Priaznivé účinky frakcie celkového fenyletanoidového glykozidu izolovanej z Cistanche Deserticola na mikroštruktúru kostí u potkanov po ovariektómii

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang a Xueqin Ma

1 Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Čína

2 School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, Čína

3 Kľúčové laboratórium modernizácie etnickej medicíny Hui, Ministerstvo školstva, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Čína

Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný pod licenciou Creative Commons Attribution License, ktorá umožňuje neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu za predpokladu, že pôvodné dielo je správne citované.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktné

Táto štúdia bola navrhnutá tak, aby odhadla antiosteoporotickú aktivitu celkovej frakcie fenyletanoidových glykozidov izolovanej zCistanchedeserticola(CDP) na potkanoch indukovanej ovariektómiou (OVX), ako aj súvisiace mechanizmy. Po 3 mesiacoch perorálneho podávania sa u potkanov OVX obnovila znížená hustota kostných minerálov, sérový Ca a P a zhoršená mikroarchitektúra trabekulárnej kosti sa čiastočne zlepšila zásahom Cistanche deserticola (60, 120 a 240 mg/kg), aktivity markery kostnej resorpcie boli znížené a bioaktívna hodnota indexu tvorby kostí bola zvýšená; medzitým sa obsah MDA znížil a GSH sa zvýšil liečbou CDP. Zložením bolo identifikovaných 8 fenyletanoidových glykozidových zlúčenín vCistanchedeserticola(CDP), pričom celkový obsah bol kvantifikovaný ako 50,3 percent pomocou metódy HPLC. mechanicky,Cistanchedeserticola(CDP) znížili hladiny TRAF6, RANKL a RANK, čím potlačili RANKL/RANK/TRAF6-indukovanú aktiváciu downstream signálnych dráh NF-κB a PI3K/AKT a v konečnom dôsledku zabránili aktivitám kľúčových osteoklastogénnych proteínov NFAT2 a c -Fos. Všetky vyššie uvedené údaje naznačujú, že CDP vykazoval priaznivé účinky na mikroštruktúru kostí u potkanov po ovariektómii a tieto účinky môžu súvisieť so signálnymi dráhami NF-KB a PI3K/AKT, ktoré boli spustené väzbou RANKL, RANK a TRAF6.

Cistanche tubulosamá veľa účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

1. Úvod

Postmenopauzálna osteoporóza, ktorou bude trpieť 1 z 3 žien starších ako 50 rokov, sa stáva hlavným zdravotným rizikom, ktoré postihuje viac ako 200 miliónov žien na celom svete [1]. V menopauze prudký pokles hladiny estrogénu zvyčajne vedie k nadmernej kostnej resorpcii spôsobenej zvýšenou osteoklastogenézou; potom sa narušila rovnováha medzi tvorbou kosti vyvolanou osteoblastmi a kostnou resorpciou vyvolanou osteoklastmi a zrýchlená resorpcia kosti nakoniec spôsobila osteoporózu a dokonca zlomeninu bedra alebo chrbtice [2]. Verilo sa, že diferenciácia osteoklastov sa spustí, keď sa aktivátor receptora jadrového faktora kappa B (RANK) naviaže na RANKL, ligand RANK. Kombináciu RANK a RANKL však nemožno aktivovať, pokiaľ sa k nej nepripojí faktor 6 (TRAF6) spojený s receptorom proteínu tumor nekrotizujúceho faktora [3], po ktorom nebude nasledovať stimulácia downstream signálnych dráh vrátane PI3K/AKT a NF-κB. A nakoniec, expresie jadrového faktora aktivovaných T buniek c2 (NFAT2) a c-Fos boli regulované [4], aby sa modulovala diferenciácia osteoklastov, ako aj kostná resorpcia. Faktory a regulátory, ktoré priamo alebo nepriamo súvisia s aktiváciou a diferenciáciou osteoklastov, sa teda považovali za kľúčové ciele na prevenciu straty kostnej hmoty.

Skutočne existujú niektoré klinické a syntetické lieky na hormonálnu substitučnú terapiu, ako je estradiolvalerát, ktoré sú účinné pri liečbe postmenopauzálnej osteoporózy. Bohužiaľ, niektoré z nich zvýšili riziko závažných rakovín vrátane rakoviny prsníka a endometria [5], čo obmedzovalo ich klinické použitie. Preto je potrebné zvoliť iné alternatívy s účinnosťou a minimálnymi vedľajšími účinkami. Tradičné čínske lieky (TCM), ako aj izolované bioaktívne zlúčeniny a frakcie [6–9] sa ukázali ako účinné pri rôznych ochoreniach vrátane postmenopauzálnej osteoporózy. Spomedzi týchto bioaktívnych zložiek a frakcií boli zlúčeniny fenyletanoidných glykozidov (PhG) s potenciálnou účinnosťou považované za sľubné látky na liečbu osteoporózy [10–12]. Štruktúry PhGs pozostávajú z aglykónu kyseliny škoricovej, hydroxylfenyletylovej skupiny, ktorá je kombinovaná s -glukopyranózou, apózou, galaktózou, ramnózou alebo xylózou prostredníctvom glykozidickej väzby. Vo veľkej miere sa vyskytujú v liečivých druhoch roduCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma je ​​oficiálna TČM, ktorá je zaznamenaná v čínskom liekopise, a okrem toho, že je dôležitou TČM [14], C deserticola je tiež tonizujúca bylina proti starnutiu s niekoľkými vedľajšími účinkami, ktorá bola vyvinutá do liečivého likéru a výživnej tekutiny schválenej Štátnou potravinou. and Drug Administration. Na základe záznamu čínskeho liekopisu bola C. deserticola tradične používaná domorodcami na riešenie problémov s nedostatkom obličkových esencií, ako je svalová slabosť a slabosť bedrového kĺbu, a zlúčeniny fenyletanoidných glykozidov vrátane echinakozidu a akteozidu sú hlavnými bioaktívnymi zložkami tejto byliny. Podľa teórie TČM „obličky riadi kosť“ je kostný systém riadený obličkovou esenciou [15] a problémy súvisiace s kosťami, ako je osteoporóza, môžu byť odstránené bylinami alebo zlúčeninami, ktoré majú aktivitu vyživovať obličkovú esenciu. Preto sme predpokladali, že celková frakcia fenyletanoidových glykozidov izolovaná z C. deserticola, aspoň čiastočne, bola prospešná pri liečbe osteoporózy. Súčasný experiment bol preto navrhnutý na overenie našej hypotézy použitím modelu potkanov s odstránením vaječníkov (OVX); okrem markerov kostnej resorpcie a tvorby kostí, ktoré je potrebné odhadnúť, bol na skúmanie hlavných mechanizmov antiosteoporotickej bioaktivity použitý aj antioxidačný index, ako aj RANKL/RANK/TRAF6- indukované PI3K/AKT a NF-KB signálne dráhy .

