Anti-tyrozinázové vlastnosti rôznych druhov kurkumy a izolácia aktívnych zlúčenín z Curcuma Amada

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Poľnohospodárska fakulta Univerzity Ryukyus, Okinawa, Japonsko

2 Katedra farmakológie, Fakulta veterinárnych vied, Bangladéšska poľnohospodárska univerzita, Mymensingh, Bangladéš

Pre viac informácií:Scotty.Wang@wecistanche.com

Abstraktné

Kurkuma sa tradične používa ako pleťová kozmetika pri niektorých náboženských a kultúrnych príležitostiach na indickom subkontinente. V tejto štúdii sme porovnávali inhibičné vlastnosti tyrozinázy štyroch druhov Curcuma, menovite C. xanthorrhiza, C. aromatické, C. amada a C. zedoaria. Biotestom riadená izolácia a čistenie inhibítorov tyrozinázy pomocou silikagélovej kolóny a vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Štrukturálna identifikácia zlúčenín sa uskutočnila pomocou1H NMR, 13C

NMR a kvapalinová chromatografia-tandemová hmotnostná spektrometria. C. amada vykazoval najvyššiu inhibičnú aktivitu tyrozinázy s IC50 53,4 ug/ml. Preto bol vybraný na izoláciu a čistenie inhibítorov tyrozinázy. Purifikovanými zlúčeninami boli zederón (1), furanodiénón (2), 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-metoxyfenyl){ {13}}(4-hydroxyfenyl)heptány (3), 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyfenyl)-7-({{22 }}hydroxy-3-metoxyfenyl)heptány (4) a 1,5-epoxy3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-metoxyfenyl) -7-(4-hydroxy-3-metoxyfenyl)heptány (5). Hodnoty IC50 pre hubuanti-tyrozinázaaktivita zlúčenín 1, 2, 3, 4 a 5 bola 108,2, 89,2, 92,3, 21,7 a 41,3 uM. Tieto zlúčeniny tiež inhibovali intracelulárnu aktivitu tyrozinázy, čím sa znížila syntéza melanínu v bunkách melanómu B16F10. Zlúčenina 4 sa ukázala výrazne silnejšiaanti-tyrozinázaaktivitu ako arbutín (liek na pozitívnu kontrolu). Nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel v inhibičnom účinku tyrozinázy medzi zlúčeninou 5 a arbutínom. Naše zistenia silne naznačujú, že C. Amanda je sľubným zdrojom prírodných inhibítorov tyrozinázy na prevenciu melanogenézy a mohla by sa použiť ako bieliaca kozmetika.

Kľúčové slovo: Curcuma amada ● Aktívne zlúčeniny ● NMR ● Anti-tyrozináza ● Antimelanogénne

