Aplikácie aptamérov v neurovede, časť 2

Ďalší neurotransmiter, serotonín, hrá úlohu v neuromodulačných aktivitách ovplyvňujúcich spánok, agresivitu, chuť do jedla a sexuálnu aktivitu. Produkuje sa v rôznych častiach tela, ako je mozog, miecha, krvné doštičky a črevo [81–84].

Serotonín je neurotransmiter, ktorý hrá dôležitú úlohu vo fyzickom a duševnom zdraví človeka. V ľudskom tele serotonín reguluje náladu, kontroluje chuť do jedla a spánok a podporuje pocity fyzického potešenia a pohody. Serotonín však zohráva dôležitú úlohu aj pri ovplyvňovaní pamäti.

Výskum zistil, že serotonín môže podporovať zlepšenie pamäte reguláciou signalizácie medzi neurónmi. Keď sú ľudia pozitívne stimulovaní, telo uvoľňuje serotonín, ktorý pomáha posilňovať spojenia medzi neurónmi a zlepšuje efektivitu pamäte. Serotonín môže tiež urobiť ľudí kreatívnejšími, zlepšiť mentálnu obratnosť a pomôcť ľuďom rýchlejšie sa učiť a myslieť.

Okrem toho serotonín môže pomôcť znížiť príznaky úzkosti a depresie, problémy s náladou, ktoré môžu negatívne ovplyvniť koncentráciu a pamäť ľudí. Šťastná nálada a duševný stav môžu často podporiť, aby ľudia rozpoznali a naučili sa nové veci.

Stručne povedané, serotonín hrá nenahraditeľnú úlohu v našom fyzickom a duševnom zdraví, učení a pamäti. Môžeme zvýšiť uvoľňovanie serotonínu a [zlepšiť pamäť] zmenou našich stravovacích návykov, množstva cvičenia, metód učenia atď., pestovaním pozitívnej a zdravej mentality a neustálou výzvou, aby sme neustále podporovali zlepšovanie pamäte. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola má antioxidačné, protizápalové účinky a účinky proti starnutiu, čo môže pomôcť znížiť oxidačné a zápalové reakcie v mozgu, a tým chrániť zdravie nervového systému. Okrem toho môže Cistanche deserticola tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónových sietí. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, rýchlosť učenia a myslenia a môžu tiež zabrániť rozvoju kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Nerovnováha hladín periférneho serotonínu je spojená s niekoľkými chorobnými stavmi, vrátane hypertenzie, ochorenia obličiek a depresie. Použitie serotonínu na predpovedanie stavu ochorenia a na začatie správnej liečby má teda klinický význam.

Plazmonický test na serotonín bol vyvinutý s konjugátom aptamér-AuNP, pre ktorý je agregácia zmenená v prítomnosti serotonínu. Zmena v agregácii častíc môže byť meraná ako posun maximálnej vlnovej dĺžky absorpcie.

Test ukázal špecifickú odpoveď na serotonín a neposkytol žiadny štatisticky významný signál s jeho metabolitmi, 5-kyselinou hydroxyindoloctovou (5-HIAA), epinefrínom alebo noradrenalínom, keď bol každý testovaný v koncentrácii 1 uM.

Fetálne hovädzie sérum ako napodobenina ľudského séra tiež neiniciovalo žiadny signál [85]. Nedávno boli vyvinuté implantovateľné aptamérovo-poľné tranzistorové (FET) neurosondy na monitorovanie hladín serotonínu v mozgovom tkanive. Ultratenké In2O3 povrchy FET nanometrov boli modifikované aptamérmi a tieto neurosondy umožnili limity detekcie serotonínu fM in vivo s minimálnym biologickým znečistením [86].

S ďalšími neurosondami bude možné časopriestorové záznamy neurálnej aktivity, takže mozgové funkcie možno pochopiť na oveľa hlbšej úrovni. Epinefrín je katecholamínový neurotransmiter so širokým spektrom fyziologických funkcií, pri ktorých abnormálne hladiny môžu spôsobiť zdravotné problémy, ako je arytmia, infarkt myokardu, krv zvýšenie tlaku a pľúcny edém.

Na pozorovanie týchto súvisiacich chorobných stavov je dôležité kvantifikovať cirkulujúci epinefrín. S týmto cieľom bola vyvinutá kolorimetrická detekčná metóda, založená na interakcii adrenalínu s Au-NP funkcionalizovaným aptamérom. Systém je lacnejší a špecifickejší ako iné techniky na kvantifikáciu epinefrínu, ako je kvapalinová chromatografia a spektrofotometria.