2. Materiály a metóda

2.1. Rastlinné materiály a príprava.

Spolu 30 kg stoniek zCistanchedeserticolaY.C. Ma boli zhromaždené z okresu Yongning v septembri 2015 so súradnicami 106.026597 a 38.262816, provincia Ningxia, Čína. Bylinu identifikoval Dr. Lin Dong (Katedra farmakognózie, Ningxia Medical University) a zodpovedajúci exemplár (č. 201509{{40}}1) sa zachoval na Katedre farmaceutickej analýzy. Najprv sa extrahovalo 30},0 kg práškového C. deserticola použitím refluxnej metódy so 70 percentným etanolom ako rozpúšťadlom; pomer materiálu k rozpúšťadlu bol nastavený na 1:10 a doba varu pod spätným chladičom bola 2 hodiny počas 3-krát. Potom sa všetky filtráty spojili a kondenzovali za zníženého tlaku pri 60 °C. Po druhé, na predbežnú separáciu sa použili kolóny AB-8 makroporéznej živice a rôzne pomery etanolu vo vode (0 percent, 20 percent, Na elúciu sa použilo 30 percent, 40 percent, 50 percent a 60 percent, každých 60 l). Po tretie, 40-percentný a 50-percentný eluent sa spojil a ďalej čistil použitím opakovaných AB-8 makroporéznych živicových kolón s eluentmi 0 percent, 20 percent, 30 percent, 40 percent a 50 percent etanolu vo vode a každý eluent bol 12 1. Nakoniec sa 40 percentná frakcia zhromaždila a kondenzovala za zníženého tlaku, čím sa získalo 150 g svetložltej sedimentovej fenyletanoidovej glykozidovej frakcie C. deserticola (CDP, výťažok bol 0,5 percenta). Pre in vivo experimenty sa na rozpustenie CDP použilo 0,5 % CMC-Na rozpúšťadla; orálne podávanie zvieratám bolo nastavené ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti; pre in vitro Western blot analýzu sa CDP rozpustil v DMSO a potom sa zriedil s DMEM, aby sa získali konečné koncentrácie 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml.

2.2. Chemikálie a rozpúšťadlá.

Estradiol valerát (EV) bol od Delpharm Lille SAS, Francúzsko; alkalická fosfatáza (ALP), kostný gla-proteín (BGP), tartrát-rezistentná kyslá fosfatáza (TRAP) a deoxypyridinolín (DPD) crosslink ELISA súpravy od Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Čína, 201605; reagenčné súpravy malondialdehyd (MDA, 20181221), super oxid dismutáza (SOD, 20121218) a glutatión (GSH, 20181221) z Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, Čína; súpravy ELISA zosieťovaného parathormónu (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonínu (2L9ISN7AIU) a receptora alfa súvisiaceho s estrogénom (ERR, Y3AY8QEWB3) od Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Čína; katepsín K ELISA reagenčná súprava od BioVision, Amerika, 11300141; primárne protilátky RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kináza p8265 alpha AKT 1 (AF05173234), -aktín (17AV0411) a sekundárne protilátky kozieho anti králičieho IgG konjugovaného s chrenovou peroxidázou od ZSGB-BIO, Čína, 136080; súprava na stanovenie celkového proteínu BCA a komerčná súprava na detekciu tvorby oklastov a fetálneho bovinného séra a Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM) od HyClone, Logan, UT, USA; polyvinylidénfluoridová (PVDF) membrána od Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penicilín a streptomycín od Gibco, Rockville, MD, USA. Všetky ostatné použité chemické činidlá boli triedy AR.

2.3. HPLC kvantifikácia Cistanche Deserticola P.

Na identifikáciu a kvantifikáciu zloženia CDP sa použil prístroj Agilent 1220 HPLC. Chromatografické podmienky boli nasledovné: C18 kolóna (TSK-GEL, 4 6 Id x 250 mm, 5 μm); gradientová elúcia obsahovala rozpúšťadlá A (acetonitril) a B (voda obsahujúca 0,5 percenta kyseliny octovej) (0-10 min: 17-20 percent A; 10-30 min: 20-25 percent A; a 30-40 min: 25-30 percent A); detekčná vlnová dĺžka bola 333 nm; teplota okolia; prietoková rýchlosť bola 1,0 ml/min; vstrekovaný objem vzorky bol 5 ul. Identifikovalo sa osem PhG zlúčenín, konkrétne cistanozid F, echinakozid, 6'-acetylakteozid, cistanozid C, cistanozid A, akteozid, 2'-acetylakteozid a izoakteozid; použitím zodpovedajúcich referenčných látok a metódy externého štandardu sa obsah vyššie uvedených 8 PhG kvantifikoval pomocou HPLC analýzy (obrázok 1).

