasteridom a CSE ukázalo jasný trend zlepšenia hyperplázie prostaty. Okrem toho, ako je znázornené na obr. 3B, analýza TETP ukázala, že najviac zhrubnuté epiteliálne tkanivo bolo pozorované u potkanov indukovaných BPH v porovnaní s akýmikoľvek inými študijnými skupinami a skupiny liečené finasteridom a CSE vykazovali významné zníženie hrúbky prostaty .
Na vyhodnotenie proliferácie epiteliálnych buniek prostaty sme skúmali proteínovú expresiu PCNA v tkanive prostaty potkanov indukovaných BPH. Ako je znázornené na obr. 3C, analýza westernovým prenosom indikovala zvýšenie expresie proteínu PCNA v skupine indukovanej BPH v porovnaní s hladinami PCNA v kontrolnej skupine. V porovnaní so skupinou indukovanou BPH však skupiny liečené finasteridom a CSE vykazovali zníženú expresiu proteínu PCNA, čo naznačuje ich antiproliferačné účinky pri BPH.
Obr. 2. Účinok podávania extraktu z Cistanche Tubulosa (CSE) na produkciu sérového dilhydrotestosterónu (DHT) a hladiny mRNA 5a-reduktázy typu 1 a typu 2 v tkanivách prostaty u potkaních modelov vyvolaných benígnou hyperpláziou prostaty (BPH). (A) Sérové koncentrácie DHT boli stanovené pomocou testu ELISA. (B) Expresia mRNA 5a-reduktázy typu 1 a typu 2 v tkanive prostaty sa analyzovala kvantitatívnou PCR v reálnom čase. Uvedené údaje predstavujú priemer ± SEM 6 potkanov na skupinu<><0.001 vs.con=""><0.001 vs.bph="">