Pomocou UV-viditeľnej spektroskopie bol stanovený aj detekčný limit 0,9 nM, čo je najnižší detekčný limit zaznamenaný pre epinefrín pri použití akejkoľvek kolorimetrickej metódy. Analógy epinefrínu, kyseliny 3,4-dihydroxyfenyloctovej (DOPAC), tryptofánu, kyseliny askorbovej, dopamínu, tyrozínu a kyseliny homovanilovej vykazovali veľmi malú alebo žiadnu odpoveď, čo poukazuje na vysokú špecificitu aptasenzora [87].

Zmena hladiny jedného neurotransmiteru môže naznačovať ktorúkoľvek z viacerých chorôb, čo robí veľmi nepravdepodobné, že by sa diagnóza choroby dala dosiahnuť na základe merania jedného neurotransmitera. Schopnosť väčšiny aptasenzorov integrovať sa do multiplexnej platformy preto povedie k diagnostickým nástrojom vhodnejším pre kliniky a s potenciálom podporovať presnejšiu identifikáciu chorôb.

2.3. Detekcia biomarkerov
Biomarker je akákoľvek látka, štruktúra alebo proces v tele, ktorý vedie buď k výsledku, alebo indikuje prítomnosť konkrétneho ochorenia. Mnohé biomarkery sú látky, ktoré možno merať v biokvapalinách, ako je krv, sliny a moč.

Hlavným problémom charakterizácie biomarkerov pre neurologické ochorenia je hematoencefalická bariéra (BBB), cez ktorú mnohé molekuly, vrátane mnohých proteínov, nemôžu prejsť. Hoci proteíny sú dominantnými biomarkermi určitých chorôb, malé peptidy, ako je neuropeptid Y alebo fragmenty proteínov, s väčšou pravdepodobnosťou prechádzajú cez BBB a sú detegované v obehu.

Metabolity sú ďalšou dôležitou skupinou biomarkerov pre neurologické poruchy. Spoločnosť NeoVentures Biotechnology Inc. vyvinula prístup k selekcii aptamérov nazývaný FRELEX, ktorý umožňuje selekciu aptamérov na základe konkurencie medzi krátkym oligonukleotidom pripojeným k povrchu a cieľom. Podobne ako pri bunkovej SELEX a iných formách SELEX s prepínaním štruktúry, tento protokol možno uskutočniť so vzorkou obsahujúcou zmes zložiek bez predchádzajúcej znalosti cieľa (cieľov), do ktorého sa budú aptaméry vyberať.

S týmito formami SELEX sa uskutočňujú počítacie selekcie s konkrétnymi podskupinami komponentov na riadenie selekcie aptamérov, ktoré spĺňajú požadované špecifickosti. Pomocou FRELEX boli aptaméry selektované proti séru z transgénnych myší, ktoré nadmerne exprimovali ľudský tau proteín.

Na riadenie selekcie aptaméru smerom k ľudskému tau a následkom nadmernej expresie tau sa pri protiselekcii použilo sérum z myší divokého typu. Skupina identifikovala obohatené aptamérové ​​sekvencie pomocou NGS a charakterizovala určité aptaméry pre neskoré štádium transgénnych myší a myší divokého typu porovnaním ich relatívneho množstva.

Predpokladali, že rozdiel v abundancii odráža príslušnú koncentráciu epitopov (zvýšenú v reakcii na nadmernú expresiu tau), s ktorými môžu aptaméry interagovať [29].

3. Diagnostické a terapeutické aplikácie

Neurodegeneratívne ochorenia (ND) zahŕňajú degeneráciu neurónov v mozgu, ktorá vedie k strate štruktúr a funkcií centrálneho nervového systému. ND môže byť spôsobené starnutím, genetickými a environmentálnymi faktormi.

Demencia je jednou z najčastejších NCH súvisiacich s vekom, rovnako ako Alzheimerova choroba (AD). Parkinsonova choroba (PD) môže byť spôsobená genetickými mutáciami a/alebo environmentálnymi toxínmi. Amyotrofická laterálna skleróza (ALS), roztrúsená skleróza (MS), Huntingtonova choroba (HD) a priónové choroby sú ďalšie bežné NCH s genetickými väzbami.

Bohužiaľ, pre tieto choroby nie sú dostupné ani účinné lieky, ani stratégie včasného odhalenia. Podobne ako široko používané protilátky, aj aptaméry sa stali atraktívnymi činidlami na použitie pri vývoji nových biosenzorov na včasnú diagnostiku NCH a vyliečenie týchto chorôb [88].