Clízať do Cistanche pre anti-tyrozinázu

Úvod

Melanín je čierny pigment vo vlasoch a pokožke a je nevyhnutný na ochranu pokožky pred UV žiarením. Pigment je produkovaný bunkami melanocytov prítomnými v bazálnej vrstve dermis prostredníctvom fyziologického procesu nazývaného melanogenéza. Abnormálna produkcia melanínu však spôsobuje dermatologické poruchy, ako sú pehy, melazma, lentigíny, starecké škvrny, efelidy a pozápalová hyperpigmentácia [1]. V potravinárskom priemysle vedie hyperpigmentácia ovocia a zeleniny k výrazným stratám nutričnej kvality a trhovej hodnoty [2]. Melanogenézu možno kontrolovať inhibíciou aktivity tyrozinázy, enzýmu obmedzujúceho rýchlosť syntézy melanínu u cicavcov, rastlín, mikroorganizmov a húb [3]. Preto inhibícia aktivity tyrozinázy zabraňuje hyperpigmentácii a vedie k bieleniu kože. Kontroluje aj kvalitu zeleniny a ovocia reguláciou nežiaduceho hnednutia zeleniny a potravín. Väčšina činidiel na zosvetlenie pokožky, ako je hydrochinón, kyselina azelaová, kyselina kojová a arbutín, sú silnými inhibítormi tyrozinázy. Majú však rôzne nežiaduce účinky, ako je cytotoxicita, ochronóza, vitiligo, podráždenie, olupovanie kože a začervenanie [4]. Okrem toho kyselina kojová a -arbutín vykazujú slabú stabilitu prípravku a schopnosť penetrácie pokožkou a nízku účinnosť in vivo [5]. Niektoré organické a anorganické soli ortuti majú antimelanogénne účinky a používajú sa v prípravkoch na bielenie pokožky. Avšak prostredníctvom kožnej absorpcie môžu zlúčeniny ortuti spôsobiť toxické účinky, ako je zmena farby kože, poškodenie obličiek, alergická reakcia a zjazvenie [6]. Preto je potrebný výskum menej toxických a účinnejších inhibítorov tyrozinázy. Kurkuma (čeľaď: Zingiberaceae; rod: Curcuma), tradičná liečivá rastlina, ktorá rastie prevažne v tropických a subtropických oblastiach Ázie a Afriky, má široké spektrum farmakologických funkcií. Tradične sa používa v predmanželských rituáloch už tisíce rokov na indickom subkontinente ako prostriedok na zosvetlenie pokožky. Predpokladá sa, že kurkuma zlepšuje pleť tým, že znižuje rast ochlpenia na tvári, akné a starnutie pokožky [7, 8]. Preto sú na trhu komerčne dostupné produkty starostlivosti o pleť doplnené o kurkumu [9]. Bolo identifikovaných viac ako 70 druhov/variet kurkumy s rôznymi chemickými a farmakologickými vlastnosťami. Existuje však nedostatok vedeckých informácií o antimelanogénnych vlastnostiach rôznych druhov kurkumy a potenciálnych aktívnych zložkách prítomných v kurkume. Kurkuminoidy sú hlavné aktívne zlúčeniny zodpovedné za väčšinu biologických aktivít kurkumy. Kurkuminoidy majú potenciál v kozmeceutikách ako anantioxidant, protizápalový,a činidlo na zosvetlenie pokožky [7, 8]. V predchádzajúcej štúdii sme však zistili významné rozdiely v obsahu kurkuminoidov v kurkume a niektoré druhy (C. amada, C. zedoaria) dokonca kurkumín neobsahovali [10]. Hlásili sme aj antimykotikum,antioxidanta vazodilatačné aktivity rôznych druhov a odrôd kurkumy [10–13]. Preto sa táto štúdia zamerala na vyhodnotenie účinkov rôznych druhov kurkumy, konkrétne C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada a C. zedoaria, na enzým tyrozinázu a na identifikáciu špecifických chemických zlúčenín zodpovedných zaanti-tyrozinázačinnosť. Hodnotili sme aj inhibičnú aktivitu tyrozinázy a antimelanogénne účinky purifikovaných aktívnych zlúčenín na syntézu melanínu v bunkách melanómu B16F10.

Výsledky a diskusia

Spomedzi štyroch rôznych druhov kurkumy vykazoval MeOH extrakt C. amada maximálny inhibičný účinok na hubovú tyrozinázu s hodnotou IC50 53,4 ± 2,7, po ktorom nasledovali C. xanthorrhiza, C. aromatické a C. zedoaria (obr. 1a). Kurkumín je hlavnou aktívnou zložkou kurkumy (Curcuma longa) a má široké spektrum biologických aktivít, vrátane protirakovinových, protizápalových, antibakteriálnych, protiplesňových a antioxidačných aktivít. Vykázala 75-násobne silnejšiu antityrozinázovú aktivitu ako arbutín a kyselina kojová [14]. V predchádzajúcej štúdii sme však uviedli, že existujú významné rozdiely v obsahu kurkumínu v rôznych druhoch kurkumy [10].

Kurkumín bol prítomný v C. xanthorrhiza a C. aromatický, ale chýbal v C. zedoaria a C. amada [10]. Zaujímavými zisteniami tejto štúdie je, že bez kurkumínu vykazovala C. amada silnú inhibičnú aktivitu tyrozinázy. Tento výsledok naznačuje, že niektoré aktívne zlúčeniny C. amada musia byť pripisované jeho silnému antityrozinázovému účinku. Antityrozinázová aktivita C. xanthorrhiza a C. aromatica môže byť spôsobená ich obsahom kurkumínu. Nemohli sme však vylúčiť možnosť prítomnosti iných zlúčenín. MeOH extrakt z C. amada sa frakcionoval vodou, n-hexánom a EtOAc. Spomedzi týchto troch frakcií vykazoval EtOAc výrazne silnejší inhibičný účinok ako voda a n-hexán (obr. 1b). Preto sa EtOAc časť odobrala na ďalšiu frakcionáciu. Anti-tyrozinázové aktivity šiestich frakcií [n-hexán:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) a 0:100 (F6)] z EtOAc časti C. amada sa porovnávali. Spomedzi týchto šiestich frakcií vykazovali F6 a F3 významne vyššiu anti-tyrozinázovú aktivitu ako ostatné (obr. 1c). Potom sa identifikovali chemické štruktúry piatich zlúčenín z frakcií F3 a F6 podľa ich1H NMR a13C NMR spektier. Špičkové údaje boli nasledovné:

zlúčenina 1:

Bezfarebný kryštál v tvare ihly; UV Amax: nm 234, 285. ESI-MS (plus) m/z: 247,3 [M plus H] plus, 229,4 [M plus H-H20] plus. 1H-NMR (CD3OD): 5 7,22 (1H, s, H-12), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{2{86}}}}) , 3,99 (1H, s, H-5), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2,26 (1H, m, H{{46} }}a), 2,2{92}} (1H, m, H{{5{104}}}}b), 2,09 (3H, s, H{54}}), 1,57 (3H, s, H-15), 1,32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1,28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD3OD): 5 194,2 (C-6) 160,2 (C-8), 139,7 (C12), 132,8 (C{84}}), 132,0 (C{87}} ), 124,3(C-11), 123,0(C-7), 67,8(C-5), 65,2(C-4), 42,5(C-9 ), 39,0 (C-3), 25,4(C-2), 15,7 (C-15), 15,4 (C-14), 10,7 (C-13 ) (Doplnkové údaje). Z porovnania týchto údajov s údajmi uvedenými v literatúre [15, 16] bola látka identifikovaná ako zederón (obr. 2). Je to seskviterpén, ktorý bol predtým izolovaný z C. amada a C. zedoaria a bol hlásený pre svoje analgetické, protizápalové, protiplesňové a cytotoxické účinky [12, 17–20].

zlúčenina 2:

Bezfarebný olej; UV λmax: nm 243, 28 0. ESIMS (plus) m/z: 231.{83}} [M plus H] plus, 223,3 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 7,16 (1H, s, H-12), 5,83 (1H, s, H-5), 5,21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2,31 (1H, m, H-2a ), 2,2 0 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2,06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H{61}}), 1,89 (1H, m, H{65}}b), 1,25 (3H, s, H{69}}). 13C-NMR (CD3OD): 5 191,8 (C-6), 158,6 (C-8), 147,6 (C-4), 140,0 (C-12), 136,1 ( C-10), 133,3 (C-5), 132,0 (C-1), 124,6 (C-11), 123,1 (C-7), 42,4 ( C-9), 41,4 (C-3), 27,3 (C-2), 19,3 (C-14), 15,9 (C-2), 9,9 ( C-13) (doplnkové údaje). Z porovnania týchto údajov s údajmi uvedenými v literatúre [21] bola látka identifikovaná ako furanodienon (obr. 2). Bol izolovaný z Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex hák. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] a Curcuma wenyujin [23]. Je to furanozeskviterpenoid, ktorý vykazuje protiplesňové [12], protizápalové [19], protirakovinové [24], antibakteriálne a antioxidačné účinky [22].

zlúčenina 3:

Žltkastý olej; UV Amax: nm 275. ESIMS (plus) m/z: 383,3 [M plus Na] plus, 361,3 [M plus H] plus, 343,2 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2'', -6''), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,89 (1H, m, H-5), 3,85 ( 3H, s, 5'-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H-2a), 1,78 (1H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{72} }b), 1,53 (1 H, m, H -4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 156,3 (C-4''), 149,5 (C-5'), 146,4 (C-3'), 134,5 (C-4 ´), 134,44 (C-1´), 134,41 (C-1´´), 130,4 (C-2´´, -6´´), 116,1 (C{ {104}}'', -5''), 108,0 (C-2'), 102,8 (C-6'), 75,2 (C-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5´-OCH3), 41,1 (C-2), 39,5 (C-4), 39,2 (C-6) 31.8 (C-7) (doplnkové údaje). Na základe porovnania týchto údajov s údajmi uvedenými v literatúre [25] bola látka identifikovaná ako 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,{144}}dihydroxy{141} {145}} metoxyfenyl)-7-(4-hydroxyfenyl)heptány (obr. 2). Bol izolovaný z odnoží Zingiber officinale a boli študované ich antioxidačné vlastnosti [25].