2.4. Experimentálny protokol na zvieratách.

Celkovo 60 dospelých samíc potkanov Sprague-Dawley vo veku 3 mesiacov bolo vybraných z centra testovania na zvieratách Ningxia Medical University s priemernou počiatočnou telesnou hmotnosťou približne 234 ± 25 g. Potkany boli umiestnené v štandardnom prostredí bez špecifických patogénov, aby sa aklimatizovali počas 1 týždňa. Potom boli všetky potkany anestetizované (chloralhydrát, 100 mg/kg, ip) alebo len simulovaná ovariektómia (SHAM), alebo boli obidva vaječníky odstránené a potom náhodne rozdelené do 5 podskupín: orálne liečené vehikulom (0,5 percenta CMC- Na) bola stanovená ako modelová skupina (OVX), estradiolvalerát (1 mg/kg/deň) ako pozitívna skupina (EV) a 60, 120 a 240 mg/kg/deň CDP ako nízka (CDPL), stredne (CDPM) a vysoko (CDPH) dávkové skupiny. Všetkým potkanom sa perorálne podávalo denne a trvalo 3 mesiace s dávkovaním upravovaným každé 2 týždne, čo záviselo od zmeny celkovej telesnej hmotnosti. V posledný deň pokusu na zvieratách sa 24-hodinový moč získal pomocou metabolických klietok; sérum bolo odobraté z femorálnej artérie anestetizovaných potkanov; pravá stehenná kosť, holenná kosť a všetky orgány boli vypreparované a uložené pri -80 stupni C na ďalšiu analýzu. Pokusy na zvieratách, ktoré sme vykonali, boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Ningxia Medical University.

2.5. Stanovenie kostnej minerálnej hustoty a mikro-CT analýza.

Najprv sa použil dvojenergetický rôntgenový absorpčný prístroj (Lunar, USA) na odhadnutie celkovej kostnej minerálnej hustoty pravej stehennej kosti každého potkana; po druhé, rovnaká stehenná kosť sa použila na odhad 3D obrazu mikroarchitektúry trabekulárnej kosti pomocou mikro-CT skenera (GE, Amerika). Izotropné rozlíšenie bolo nastavené na 14 μm, aby sa získal ideálny 3D obraz; oblasť záujmu (ROI) bola zvolená nastavením rovnakých súradníc na rastovej platni stehennej kosti každej vzorky; a morfometrické parametre kostí vrátane trabekulárnej separácie (Tb. Sp), trabekulárneho počtu (Tb. N), hrúbky trabekuly (Tb. Th), obsahu minerálov v kosti (BMC), hustoty minerálov v tkanivách (TMD) a obsahu minerálov v tkanivách (TMC ) sa získali analýzou ROI.

2.6. Biochemický test séra a moču.

Aktivity sérového katepsínu K, TRAP, SOD a GSH, ako aj obsah sérového PTH, kalcitonínu, ERR, MDA, BGP a DPD v moči, boli stanovené použitím zodpovedajúcich reagenčných súprav podľa pokynov výrobcu a hladina alkalickej fosfatázy (ALP) a obsah vápnika (Ca) a fosforu (P) v sére a moči sa odhadli pomocou automatického stroja (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Western Blot analýza.

Osteoklasty boli indukované použitím buniek RAW 264.7 pridaných s faktorom stimulujúcim kolónie makrofágov (MCSF) a RANKL. Stručne, 1 x 107 buniek RAW 264.7 sa kultivovalo na 6-jamkovej doštičke v prítomnosti 30 ng/ml MCSF a 25 ng/ml RANKL. Po 6 dňoch indukcie sa zrelé bunky osteoklastov identifikovali pomocou metódy farbenia TRAP s príslušnou súpravou, potom sa ošetrili CDP (0.1, 0.01 a 0,001 mg/ml v uvedenom poradí) počas 24 hodín; potom boli bunky lyzované lyzačným pufrom obsahujúcim 0,5 mmol fenylmetylsulfonylfluoridu, proteázy a inhibítorov fosfatázy. Lyzát sa potom oddelil pomocou 10 percent SDS-PAGE a preniesol sa na PVDF membránu, ktorá sa sondovala s AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos a -aktínom. (1:400) po blokovaní 5% odtučneným mliekom počas 2 hodín. Rovnaké membrány boli stripované a znovu sondované s vyššie uvedenými 9 zodpovedajúcimi protilátkami, v danom poradí, potom boli na konci detegované softvérom Image Lab. Experimenty sa opakovali trikrát.

2.8. Štatistická analýza.

Všetky údaje získané z in vivo a in vitro experimentov, opísané ako priemer ± SD, boli analyzované pomocou jednocestnej ANOVA nasledovanej Dunnettovým testom (SPSS 22.0 softvér, SPSS, USA); p < 0="" 05="" bolo="" štatisticky="">

Výsledky

3.1. Chemické zloženie Cistanche Deserticola P.

Použitím metódy HPLC sa osemfenyletanoidový glykozidV tejto frakcii sa našli zlúčeniny, ako ukazuje obrázok 1. Použitím štandardných referencií a externej štandardnej metódy boli zlúčeniny a ich obsah identifikované a kvantifikované nasledovne: (1) akteozid F (3,6 percenta), (2) echinakozid (8,8 percenta), (3) cistanozid A (5.{101} {9}} percent ), (4) akteozid (13,3 percenta), (5) izoakteozid (3,3 percenta), (6) akteozid C (3,6 percenta), (7) 2'-acetylakteozid (9,9 percenta) a (8 ) 6'-acetylakteozid (3,2 percenta). Celkový obsah týchto ôsmich zložiek bol kvantifikovaný ako 50,7 percenta.

3.2. Účinky Cistanche Deserticola P na hustotu kostných minerálov a mikroarchitektúru trabekuly.