3.1. Alzheimerova choroba

Ako progresívna mozgová porucha súvisiaca s vekom, ktorá vedie k mentálnym nedostatkom, je AD najbežnejšou formou demencie. Jeho patológia je charakterizovaná agregáciou amyloidu- (A) odvodeného od amyloidného prekurzorového proteínu (APP) a iniciovanej v mozgovej oblasti hipokampu.

Hoci vedci predpokladali, že A-indukovaná neurotoxicita koreluje s nerozpustnými A plakmi (AP) a fibrilami (AF), nedávne dôkazy naznačujú, že rozpustné A oligoméry (AO) sú tiež spojené s nástupom AD.
Preto bol AO identifikovaný ako atraktívny biomarker pre včasnú diagnostiku AD a A a tau sa považujú za významné terapeutické ciele na liečbu AD [89].

3.1.1. AD diagnostika

Skôr opísané aptaméry proti AO mali nízke afinity a špecificity, ale neskoršie štúdie boli úspešnejšie pri identifikácii aptamérov, ktoré selektívne rozpoznávali fibrily 40-zvyškovej formy A (A 40), ale nie A 40 polymérov [90].

Avšak aptamérom oslabená vysoká špecificita pre fibrily A40 v porovnaní s vláknami niekoľkých ďalších amyloidogénnych proteínov, ktoré boli testované. Ukázalo sa tiež, že DNA aptamér vybraný na interakciu s -synukleínovým (-syn) oligomérom s 68-nM afinitou viaže AO s 25-nM afinitou [91]. V roku 2019 bol s použitím rovnakých aptamérov, aké získali Tsukakoshi et al., vyvinutý elektrochemický aptasensor bez značiek na špecifickejšie rozpoznanie AO [92].

Aptamér sám zostavuje staré tyčové elektródy prostredníctvom interakcie tiolu (-S) a systém má detekčný limit 30 ppm, určený EIS. Toto bol prvý aptasensor úspešne použitý na monitorovanie agregácie proteínov A na základe EIS, čo bolo možné vďaka vysokej selektivite aptaméru medzi druhmi A. Vďaka ľahkej výrobe a účinnej regenerácii môže byť tento aptasensor sľubným diagnostickým nástrojom na včasnú detekciu AD a na preukázanie akumulácie proteínu A [92].

Aptasenzor na detekciu A oligomérov bol vyvinutý s použitím -syn DNA aptaméru [91] v komplexe s metylénovou modrou (MB) a pripojený k nanoporéznej anodikalumine. Vysoký absorpčný koeficient MB pre biele svetlo mal za následok nízku intenzitu odrazeného bieleho svetla.

V prítomnosti A oligomérov sa komplex aptamér/MB disocioval a zvýšenie odrazeného svetla bolo detegované interferometrickou reflektančnou spektroskopiou (IRS) [93]. Aptasenzor mal detekčný limit 8 pM a dobrú odozvu na A oligoméry v koncentračnom rozsahu od 0,5 do 50 nM. Neurofibrilárne klbká (NFT) sú patologickými znakmi AD.

Tvorba NFT sa iniciuje v hipokampe a rozsah tvorby NFT je spojený so závažnosťou demencie pri AD. Hyperfosforylácia proteínu asociovaného s mikrotubulami, tau, podporuje jeho schopnosť získavať a organizovať normálne tau do filamentov, ktoré sa stávajú NFT. Hyperfosforylácia tau sa teda navrhuje ako jedna z hlavných príčin AD.

Okrem svojej normálnej úlohy pri podpore zostavovania mikrotubulov a stabilizácii zostavených mikrotubulov sa tau pozorovalo nerovnovážnou kapilárnou elektroforézou (CE) na viazanie troch náhodne vybraných oligonukleotidov ssDNA, z ktorých jeden, ssDNA1, sa viazal na tau381 s vysokou afinitou (Kd {{ 3}} nM) [94].

Sendvičový test aptamér/protilátka bol vyvinutý s použitím ssDNA1 na detekciu femtomolárnych koncentrácií tau proteínu v ľudskej plazme pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR) [95].

V ďalšej štúdii boli DNA aptaméry selektované proti celému tau proteínu so 441 aminokyselinami (tau441) rýchlou selekčnou technikou založenou na delení kapilárnou elektroforézou s tromi selekčnými cyklami ukončenými za jeden deň. Päť aptamérov vybraných z výsledkov vysokovýkonného sekvenovania bolo hodnotených pomocou SPR na ich schopnosť rozpoznávať tau.