Zlúčenina 4:

Viskózny sirup; UV Amax: nm 281. ESIMS (plus) m/z: 385,3 [M plus Na] plus, 363,3 [M plus H] plus, 345,2 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 6,75 (1H, d, J=2 Hz, H-2'), 6,68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}'), 6,64 (1 H, J=8 Hz, H-5''), 6,61 (1 H, J=2 Hz, H-2''), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6'), 6,49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6''), 3,80 (3H, s, 3'-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 2,{56}},47 (4H, m, H{59 }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1,65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 148,8 (C-3'), 146,1 (C-3''), 145,4 (C-4'), 144,2 (C-4 ´´), 135,24 (C-1´ alebo C-1´´), 135,22 (C-1´ alebo C-1´´), 121,8 (C{101) }}´), 120,6 (C-6´´), 116,5 (C-2´´), 116,3 (C-5´´), 116,1 (C-5´ ), 113,2 (C-2'), 70,94 (C-3 alebo C-5), 70,92 (C-3 alebo C-5), 56,4 (3 ´-OCH3), 44,9 (C-4), 40,8 (C-2, -6), 32,3 (C-1), 32,1 (C-7) (Doplnkové údaje). Z porovnania týchto údajov s údajmi uvedenými v literatúre [26, 27] bola látka identifikovaná ako olej 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyfenyl){{150 }} (4-hydroxy-3-metoxyfenyl)heptány (obr. 2). Bol izolovaný z odnoží Tacca chantrieri [26] a Curcumalonga L. [27]. Sú to diarylheptanoidy, ktoré vykazujú cytotoxické [26] a protinádorové [27] aktivity.

Zlúčenina 5:

Bezfarebný olej; UV Amax nm: 279. ESI-MS (plus) m/z: 413,3 [M plus Na] plus, 391,3 [M plus H] plus, 373,3 [M plus HH20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 6,76 (1H, s, H-2''), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{2{114}}}} ´´), 6,21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,53 (2H, s, H-2´, -6´´ 4,63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,83 (3H, s, 5'-OCH3) 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H-7), 1,84 (1H, m, H-2a), 1,79 (1H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 149,5 (C-5'), 148,8 (C-3''), 146,4 (C-3'), 145,4 (C-4 ´´), 135,3 (C-1´), 135,2 (C-1´´), 134,4 (C-4´), 121,9 (C-6´´), 116,1 (C-5´´), 113,4 (C-2´´), 108,0 (C-2´), 102,7 (C-6´), 75,2 (C{ {121}}), 72,5 (C-5), 65,6 (C-3), 56,6 (5'-OCH3), 56,3 (3''-OCH3), 41,2 (C{140} }), 39,4 (C-4), 39,3 (C-6), 32,2 (C-7) (doplnkové údaje). Na základe porovnania týchto údajov s údajmi uvedenými v literatúre [20] bola látka identifikovaná ako 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy{ {157}}metoxyfenyl)- 7-(4-hydroxy-3-metoxyfenyl)heptány (obr. 2) a neexistujú žiadne informácie o ich biologickej aktivite. Zlúčeniny 3, 4 a 5 sme prvýkrát izolovali z C. amada. Všetky zlúčeniny vykazovali inhibičnú aktivitu proti hubovej tyrozináze

Päť zlúčenín, konkrétne zederón, furanodién, 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-metoxyfenyl)- 7-( 4-hydroxyfenyl)heptány, 3,5-dihydroxy-1-(3,4-špinavý hydroxyfenyl)-7-(4-hydroxy-3- metoxyfenyl) heptány a 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-metoxyfenyl)- 7-(4- hydroxy-3-metoxyfenyl)heptány, boli izolované z frakcií F3 a F6. Izolované zlúčeniny vykazovali anti-tyrozinázovú aktivitu v závislosti od koncentrácie. Spomedzi piatich zlúčenín vykazovala zlúčenina 4 výrazne silnejšiu anti-tyrozinázovú aktivitu ako arbutín. Medzi zlúčeninou 5 a arbutínom neboli žiadne významné rozdiely v antityrozinázových účinkoch (obr. 3). Účinky izolovanej zlúčeniny na životaschopnosť buniek sa študovali na bunkách myšacieho melanómu B16F10. Bunky boli ošetrené 50, 100, 200 a 400 uM koncentráciami zlúčeniny počas 48 hodín. Izolované zlúčeniny nevykazovali cytotoxické účinky do 200 μM, avšak vo všetkých prípadoch bolo pozorovaných asi päťdesiat percent bunkovej smrti pri koncentrácii 400 μM (obr. 4). Na hodnotenie ich intracelulárnych antityrozinázových a antimelanogénnych účinkov sa teda použili koncentrácie až do 200 μM.