Celková minerálna hustota kostí potkanov v rôznych podskupinách je znázornená na obrázku 2. U potkanov z modelovej skupiny OVX bol pozorovaný klesajúci trend v obsahu minerálnej hustoty kostí, ktorý sa po roku znížil o takmer 12.0 percent. 12 týždňov operácie v porovnaní s potkanmi zo skupiny SHAM (p < 0="" 001).="" všetky="" potkany="" liečené="" cdp="" vykazovali="" významne="" zvýšenú="" minerálnu="" hustotu="" kostí="" o="" 11,2="" percenta,="" 12.0="" percent="" a="" 10,7="" percenta="" (p="">< 0="" 01),="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" modelu="" ovx="" skupina.="" okrem="" toho,="" v="" súlade="" s="" údajmi="" o="" celkovej="" minerálnej="" hustote="" kostí,="" rekonštrukcia="" mikro-ct,="" ako="" aj="" histomorfometrické="" stanovenie="" stehennej="" kosti="" ukázali,="" že="" potkany="" v="" skupine="" ovx="" vykazovali="" zjavné="" zhoršenie="" trabekulárnej="" architektúry,="" čo="" dokazuje="" výrazne="" znížený="" počet="" a="" plocha="" trabekuly.="" ako="" výrazne="" zvýšené="" tb.="" sp="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" zo="" skupiny="" sham.="" liečba="" cdp="" zabránila="" ovx-indukovanému="" zhoršeniu="" trabekulárnej="" architektúry;="" ako="" ukazuje="" obrázok="" 3,="" bmc,="" tmc="" a="" tb.="" významne="" sa="" zvýšili="" hodnoty="" n="" a="" plocha="" tb.="" sp="" bol="" výrazne="" znížený,="" zatiaľ="" čo="" hodnoty="" tmd="" a="" tb.="" zdalo="" sa,="" že="" tieto="" operácie="" neboli="" významne="" ovplyvnené="" operáciou="" ovx="" a="" našou="" intervenciou="">

3.3. Účinky Cistanche Deserticola P na biochemické parametre moču a séra.

Ako ukazuje obrázok 4, boli detegované významné trendy poklesu hladiny P v moči a obsahu kalcitonínu v sére u potkanov modelovej skupiny OVX, čo bolo takmer o 30 percent a 60 percent menej ako u potkanov SHAM (p < 0="" 001="" ),="" zatiaľ="" čo="" medzi="" skupinami="" ovx="" a="" sham="" neboli="" pozorované="" žiadne="" zjavné="" rastúce="" alebo="" klesajúce="" trendy="" hladín="" ca="" a="" ca="" v="" sére,="" ako="" aj="" pth="" v="" sére="" a="" pth="" v="" sére.="" liečba="" cdp="" významne="" zabránila="" strate="" p="" a="" ca="" v="" sére="" u="" ovx="" potkanov,="" čo="" dokazujú="" hladiny="" p="" a="" ca="" v="" sére="" výrazne="" upregulované="" (p="">< 0="" 05)="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" z="" modelovej="" skupiny="" ovx.="" okrem="" toho="" boli="" pozorované="" zvýšené,="" ale="" štatisticky="" nevýznamné="" trendy="" kalcitonínu="" v="" skupinách="" s="" nízkou="" aj="" vysokou="" dávkou="" cdp="" v="" porovnaní="" s="" modelovou="" skupinou="">

3.4. Účinky Cistanche Deserticola P na tvorbu kostí a markery kostnej resorpcie.

Priaznivé účinky CDP na index kostnej tvorby, ako aj inhibičné vplyvy na markery kostnej resorpcie sú opísané na obrázku 5. Čo sa týka markerov kostnej tvorby, hladiny sérového BGP neboli takmer ovplyvnené operáciou po odstránení vaječníkov, ktorá bola preukázaná tým, že významné zmeny pozorované vo všetkých liečených skupinách, zatiaľ čo štatisticky významné zlepšenia sérovej ALP sa dosiahli v nízkych (60 mg/kg) aj stredných (120 mg/kg) dávkach intervenčných skupín CDP, keď v porovnaní s potkanmi zo skupiny SHAM (p < 0="" 01).="" pokiaľ="" ide="" o="" index="" kostnej="" resorpcie,="" hladiny="" katepsínu="" k="" a="" dpd="" v="" sére,="" ako="" aj="" trap="" u="" potkanov="" modelovej="" skupiny="" ovx,="" boli="" významne="" zvýšené="" o="" približne="" 75,0="" percent,="" 41,4="" percent="" a="" 21,0="" percent="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" sham.="" a="" pri="" liečbe="" cdp,="" najmä="" nízkou="" dávkou="" 60="" mg/kg,="" boli="" vlastnosti="" katepsínu="" k="" a="" dpd,="" ako="" aj="" trap="" v="" modelovej="" skupine="" ovx="" výrazne="" inhibované="" o="" 67,3="" percenta,="" 41,4="" percenta="" a="" 25,9="" percenta,="" v="" uvedenom="" poradí.="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" v="" modelovej="" skupine="">

3.5. Účinky Cistanche Deserticola P na vagínu a maternicu, ako aj na hmotnosť celého tela.