Analytický potenciál aptaméru s vyššou afinitou bol demonštrovaný testom anizotropie s homogénnou fázou fluorescencie. Tento vysokoafinitný aptamér viazal proteín tau441 a kratšie izoformy tau352, tau381 a tau383 s detekčnými limitmi 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM a 22 nM v tomto teste [96].

3.1.2. AD Terapeutiká

Ako jedna z potenciálnych terapií sa vybrali RNA aptaméry na inhibíciu agregácie A40. Počas selekcie bol A oligomér konjugovaný s nanočasticami zlata (A-AuNP) a dva aptaméry boli identifikované ako kandidáti na aptaméry po SELEX.

Deti 10–20 nM. Tieto aptaméry inhibovali A plak a tvorbu fibríl, ako sa zistilo transmisnou elektrónovou mikroskopiou a A 40 enzýmovým imunosorbentovým testom (ELISA) [97].

Alkoholdehydrogenázový (ABAD) návnadový peptid (DP), ktorý interaguje s A, antagonizuje cytotoxicitu A peptidu. Sekvencia ABAD-DP bola vložená medzi dva tioly, ktoré tvoria disulfidovú väzbu v tioredoxíne (TRX), aby sa vytvoril TRX1-ABAD-DP-TRX2 peptidový aptamér. Jeho stabilná expresia v bunkách NIH 3T3 s použitím adeno-asociovaných vírusov bola overená imunofluorescenčným farbením.

Exprimovaný aptamér by mohol viazať A peptid a zlepšovať životaschopnosť buniek. Tento výskum potvrdil účinnú inhibíciu cytotoxického účinku peptidu A peptidovými aptamérmi [98]. Tau proteíny sa normálne spájajú a stabilizujú mikrotubuly, ale ich hyperfosforylácia môže viesť k proteínovým agregátom nazývaným "tauopatia", ktorá je toxická.

DNA aptamér Tau-1, ktorý bol vybraný proti ľudskému tau441, inhibuje oligomerizáciu Tau1 in vitro [99]. Táto inhibícia bola potvrdená aj v štúdiách bunkových kultúr s použitím buniek HEK293 [100]. Beta-sekretáza (BACE1) má úlohu v produkcii A a inhibícia expresie BACE1 je u myší smrteľná. Liečba AD môže zahŕňať moduláciu BACE1.

Avšak jeho veľké aktívne miesto robí z BACE1 náročný cieľ pre inhibítory s malými molekulami. Aby sa to obišlo, aptaméry nukleových kyselín môžu byť novými nástrojmi na inhibíciu aktivity BACE1. Tento enzým má cytoplazmatický koniec, B1-CT, ktorý slúži ako dokovacie miesto pre proteíny, ako je medený chaperón pre superoxiddismutázu-1 (CCS) a proteín viažuci ADP ribozylačný faktor (GGA1).

Fyziologická úloha B1-CT je do značnej miery neznáma. RNA aptamér nasmerovaný na B1-CT viazal membránovú proximálnu polovicu C konca BACE1 zabránil náboru CCS, pričom umožnil väzbu GGA1 na BACE1 a reguloval transport BACE1 do recyklujúcich endozómov [101].

Aby sa špecificky zacielili na BACE1, vytvorili sa DNA aptaméry, BI1 a BI2, proti BACE1, ktorý inhiboval BACE1, ale ani alfa- ani gama-sekretázu. Pomocou stabilne transfekovanej bunkovej línie HEK293 exprimovali prekurzor amyloidného proteínu (APP) a pomocou testu prenosu energie fluorescenčnej rezonancie (FRET) in vitro ukázali, že hladina A bola znížená a bunkový deficit bol zachránený v primárnej kultivovanej neuronálnej bunkovej línii. [102]. Účinnosť aptaméru sa ďalej zlepšila pridaním cholesteryltetraetylénglykolu (TEG).

3.2. Parkinsonova choroba

Parkinsonova choroba (PD) je druhým najčastejším neurodegeneratívnym ochorením, ktoré celosvetovo postihuje približne sedem miliónov ľudí. Hoci ide o progresívne ochorenie charakterizované motorickými a nemotorickými vlastnosťami, má významný klinický dopad na pacientov v dôsledku straty pohyblivosti a svalovej kontroly.

Strata striatálnych dopaminergných neurónov a strata neurónov v nedopaminergných oblastiach charakterizujú PD. Strata neurónov je vo všeobecnosti spojená s charakteristickou tvorbou Lewyho teliesok. Prítomnosť Lewyho teliesok obsahujúcich -syn oligoméry v mozgu sa teda považuje za možný terapeutický a diagnostický cieľ pre PD.