Na stanovenie antimelanogénnych a antityrozinázových aktivít izolovaných zlúčenín sa hodnotili ich účinky na obsah melanínu a aktivitu tyrozinázy v bunkách melanómu B16F10. Ako je uvedené v tabuľke 1, naše izolované zlúčeniny v závislosti od dávky inhibovali intracelulárny obsah melanínu a aktivitu tyrozinázy. Zlúčenina 4 bola významne silnejšia ako pozitívna kontrolná látka arbutín v inhibičných účinkoch na melanín aj tyrozinázu. Nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel medzi zlúčeninou 5 a arbutínom. Keďže bunková tyrozináza zvyšuje produkciu melanínu, zníženie aktivity tyrozinázy je účinnou stratégiou pre vývoj antimelanogénnych činidiel. Na tento účel sme hodnotili inhibičné vlastnosti aktivity intracelulárnej tyrozinázy a melanogenézy v bunkách melanómu B16F10. Podobne ako pri zisteniach inhibičnej aktivity tyrozinázy húb, izolované zlúčeniny inhibujú intracelulárnu aktivitu tyrozinázy a melanogenézu spôsobom závislým od dávky. Antityrozinázové účinky izolovaných zlúčenín viedli k ich antimelanogénnym vlastnostiam. Poradie antityrozinázovej a antimelanogénnej aktivity týchto zlúčenín bolo zlúčenina 4 > arbutín > 5 > 2 > 3 > 1. Vypočítaná hodnota IC50 zlúčeniny 4 bola významne nižšia ako hodnota arbutínu. Účinnosť zlúčeniny 4 bola 1.{25}} až 5-krát vyššia ako účinnosť ostatných štyroch zlúčenín. Zlúčenina 5 tiež vykazovala silnú anti-tyrozinázovú aktivitu, ktorá bola porovnateľná s aktivitou arbutínu. Naše výsledky ukázali, že zlúčeniny 4 a 5 by sa mohli použiť ako potenciálne prírodné inhibítory tyrozinázy a kozmetika na bielenie pokožky. Predpokladá sa, že oxidačný stres sa podieľa na základnom mechanizme nadprodukcie melanínu [28]. Preto sa antioxidačná úloha skúmala v širokom spektre kožných porúch, vrátane fotokarcinogenézy alebo melanómu [9]. My a iní sme predtým uviedli antioxidačné vlastnosti C. amada [13, 29], ktoré môžu byť zodpovedné za antimelanogénne účinky izolovaných zlúčenín. V tejto štúdii sme detekovali inhibičné účinky izolovaných zlúčenín na intracelulárnu syntézu melanínu a aktivitu tyrozinázy indukovanú -MSH. Naše izolované zlúčeniny sa teda môžu použiť ako činidlá vo funkčnej kozmetike na vývoj účinných ošetrení na bielenie pokožky.

Záver

Dôrazne odporúčame, že C. amada môže hrať dôležitú úlohu ako účinný inhibítor tyrozinázy. C. amada a jej bioaktívne zlúčeniny by sa mohli použiť v kozmetickom priemysle ako prírodné bieliace činidlá, v potravinárskom priemysle ako činidlá proti hnednutiu av lekárskej oblasti na liečbu hyperpigmentácie. Napriek tomu sú potrebné ďalšie štúdie na skúmanie antimelanogénnych účinkov izolovaných zlúčenín na zvieracích modeloch.

Materiály a metódy

Chemikálie

Tyrozináza z húb a arbutín boli zakúpené od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). L-tyrozín bol od spoločnosti Wako pure chemical industry Ltd. (Osaka, Japonsko). Metanol (MeOH), etylacetát (EtOAc) a n-hexán boli zakúpené od Nacalai Tesque (Kyoto, Japonsko). Bol zakúpený silikagél (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokyo, Japonsko) a MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Nemecko).

Príprava rastlinného materiálu Štyri rôzne druhy kurkumy, menovite C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada a C. zedoaria, sa pestovali na poli so sivou pôdou (hrubý piesok 3,6 percenta, jemný piesok 30,9 percenta , bahno 24,3 percent , íl 32,8 percent , pH 7,4, NO{{10}}}N 0,07 percent , NH4-N 0,08 percent , P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) pri Subtropické poľné vedecké centrum, Univerzita Ryukyus, Okinawa, Japonsko. Priemerná mesačná teplota, vlhkosť a zrážky počas kultivačného obdobia boli 17–29 stupňov, 61–83 percent a 22–369 mm. Boli poskytnuté bežné agronomické postupy vrátane hnojenia a zavlažovania. Oddenky sa zbierali, keď všetky výhonky druhu úplne vyschli. Oddenky sa premyli, nakrájali a sušili v teplovzdušnej sušiarni pri 50 stupňoch počas 72 hodín.