Nevýznamné rozdiely v počiatočnej celkovej telesnej hmotnosti potkanov boli pozorované pred liečbou v šiestich skupinách (obrázok 6). Operácia s odstránením vaječníkov však viedla k významnému zvýšeniu konečnej telesnej hmotnosti potkanov v modelovej skupine OVX, čo je takmer 36.0 percent, zatiaľ čo vlhká hmotnosť maternice a vagíny sa drasticky znížila o takmer 9{{4 }}.0 percent a 60,0 percent, v tomto poradí, v porovnaní s potkanmi SHAM (p < 0="" 001).="" hoci="" obsah="" err="" nevykazoval="" žiadny="" významný="" rozdiel="" medzi="" skupinami="" ovx="" a="" sham,="" všetky="" liečebné="" skupiny="" vrátane="" cdp="" a="" ev="" významne="" zvýšili="" hladinu="" err="" .="" okrem="" toho,="" keď="" sa="" liečili="" ev,="" vyššie="" uvedené="" prírastky="" hmotnosti="" celého="" tela,="" ako="" aj="" strata="" hmotnosti="" vagíny="" a="" maternice="" ovx="" potkanov="" boli="" čiastočne="" zvrátené="" (p="">< 0="" 001),="" ale="" neboli="" ovplyvnené="" intervenciou="">

3.6. Účinky Cistanche DeserticolaP na hladiny sérového MDA, SOD a GSH.

Medzi modelovými skupinami SHAM a OVX nebol štatisticky významný rozdiel vo vlastnostiach sérových SOD a GSH; ako je znázornené na obrázku 7, medzi vyššie uvedenými skupinami možno pozorovať rastúci trend v GSH. Okrem toho hladina sérového MDA bola prudko zvýšená o takmer 50 percent u potkanov modelovej skupiny OVX v porovnaní s potkanmi SHAM. Aktivita SOD nebola ovplyvnená liečbou CDP, zatiaľ čo vlastnosť GSH bola významne zlepšená intervenciou CDP a CDP výrazne znížila hladinu MDA o 33,9 percenta a 42,4 percenta pri dávkach 60 a 240 mg/kg, v uvedenom poradí ( p < 0="">

3.7. Účinky Cistanche deserticola P na hladiny expresie proteínov.

Naše údaje uvedené na obrázku 8 naznačujú, že liečba CDP významne znížila hladiny proteínov TRAF6, RANK a RANKL v porovnaní s kontrolou. Dolné signálne dráhy vrátane NF-KB boli potlačené a PI3K/AKT bol stimulovaný CDP intervenciou, čo dokazuje expresia downregulácie NF-KB-p65, zatiaľ čo PI3K-p85 a AKT1 boli upregulované. V dôsledku toho sa expresia NFAT2 významne znížila a c-Fos sa zvýšil po liečbe CDP v koncentrácii 0.001-0,1 mg/ml. Navrhovaný mechanizmus je opísaný na obrázku 9, kde CDP znížila hladiny RANKL a RANK, čo viedlo k zníženiu väzbových množstiev tohto ligandu s jeho receptorom, a spojenie RANKL s RANK bolo ďalej znížené znížením TRAF6, nasledovalo potlačenie downstream dráh vrátane dráhy NF-KB, zatiaľ čo signálna dráha PI3K/AKT bola stimulovaná, čo nakoniec viedlo k zníženiu expresie NFAT2 a zvýšeniu hladiny c-Fos.

4. Diskusia

Fenyletanoidové glykozidy sú prirodzene sa vyskytujúce vo vode rozpustné zložky, ktoré sa bežne vyskytujú v ríši liečivých rastlín [11]. Doteraz zlúčeniny fenyletanoidových glykozidov priťahovali stále viac výskumníkov pre ich evidentnú úlohu pri liečbe rôznych ľudských ochorení a abnormalít [13]. Množstvo antiosteoporotických bioaktívnych frakcií a zlúčenín, vrátane polyfenolových a fenyletanoidných glykozidov, bolo identifikovaných a izolovaných z desiatok prírodných liečivých bylín [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola je dobre známa ako "ženšen púšte", čo naznačuje bezpečnostný profil tejto jedlej TCM [18, 19]. Ako všeobecná tonizujúca bylina a prírodná zdravá potravina, ktorá sa dlho používa v ázijských krajinách, C. deserticola vykazovala priaznivú funkciu na zvýšenie sily obličiek. Zistilo sa, že TČM, tradične používané na povzbudenie a udržanie obličkovej esencie, sa zvyčajne používali na liečbu osteoporózy, in vitro aj in vivo publikované údaje preukázali antiosteoporotickú aktivitu C. deserticola [20–23] a zložiek fenyletanoidných glykozidov vrátane echinakozid a akteozid sú hlavné bioaktívne zložky, ktoré existujú v tejto jedlej liečivej rastline; všetko naznačuje, že nielen samotný echinakozid a akteozid, ale aj iné fenyletanoidové glykozidové zložky obsiahnuté v C. deserticola sa považovali za zodpovedné za antiosteoporotické vlastnosti tejto byliny. V našej súčasnej štúdii sa na izoláciu a obohatenie frakcie fenyletanoidových glykozidov z C. deserticola použila priaznivá bezpečnostná makroporézna živica a pomocou metódy HPLC sa osem hlavných zložiek fenyletanoidných glykozidov, konkrétne akteozid F, echinakozid, cistanozid A, akteozid, izoakteozid, akteozid C, 2'-acetylakteozid a 6'-acetylakteozid sa našli v izolovanej frakcii fenyletanoidových glykozidov a obsahy boli 3,6 percenta, 8,8 percenta, 5,0 percenta, 13,3 percenta, 3,3 percenta, 3,6 percenta, 3,6 percenta a 3,2 percenta. Echinakozid, jedna z hlavných aktívnych zlúčenín zaznamenaných v C. deserticola [14], má antiosteoporotickú aktivitu; avšak dávka 270 mg/kg bola taká vysoká, že obmedzovala jej ďalšiu klinickú aplikáciu [24]. V súčasných experimentoch sa celková frakcia fenyletanoidných glykozidov s nižšou dávkou 60-240 mg/kg telesnej hmotnosti/deň použila na OVX potkanoch a obsah identifikovaných zložiek bol v tejto frakcii takmer 50 percent čistý pri použití metóda HPLC.

