Benzylované dihydroflavóny a alkaloidy odvodené od izochinolínu z kôry Diclinanona Calycina (Annonaceae) a ich cytotoxicita

Pre viac informácií kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné: Diclinanona calycina RE Fries, ľudovo známy ako "enviro", je druh z čeľade Annonaceae endemický v Brazílii. V našom pokračujúcom hľadaní bioaktívnych zlúčenín z rastlín Annonaceae Amazonky bola kôra D.calycina skúmaná klasickými chromatografickými technikami, ktoré poskytli trinásť zlúčenín (alkaloidy a flavonoidy) po prvýkrát opísaných v D. calycina, ako aj v rode Diclinanona. Štruktúra týchto izolovaných zlúčenín bola stanovená rozsiahlou analýzou s použitím 1D/2D-NMR spektroskopie v kombinácii s MS. Izolované alkaloidy boli identifikované ako patriace do podtried: jednoduchý izochinolín, thali online (1); aporfín, anonaín (2); oxoaporfín, liriodenín (3); benzyltetrahydroizochinolíny, (S)-(plus)-retikulín(4); dehydro-oxonoretikulín (3,4-dihydro-7-hydroxy-6-metoxy-1-izochinolinyl)(3-hydroxy-4-metoxyfenyl)-metanón)(5 );(plus)-1S,2R-retikulín Ng-oxid (6); a (plus)-1S,2S-retikulín-N-oxid (7); tetrahydro protoberberín, koreximín (8); a pavín, bisnorargemonín (9). Kýmflavonoidypatria medzi benzylovanédihydroflavónyizohamnetín (10), dichamanetín (11) a zmes uvarinolu (12) a isouvarinolu (13). Zlúčenina 5 je po prvý raz v literatúre opísaná ako prírodný produkt. Cytotoxická aktivita hlavných izolovaných zlúčenín bola hodnotená proti rakovinovým a nerakovinovým bunkovým líniám. Spomedzi testovaných zlúčenín boli najsľubnejšie výsledky zistené pre benzylované dihydroflavóny dichamanetín (10) a zmes uvarinolu (12) a isouvarinolu (13), ktoré vykazovali miernu cytotoxickú aktivitu voči testovanýmrakovinová bunkalinky(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetín (11) vykazoval cytotoxickú aktivitu proti HL-60 a HCT116 s hodnotami IC50 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) a 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, zatiaľ čo zmes uvarinolu（12） a isouvarinolu (13) preukázala cytotoxickú aktivitu proti HL-60 s hodnotou IC5 9,74 ugs.mL-1 a HCT116 s IC50 hodnota 17,31 ug. ml-I. Tieto cytotoxické aktivity možno pripísať prítomnosti jednej alebo viacerých hydroxybenzylových skupín prítomných v týchto molekulách, ako aj polohe, v ktorej sú tieto skupiny spojené. Cytotoxické aktivity retikulínu, anonaínu a liriodenínu boli stanovené skôr, pričom liriodenín je najúčinnejšou zlúčeninou.

Kľúčové slová: Diclinanona calycina; alkaloidy a benzylované dihydroflavóny; cytotoxická aktivita

Kliknutím získate viac informácií o produktoch

1. Úvod

Annonaceae je veľká čeľaď tropických a subtropických stromov a kríkov, zahŕňajúca asi 112 rodov a 2440 druhov [1]. Niekoľko druhov je známych pre svoje jedlé plody a liečivé vlastnosti ]2]. Predchádzajúci fytochemický výskum niektorých druhov Annonaceae viedol k izolácii a charakterizácii rôznych tried sekundárnych metabolitov, ako sú monoterpény, diterpény, triterpény, lignany,flavonoidy, fenylpropanoidy odvodené od asarónu, acetogeníny a hlavne typické alkaloidy odvodené od izochinolínu [3-7]. Niektoré z týchto sekundárnych metabolitov izolovaných z druhov Annonaceae vykazovali dôležité biologické účinky, ako sú protizápalové vlastnosti a vlastnosti inhibujúce ureázu [8,9], trypanocídne [10,11], leishmanicídne [11,12], antimalariká [4,13]. , antimikrobiálne [4,14,15], antioxidačné a antireumatické účinky [9,15] a najmä cytotoxická aktivita proti rôznym ľudským nádorovým bunkovým líniám [4,6,11,16-21].