Extrakcia vzoriek

Extrakcie sa uskutočňovali rozpustením rôznych práškov kurkumy (300 g) v MeOH (3 1) pri teplote miestnosti (25 stupňov) a atmosférickom tlaku a udržiavali sa dva dni s nepretržitým magnetickým miešaním, aby sa zabránilo oxidácii vzduchom a tienenie pred slnečným žiarením. Zlúčeniny rozpustné v rozpúšťadle sa filtrovali pomocou filtračného papiera (č. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokio, Japonsko). K použitému rastlinnému materiálu sa pridali čerstvé rozpúšťadlá (MeOH) a proces sa opakoval trikrát. Prefiltrované roztoky obsahujúce rastlinné zlúčeniny sa vysušili na rotačnej odparke pri zníženom tlaku pri 40 stupňoch . Výťažok všetkých extraktov sa udržiaval v chladničke pri 4 stupňoch na experimentálne analýzy.

Test inhibície tyrozinázy

Aktivita inhibície tyrozinázy sa stanovila podľa predchádzajúcej metódy [30], pričom sa merala koncentrácia DOPA chrómu produkovaného pôsobením enzýmu tyrozinázy na tyrozínový substrát. Stručne, testovaná vzorka sa rozpustila v 80 percentách MeOH, aby sa získali rôzne koncentrácie (25, 50 a 100 ug/ml). 96-jamková doštička sa pripravila v nasledujúcom poradí: 120 μl fosfátového tlmivého roztoku (20 mM, pH 6,8), 20 μl vzorky a 20 μl hubovej tyrozinázy (500 U/ml v 20 mM fosfáte nárazník). Po inkubácii počas 15 minút pri 25 stupňoch sa reakcia iniciovala pridaním 20 ul 0,85 mM roztoku L-tyrozínu a potom sa inkubovala 10 minút pri 25 stupňoch. Aktivita tyrozinázy sa stanovila meraním absorbancie pri 470 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (spektrofotometer Biotek Powerwave XS2). Arbutín bol použitý ako pozitívna kontrola, zatiaľ čo 80 percentný MeOH bol použitý ako negatívna kontrola. Percento inhibície tyrozinázy sa vypočítalo nasledovne:

kde C je absorbancia negatívnej kontroly, B je absorbancia slepého pokusu a S je absorbancia testovanej vzorky.

Izolácia bioaktívnych zlúčenín zo surového extraktu Curcuma amada

Berúc do úvahy výsledky štyroch extraktov z kurkumy, C. amada vykazovala významne vyššiu anti-tyrozinázovú aktivitu ako ostatné. Preto sa uskutočnila biotestom riadená purifikácia aktívnych zlúčenín zo surového extraktu C. amada. Na identifikáciu anti-tyrozinázových zlúčenín sa frakcionácia zo surového extraktu C. amada uskutočnila tak, ako je opísané na obr. 5. Surový extrakt sa zriedil destilovanou vodou a potom sa extrahoval n-hexánom a následne EtOAc. Rovnaké objemy každého rozpúšťadla a roztoku surového extraktu sa potom zmiešali trepaním počas 3 minút v separačnom lieviku. Všetky frakcie sa skoncentrovali do sucha na rotačnej odparke pri 40 stupňoch. Anti-tyrozinázové aktivity týchto troch frakcií boli stanovené podľa vyššie uvedeného postupu. Pretože frakcia EtOAc vykazovala najvyššiu anti-tyrozinázovú aktivitu, bola vybraná na izoláciu a čistenie bioaktívnej zlúčeniny. Aktívna EtOAc frakcia sa odparila do sucha a podrobila sa chromatografii na stĺpci silikagélu (75 g) (30 x 3 cm). Elúcia sa uskutočnila s použitím n-hexánu a EtOAc so zvyšujúcim sa množstvom EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5). a 0:100 (F6)]. Anti-tyrozinázová aktivita týchto šiestich frakcií bola uskutočnená podľa vyššie uvedeného postupu a väčšina aktivít bola nájdená v F3 a F6. Frakcie F3 a F6 boli purifikované pomocou C18 HPLC s reverznou fázou (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonsko) vybavenou vodou a acetonitrilom ako mobilnou fázou s prietokovou rýchlosťou 2,5 ml min-1, detekovaná pri 280 nm.