Bolo dobre známe, že OVX môže spôsobiť osteoporózu, a OVX potkan bol považovaný za klasický a vhodný model na simuláciu ľudskej postmenopauzálnej osteoporózy. Súčasne sa po operácii ovariektómie pozoroval významný pokles minerálnej hustoty kostí, mikroarchitektúry trabekulárnej kosti, vlhkých hmotností maternice a vagíny a hladiny estrogénu, ako aj zjavné zvýšenie kostnej resorpcie a telesnej hmotnosti, z ktorých časť v dôsledku straty estrogénu [25]. Naše údaje doteraz jasne preukázali, že OVX skutočne vyvolal postmenopauzálnu osteoporózu a je vždy sprevádzaný prudkým poklesom kvality kostí, mikroarchitektúry kostí a vlhkých hmotností maternice a vagíny. Keďže EV je všeobecná hormonálna substitučná látka, ktorá sa používa v klinickej praxi, použila sa ako pozitívna kontrola v našom experimente in vivo a na zvýšenie telesnej hmotnosti a atrofie maternice, ako aj na zhoršenú minerálnu hustotu kostí a mikroarchitektúru trabekulárnej kosti. , boli podľa očakávania zvrátené suplementáciou EV. Na rozdiel od pozitívnej kontroly neboli znížené hmotnosti vagíny a maternice, ako aj celková hmotnosť tela potkanov v modelovej skupine OVX ovplyvnené liečbou CDP, čo znamená, že CDP môže zvýšiť tvorbu kostí bez vyvolania vedľajších účinkov. na telo a organické tkanivá maternice. Aj keď hladiny ERR boli významne upregulované liečbou CDP, nepozorovali sa žiadne vedľajšie účinky na organické tkanivá maternice a vagíny ako pri fytoestrogénovom účinku. Okrem toho liečba CDP významne posilnila kvalitu kostí u potkanov OVX, ktorá bola zhoršená chirurgickým zákrokom na ovariektómiu.

Okrem toho sa na vyjadrenie antiosteoporotického účinku použili aj hladiny P a Ca v moči a sére potkanov OVX a koncentrácie Ca a anorganického P boli zvyčajne závislé od hladín kalcitonínu a PTH [26]. V tejto štúdii, aj keď sa nezískali žiadne významné klesajúce alebo rastúce trendy v hladine vylučovania Ca, P v sére, Ca v sére a PTH u potkanov modelovej skupiny OVX, významné hladiny P a kalcitonínu v moči (p < {="" {1}}).="" v="" súlade="" s="" publikovanými="" údajmi,="" že="" nedostatok="" estrogénu="" spôsobený="" operáciou="" ovariektómie="" vždy="" viedol="" k="" zníženiu="" hladiny="" kalcitonínu="" v="" krvi,="" tento="" znížený="" sérový="" kalcitonín="" nakoniec="" viedol="" k="" zvýšeniu="" hladiny="" pth,="" kde="" sa="" ca2="" považovalo="" za="" hlavný="" regulátor="" sekrécie="" pth.="" pretože="" koncentrácia="" pth="" v="" tejto="" štúdii="" nevykazovala="" žiadny="" významný="" rozdiel="" medzi="" skupinami="" ovx="" a="" sham,="" hladina="" ca="" v="" sére="" aj="" v="" moči="" tiež="" nevykazovala="" žiadne="" zjavné="" zmeny="" medzi="" vyššie="" uvedenými="" skupinami.="" bola="" však="" dosiahnutá="" signifikantne="" klesajúca="" tendencia="" hladiny="" kalcitonínu="" medzi="" skupinami="" ovx="" a="" sham="" a="" následne="" sa="" obsah="" p="" v="" moči="" ovx="" výrazne="" znížil.="" verili="" sme,="" že="" vyššie="" uvedené="" údaje="" môžu="" vysvetliť="" protichodný="" jav,="" prečo="" vylučovanie="" hladiny="" ca="" v="" moči="" u="" potkanov="" ovx="" nevykazovalo="" žiadnu="" zjavnú="" zmenu="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" sham,="" a="" tento="" jav="" môže="" súvisieť="" aj="" so="" zvýšenou="" rýchlosťou="" kostného="" obratu="" [27].="" .="" po="" ošetrení="" cdp="" boli="" hladiny="" p="" a="" ca="" v="" sére="" výrazne="" zvýšené="" a="" obsah="" p="" v="" moči="" bol="" znížený="" u="" potkanov="" ovx,="" čo="" odrážalo,="" že="" cdp="" mohol="" nielen="" zabrániť="" vylučovaniu="" minerálnych="" prvkov="" z="" kostí,="" ale="" aj="" zvýšiť="" obsah="" séra="" týchto="" potkanov.="" prvkov,="" čím="" sa="" nepriamo="" potláča="" úbytok="" kostnej="">

Okrem toho sa na vysvetlenie základných antiosteoporotických mechanizmov CDP použili markery tvorby a resorpcie kostí, ako aj antioxidačné enzýmy vrátane SOD a GSH. Podobne ako v publikovaných údajoch, hladina ALP u potkanov modelovej skupiny OVX vykazovala neštatisticky významný stúpajúci trend, čo naznačuje zrýchlenú rýchlosť kostného obratu pri postmenopauzálnej osteoporóze [10]. Avšak po liečbe CDP (60, 120 a 240 mg/kg/deň) sa vlastnosť ALP významne zvýšila. Bolo dobre známe, že OVX spôsobil prudký pokles hladín estrogénu, ktorý zvyčajne vedie k nadmernej kostnej resorpcii a oxidačnému stresu [28], o čom svedčia hladiny TRAP, katepsínu K a DPD, ako aj MDA, ktoré sú výrazne zvýšené u potkanov Modelová skupina OVX. Tieto zhoršenia sa však čiastočne zlepšili zásahom CDP. Okrem toho liečba potkanov OVX pomocou CDP (60 a 240 mg/kg) preukázala významné zvýšenie aktivity GSH (p < 0="" 05).="" vyššie="" uvedené="" výsledky="" naznačujú,="" že="" cdp="" vykazovala="" terapeutický="" účinok="" na="" osteoporózu="" indukovanú="" ovx="" a="" tieto="" účinky="" boli="" tak="" zvýšením="" tvorby="" kosti,="" ako="" aj="" potlačením="" kostnej="" resorpcie,="" ako="" aj="" zlepšením="" kostného="" antioxidačného="">