3.2.1. Diagnostika PD

Prvý aptamér, "M5-15", vybraný proti -syn, nemal špecificitu pre oligoméry a mohol by sa tiež viazať na -syn monoméry [103]. Ukázalo sa, že potom vybrané aptaméry DNA interagujú s oligomérmi -syn a nie s monomérmi -syn, ale viažu oligoméry A1-40.

Výskumníci tiež skúmali aptamérovú špecifickosť pre -syn oligoméry v porovnaní s inými proteínmi so štruktúrami, ktoré sú prevažne -list, ako je -sheet propeller structure pyrolochinolín chinín glukózodehydrogenázy (PQQH), a preukázali, že aptamér neviaže PQQH [91]. Uvádza sa, že aptasenzorov je schopných kvantifikovať -synoligoméry.

Kolorimetrický aptasenzor využívajúci DNA aptamér proti -synoligoméru sa adsorboval na zlaté nanočastice (AuNP), čo bránilo soľou indukovanej agregácii nanočastíc. Jeho väzba na -syn oligomér bráni absorpcii aptaméru na povrch AuNP, čo umožňuje spustenie agregácie AuNP pri vysokých koncentráciách soli a vedie k zmene farby.

Tento systém bol hlásený s LoD 10 nM. Sérum (dokonca aj pri 2 %) však prispelo k absorpcii zlúčenín v rozsahu zmeny farby v teste a interferovalo s agregáciou aptamér-Au-NP závislou od soli.

Aptasenzory používajúce EIS a SPR boli citlivejšie, s LoD 1 pM a 8 pM, v danom poradí [104]. Zistilo sa, že EIS aptasensor je vysoko špecifický pre oligoméry v porovnaní s monomérmi a nebol ovplyvnený prítomnosťou séra [104]. Prepracovaný dizajn elektrochemického aptasenzora na detekciu -syn oligoméru zahŕňal hybrid vytvorený komplementárnou sekvenciou k -syn oligomérnemu aptaméru spojenému s povrchom zlata cez tiolovú väzbu a zahŕňal terminálnu deoxynukleotidyltransferázu (TdT) a dTTP na predĺženie 30 koncov aptaméru a jeho doplniť o ďalší polyp.

Rozšírená ssDNA viazala metylénovú modrú a podporila jej spojenie so zlatým povrchom, čím vytvorila anelektrochemický signál. Okrem toho systém obsahoval exonukleázu I (Exo I), ktorá je špecifická pre ssDNA. Keď bol aptamér odstránený z binárneho komplexu s jeho komplementom jeho väzbou na -syn oligomér, komplementárne vlákna boli štiepené Exo I, čím sa zabránilo akumulácii metylénovej modrej na povrchu zlata, a tým sa znížil elektrochemický signál.

Detekčný limit bol 10 PM (S/N=3) a obnova signálu v prítomnosti 10 % a nižších koncentrácií séra bola veľmi prijateľných 95,3–107 % [105]. Avšak jeho zložitosť a začlenenie enzýmov spôsobujú, že tento systém je menej stabilný pri skladovaní a reprodukovateľný v teréne. Kombinácia kapilárnej elektroforézy-hmotnostnej spektrometrie (CE-MS) s extrakciou na pevnej fáze (SPE) na predbežnú koncentráciu cieľa s mikronáplňou modifikovanou aptamérom vo veľkom objeme vstreknutých vzoriek znížili detekčný limit 100-násobne v porovnaní so systémami CE-MS.

V tomto novom systéme je vzorka vyčistená a objem je minimalizovaný pre vylepšenú analýzu použitím mikro patróny, ktorá selektívne zadržiava cieľ. Zistilo sa, že aptamérový afinitný (AA) sorbent v patróne je lepšou alternatívou k protilátke. imunoafinitný (IA) sorbent ako základné elektrolyty potrebné na opláchnutie systému a tiež denaturáciu protilátok.

Vývoj AA-SPE-CE-MS bol dosiahnutý modifikáciou mikronáplne s M5-15 DNA aptamérom. Systém demonštroval LoD 2,8 nM a mal lineárny rozsah detekcie medzi 7 a 140 nM -syn vo vzorke krvi.

Tiež identifikácia voľných a N-acetylovaných -syn proteoforiem bola možná ako výsledok vysoko presnej detekcie hmotnosti a rozlišovacej schopnosti MS. Nakoniec sa zistilo, že mikrokartridža je stabilná aj pri kyslom BGE a mohla byť použitá na približne 20 analýz s nízkou pravdepodobnosťou chybnej kvantifikácie cieľa [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com