Tri píky z F3 eluované pri 9,55, 13,66 a 16,47 min a štyri píky z F6 eluované pri 11,56, 12,20, 12,75 a 15.03 min ako bezfarebné biele látky, z toho inhibičné aktivita bola detegovaná v piatich vrcholových frakciách eluovaných pri 9,55 a 16,47 min z F3 a 11,56, 12,75 a 15.03 min (doplnkové údaje) z F6 (obr. 5). Izolované zlúčeniny (-10 mg) sa rozpustili v MeOH-d4 a potom sa podrobili spektrálnej analýze. Spektrá nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) boli zaznamenané na BRUKER NMR spektrometroch (500 MHz pre 1H a 125 MHz pre 13C) pri teplote miestnosti. Chemické posuny (5) boli zaznamenané ako časti na milión (ppm) vzhľadom na tetrametylsilán (TMS) ako vnútorný štandard. Experimenty s hmotnostnou spektrometriou sa uskutočňovali na hmotnostnom spektrometri Waters s použitím elektrosprejovej ionizačnej sondy (ESI - MS) za nasledujúcich inštrumentálnych podmienok: Kolóna: COSMOSIL 5C18-}AR-II, (2 x 150) mm. Rozpúšťadlo A: Voda (0,1 percenta kyseliny mravčej), Rozpúšťadlo B: acetonitril, prietok: 4 ml/min, vstrekovaný objem: 100 ul, doba chodu: 35 minút, časový program pre F3: 75 percent B (0 minút) → 75 percent B (20 min) → 100 percent B (20,1 min) → 100 percent B (27 min) → 75 percent B (27,1 min) → 75 percent B (35 min). Časový program pre F6: 45 percent B (0 min) → 45 percent B (14 min) → 100 percent B (14,1 min) → 100 percent B (20 min) → 45 percent B (20,1 min) → 45 percent B (25 min). Režim pumpy: Binárny gradient. Podrobnosti o rúre: CTO-20AC, teplota 40 stupňov . MS ionizačný režim: ES (plus), napätie kapiláry: 4,0 kV, napätie kužeľa: 20 V, teplota zdroja: 120 stupňov, teplota desolvatácie: 350 stupňov, prietok kužeľového plynu: 100 l/h, prietok desolvatačného plynu: 800 l /h (doplnkové údaje).

Anti-tyrozinázová aktivita izolovaných zlúčenín

Izolované zlúčeniny sa rozpustili v MeOH v koncentráciách 5, 10, 30, 50, 100 a 200 uM pre každú zlúčeninu. Anti-tyrozinázová aktivita bola stanovená použitím postupu opísaného vyššie.

Intracelulárna inhibícia tyrozinázy a melanogenézy izolovanými zlúčeninami

Bunková kultúra

Bunky melanómu B16F10 boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) doplnenom 10 percentami tepelne inaktivovaného fetálneho bovinného séra (FBS) a 1 percentom penicilínu (10,{6}} U/ml)/streptomycín (100 ug/ml) pri 37 stupňoch vo vlhkej atmosfére s obsahom 5 percent CO2.

Životaschopnosť buniek

Bunky B16F10 boli nanesené v hustote 5 x 104 buniek/jamku na 96-jamkovú platňu. Po 24 hodinách boli bunky vystavené rôznym koncentráciám izolovanej zlúčeniny a inkubované ďalších 48 hodín pri 37 stupňoch. Po inkubácii bola bunková životaschopnosť stanovená testom MTS. Pridalo sa dvadsať mikrolitrov roztoku MTS a inkubovalo sa 60 minút. Po inkubácii sa stanovila absorbancia buniek pri 490 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Benchmark Plus).

Anti-tyrozinázové a anti-melanogénne aktivity izolovaných zlúčenín

Stanovenie obsahu bunkového melanínu a testy aktivity tyrozinázy sa uskutočnili tak, ako bolo opísané vyššie [31], s miernymi modifikáciami. Bunky melanómu B16F10 boli nanesené v hustote 5 x 104 buniek/jamku na 96-jamkovú platňu. Po 24 hodinách boli bunky vystavené rôznym koncentráciám izolovanej zlúčeniny alebo arbutínu. Po 1 hodine sa pridalo 100 nM hormónu stimulujúceho melanocyty (-MSH) a bunky sa inkubovali ďalších 48 hodín pri 37 stupňoch. Pre štúdiu antityrozinázovej aktivity boli bunky potom premyté ľadovo studeným fosfátovým tlmivým roztokom a lyzované fosfátovým tlmivým roztokom (pH 6,8) obsahujúcim 1 percento Triton-X (90 ul/jamka). Doštičky boli zmrazené pri -80 stupňoch počas 30 minút. Po rozmrazení a zmiešaní sa do každej jamky pridalo 10 ul 1% L-DOPA. Po inkubácii pri 37 stupňoch počas 2 hodín sa merala absorbancia pri 490 nm. Na test obsahu melanínu sa bunky dvakrát premyli fosfátovým pufrom a potom sa rozpustili v 100 ul NaOH (1 N) obsahujúcom 10 percent DMSO. Vzorky sa inkubovali pri 80 stupňoch počas 1 hodiny a zmiešali sa, aby sa rozpustil melanín. Optická hustota zmiešaného homogenátu sa merala pri 490 nm.