Aktivácia RANK jeho ligandom RANKL stimulovala expresiu NFAT2 a c-Fos prostredníctvom signalizácie PI3K/AKT a NF-κB [29]. Ukázalo sa, že NF-KB je nevyhnutný pre osteoklastogenézu, pretože narušenie NF-KB by mohlo viesť k zhoršenej diferenciácii osteoklastov s osteoporotickým fenotypom a NF-KB upreguloval c-Fos a znížil expresiu NFAT2 počas osteoklastogenézy indukovanej RANKL/RANK/TRAF. Aby sa odhadol priaznivý vplyv CDP na osteoklastogenézu sprostredkovanú NFAT2 a c-Fos, analyzovali sa hladiny expresie RANKL a RANK. Očakáva sa, že CDP významne inhiboval NFAT2 a stimuloval hladiny c-Fos znížením expresie RANKL a RANK. Medzitým samotnému RANK chýbala vlastná kinázová vlastnosť, pokiaľ sa nepripojila TRAF6 na spustenie downstream signalizácie [3]. CDP tiež znížila expresiu TRAF6, čo viedlo k významnému zníženiu väzbových množstiev RANKL a RANK. Predpokladaný antiosteoporotický mechanizmus CDP na OVX potkanoch pokrýval vyššie uvedené signálne dráhy a regulátory boli opísané na obrázku 9. Stručne povedané, CDP znížila hladiny TRAF6, RANKL a RANK, čím potlačila následné signálne dráhy vrátane PI3K/AKT a NF-KB, ktoré sú spúšťané RANKL/RANK a nakoniec znížili expresiu a aktivity kľúčových osteoklastogénnych proteínov NFAT2 a c-Fos. Viaceré stopy údajov preto naznačovali priaznivý účinok CDP na kostný metabolizmus potkanov OVX najmä prostredníctvom dráh PI3K/AKT a NF-KB sprostredkovaných RANKL/RANK/TRAF{25}}.

5. Záver

Stručne povedané, celkové fenyletanoidové glykozidy, izolované z C. deserticola, vykazovali významné priaznivé účinky na postmenopauzálnu osteoporózu potkanov OVX a terapeutický potenciál pri potláčaní úbytku kostnej hmoty spočíval najmä v stimulácii tvorby kostí a inhibícii kostnej resorpcie, ako aj v zlepšení kostného antioxidantu systém; mechanizmy môžu súvisieť s RANKL/RANK/TRAF{0}}indukovanou aktiváciou NF-KB a inaktiváciou PI3K/AKT, ako aj so stimuláciou c-Fos a supresiou NFAT2, a napokon bola inhibovaná diferenciácia osteoklastov.

Skratky

AKT: Proteínkináza B

ALP: Alkalická fosfatáza

BGP: Kostný proteín GLA

BMC: Obsah minerálov v kostiach

CDP: fenyletanoidová glykozidová frakcia C. deserticola

CK: Cathepsin K

CT: Kalcitonín

DPD: deoxypyridinolín

ERR: Receptor alfa súvisiaci s estrogénom

EV: Estradiol valerát

GSH: Glutatión l-PTH: intaktný parathormón

MCSF: Faktor stimulujúci kolónie makrofágov

MDA: malondialdehyd

NFAT2: Jadrový faktor aktivovaných T buniek c2

NF-KB: jadrový faktor-kappa B

OPG: Osteoprotegerín

OVX: Ovariektómia

PhGs: fenyletanoidové glykozidy

PI3K: Fosfoinozitid 3-kináza

RANK: Aktivátor receptora jadrového faktora kappa B

RANKL: Aktivátor receptora jadrového faktora kappa

ROI ligandu B: Oblasť záujmu

SOD: Superoxiddismutáza

Tb. N: Trabekulárne číslo

Tb.Sp: Trabekulárna separácia

Tb.Th: Trabekulárna hrúbka

TČM: Tradičná čínska medicína

TMC: Obsah tkanivových minerálov

TMD: Hustota minerálov v tkanivách

TNF: Faktor nekrózy nádorov

TRAF6: Faktor 6 spojený s receptorom faktora nekrózy nádorov

TRAP: kyslá fosfatáza odolná voči tartrátom.

Dostupnosť údajov

Údaje použité na podporu zistení tejto štúdie sú na požiadanie k dispozícii od príslušného autora.

Konflikt záujmov

Autori nemali konflikt záujmov.

Príspevky autorov

XM navrhol a dohliadal na experimenty; SD a LY vykonali väčšinu experimentov a vypracovali rukopis; BZ a JL vykonali analýzu Western blot a zúčastnili sa pokusov na zvieratách; YD analyzoval údaje; QT a PY revidovali rukopis. Všetci autori rukopis recenzovali. Lingling Yang a Shuqin Ding prispeli k rukopisu rovnakým dielom.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená grantmi od Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), National Natural Science Foundation of China (č. 81560684), Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), Ningxia Key Research and Invention Program of Science and Technology Cooperation of the East and the West (č. 2017BY084 a 2017BY079) a West Light Foundation Čínskej akadémie vied – Young Scientists of West 2017.

Referencie

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane a BL Riggs, "Perspektíva. Koľko žien má osteoporózu?", Journal of Bone and Mineral Research, zv. 7, č. 9, s. 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham a SL Kates, „1-ročná úmrtnosť pacientov liečených v rámci programu zlomenín bedra pre starších ľudí“, Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, zv. 1, č. 1, s. 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew a EL Yong, "TRAF6 sprostredkováva potlačenie osteoklastogenézy a prevenciu úbytku kostnej hmoty vyvolanej ovariektómiou novým prenylflavonoidom," Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, č. 4, s. 846 – 860, 2017.

[4] JH Kim a N. Kim, "Regulácia NFATc1 pri diferenciácii osteoklastov," Journal of Bone Metabolism, zv. 21, č. 4, s. 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu a kol., "Antiosteoporotická aktivita a zložky Podocarpium podocarpus," Phytomedicine, zv. 22, č. 1, s. 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon a kol., "Kyselina protokatechuová zmierňuje stratu trabekulárnej kosti u myší po ovariektómii", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, zv. 2018, ID článku 7280342, 11 strán, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby a kol., "Rutín izolovaný z Chrozophora tinctoria zvyšuje proliferáciu kostných buniek a markery osifikácie", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, zv. 2018, ID článku 5106469, 10 strán, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon a T. Tong-un, „extrakt z listov Morindacitrifolia L. chráni pred cerebrálnou ischémiou a osteoporózou v experimentálnom modeli in vivo menopauzy, "Oxidative Medicine and Cellular Longevity, zv. 2018, ID článku 1039364, 13 strán, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura a W. Thukham-mee, "Antiosteoporotický účinok kombinovaného extraktu z Morus alba a Polygonum odoratum," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, zv. 2014, ID článku 579305, 9 strán, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao a X. Ma, „Syringín zabraňuje strate kostnej hmoty u myší po ovariektómii prostredníctvom TRAF6 sprostredkovanej inhibície NF-κB a stimulácie PI3K/AKT Fytomedicína, zv. 42, s. 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin a SJ Wang, "Echinacoside, aktívna zložka Herba Cistanche, potláča epileptiformnú aktivitu v hipokampálnych CA3 pyramidálnych neurónoch," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, zv. 22, č. 3, s. 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao a X. Ma, "Terapeutický účinok cistanozidu A na kostný metabolizmus ovariektomizovaných myší," Molecules, zv. 22, č. 2, str. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan a MI Georgiev, "Verbascoside – prehľad jeho výskytu, (bio)syntézy a farmakologického významu," Biotechnology Advances, zv. 32, č. 6, s. 1065–1076, 2014.

[14] Redakčný výbor Čínskeho liekopisu, liekopis Čínskej ľudovej republiky, China Medical Science and Technology Press, Peking, Čína, 10. vydanie, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li a kol., "Účinky tradičného čínskeho bylinného prípravku na osteoblasty a osteoklasty," Maturitas, zv. 61, č. 4, s. 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong a Q. Zhao, „Cynomorium songaricum zabraňuje resorpcii kostí u potkanov po ovariektómii prostredníctvom RANKL/RANK/TRAF6 sprostredkovanej supresie PI3K/AKT a NF-KB dráhy," Life Sciences, zv. 209, s. 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang a kol., "Kaempferitrin zabraňuje strate kostnej hmoty u potkanov po ovariektómii," Phytomedicine, zv. 22, č. 13, s. 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang a YW Cheng, „Posúdenie bezpečnosti výrobku zdravej výživy Cistanche tubulosa Memoregain®: genotoxicita a 28-dňový test toxicity po opakovanej dávke“, Food and Chemical Toxicology , zv. 118, s. 581 – 588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng a F. Chen, "Systematický prieskum antioxidačnej aktivity 30 čínskych liečivých rastlín pomocou testu antioxidačnej sily redukujúceho železo," Food Chemistry, zv. 97, č. 4, s. 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu a kol., "Cistanche deserticola polysacharid zoslabuje osteoklastogenézu a kostnú resorpciu prostredníctvom inhibície signalizácie RANKL a produkcie reaktívnych foriem kyslíka," Journal of Cellular Physiology, zv. 233, č. 12, s. 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang a W. Liang, "Vodný extrakt cistanches Herba ovplyvňujúci sérový BGP a TRAP a kostnú dreň Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA a TIEG1 Hladiny expresie mRNA pri osteoporóze," Molecular Biology Reports, zv. 40, č. 2, s. 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su a kol., "Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostí v osteoblastoch," Journal of Pharmacy and Pharmacology, zv. 64, č. 6, s. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong a Z. Huang, "Účinok vodného extraktu Cistanches Herba na stratu kostnej hmoty u potkanov po ovariektómii," International Journal of Molecular Sciences, zv. 12, č. 8, s. 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang a kol., "Antiosteoporotická aktivita echinakozidu u potkanov po ovariektómii," Phytomedicine, zv. 20, č. 6, s. 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian a LL Xu, "Antiosteoporotická aktivita icariínu u potkanov po ovariektómii," Phytomedicine, zv. 16, č. 4, s. 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed a M. Marzouk, "Možný antiosteoporotický mechanizmus extraktu Cicer arietinum u potkanov po ovariektómii," International Journal of Clinical and Experimental Pathology, zv. 8, č. 4, s. 3477–3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Biochemical markers of bone turnover," Clinica Chimica Acta, zv. 313, č. 1-2, s. 95 – 105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy a kol., "Ovariektómia indukuje oxidačný stres a zhoršuje kostný antioxidačný systém u dospelých potkanov," Clinica Chimica Acta, zv. 360, č. 1-2, str. 81 – 86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet a DL Lacey, "Osteoklastová diferenciácia a aktivácia," Nature, zv. 423, č. 6937, s. 337–342, 2003.