Štatistická analýza

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Štatistické rozdiely medzi týmito dvoma priemermi boli hodnotené Studentovým t-testom. Viacnásobné porovnania sa uskutočnili s použitím jednosmernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Bonferroniho test. Rozdiely sa považovali za významné pri P <>

Toto je náš produkt proti únave! Pre viac informácií kliknite na obrázok!

Referencie

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Hypopigmentované činidlá: aktualizovaný prehľad o biologických, chemických a klinických aspektoch. Pigment Cell Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Prírodné a syntetické inhibítory tyrozinázy ako činidlá proti hnednutiu: Aktualizácia. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai ČR, Hsu TF a kol. Kinetika inhibičnej aktivity tyrozinázy pomocou extraktov listov Viti's vinifera. Biomed Res Int. 2017:5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Reaktívny orto-chinón generovaný tyrozinázou katalyzovanou oxidáciou činidla na depigmentáciu kože monobenzónu: reakcie samo-spájanie a tiol-konjugácia a možné dôsledky pre melanocyty toxicita. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Prehľad látok na bielenie pokožky: lieky a kozmetické výrobky. Kozmetika. 2016;3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Porovnanie hladín ortuti v rôznych tkanivách albínov a pigmentovaných myší liečených dvoma rôznymi značkami ortuťových krémov na zosvetlenie pokožky. Biometals: Int J role Met ions Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kurkuma: korenie, kozmetika a liek. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Účinky kurkumy (Curcuma longa) na zdravie pokožky: systematický prehľad klinických dôkazov. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Chemoprevencia fotokarcinogenézy vybranými dietetickými rastlinnými látkami. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Antifungálna aktivita rôznych druhov a kmeňov kurkumy (Curcuma spp.) proti Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H a kol. Relaxácia prasacej cerebrálnej artérie nezávislá od endotelu a závislá od vápnikového kanála rôznymi druhmi a kmeňmi kurkumy. J Tradit Complement Med. 2018;9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Izolácia a štrukturálne objasnenie antifungálnych zlúčenín z Curcuma amada. Ázijský Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Antioxidačná aktivita rôznych druhov a odrôd kurkumy (Curcuma spp): Izolácia aktívnych zlúčenín. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Tyrozinázová inhibičná aktivita kurkuminoidov z prášku kurkumy (Curcuma longa Linn.). J SWU Sci. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, syn PT. Izolácia seskviterpenoidov z odnoží vietnamskej kurkumy aromatickej Salisb. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Skúmanie vzťahu medzi štruktúrou a nelinearitou zederónu z podzemku Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, a kol. Analgetický princíp z Curcuma amada. J Ethnopharmacol. 2015;163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Cytotoxické zložky z odnoží Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Protizápalové seskviterpény z Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Cyklické diarylheptanoidy z rizómov Zingiber officinale. Fytochémia. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpény z Commiphora sphaerocarpa a príbuzné cudzopasníky pravej myrhy. Fitoterapia. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Antioxidačné a antibakteriálne účinky listovej silice a jej zložky furanodienon a curzerenon z Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex hák. f. Pharmacogn Res. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Optimalizácia podmienok GC–MS na základe rozlíšenia a stability analytov pre súčasné stanovenie deviatich seskviterpenoidov v troch druhoch podzemkov kurkumy. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienon inhibuje bunkovú proliferáciu a prežívanie potlačením signalizácie ER v bunkách ľudského karcinómu prsníka MCF-7. J Cell Biochem. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS a kol. Diarylheptanoidy a monoterpenoid z odnoží Zingiber officinale: antioxidačné a cytoprotektívne vlastnosti. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Nové diarylheptanoidy a diarylheptanoidové glukozidy z rizómov Tacca chantrieri a ich cytotoxická aktivita. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Identifikácia protinádorových zložiek v kurkuminoidoch z Curcuma longa L. na základe vzťahu zloženie-aktivita. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Fotopoškodenie DNA kože a jeho biologické dôsledky. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Izolácia a charakterizácia antioxidačnej a antibakteriálnej zlúčeniny z podzemku mangovníkového zázvoru (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antityrozinázové a antibakteriálne aktivity extraktu oplodia mangostanu. J Health Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicaleín inhibuje melanogenézu prostredníctvom aktivácie signálnej dráhy ERK. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.