Hoci sa čeľaď Annonaceae považuje za primitívnu a dobre preštudovanú čeľaď, s jej druhmi sa vykonalo len málo fytochemických a/alebo farmakologických štúdií[3]. Fytochemické a/alebo farmakologické štúdie sa pre ich veľký ekonomický význam zamerali najmä na druhy rodov Annona, Asimina a Cananga a na niektoré druhy rodov Duguetia, Guatteria a Xylopia[5]. Napriek veľkému rastu za posledných 20 rokov v súvislosti s fytochemickými a farmakologickými štúdiami je počet skúmaných druhov stále veľmi malý v porovnaní s veľkým počtom uznaných druhov. V súčasnosti podľa vedeckých databáz Web of Science, Scopus a SciFinder iba asi 15 percent opísaných druhov Annonaceae má zodpovedajúcu fytochemickú a/alebo farmakologickú štúdiu.

Medzi málo prebádané druhy patria tie, ktoré patria do rodu Diclinanona Diels. Tento rod patrí do kmeňa Annoneae z podčeľade Annonoideae a vyskytuje sa iba v tropickej Južnej Amerike (hlavne v oblasti Amazonky). Je to rod pozostávajúci iba z troch druhov, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas a Diclinanona tessmannii Diels, ktoré sa vyskytujú ako stromy [22-24]. D.calycina (synonymia Xulopia calycina Diels) je 8 až 30 m vysoký strom, ľudovo známy ako „envireira“ a „enviro“, rozšírený po celom povodí Amazonky v Brazílii, Peru a Venezuele [23]. D.calycina je povrchovo podobná Xylopii pre svoje kvety s predĺženými a úzkymi okvetnými lístkami, ale odlišná je pre svoje drevnaté, neopadavé, guľovité a hrubostenné monokarpy [23,24].

Predchádzajúce štúdie s D. calycina uvádzajú iba farmakologické štúdie. Prvá štúdia popisuje skúmanie antimikrobiálnej aktivity metanolových, chloroformových a vodných extraktov proti mikroorganizmom Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus a Candida albicans pomocou gélovo-difúznej metódy [25]. V druhej sa uvádza skúmanie antimikrobiálnej aktivity organických (dichlórmetán:metanol 1:1) a vodných extraktov proti mikroorganizmu Enterococcus faecalis pomocou mikrodilučného bujónového testu (MDBA) a diskového difúzneho testu (DDA)[26]. V našom neustálom hľadaní nových bioaktívnych prírodných produktov z Annonaceae z amazonského dažďového pralesa sa táto štúdia zamerala na skúmanie fytochemických a farmakologických vlastností kôry D.calycina. V tejto správe je trinásť zlúčenín (deväť alkaloidov a štyri benzylovanédihydroflavóny) boli izolované a prvýkrát identifikované v D.calycina, ako aj v rode Diclinanona. Okrem toho sa skúmala cytotoxicita hlavných zlúčenín proti B16-F10, HepG2, K562 a HL{{ 4}} nádorové bunkové línie s použitím testu Alamar blue.

2. Výsledky a diskusia

2.1. Štrukturálne objasnenie zlúčenín

Po zistení prítomnosti zlúčenín obsahujúcich dusík v metanolickom extrakte s použitím Dragendorffovho činidla bol tento podrobený acidobázickej úprave podľa metodiky Costa et al. [12] výsledkom sú alkaloidné a neutrálne frakcie. V alkaloidnej frakcii, ktorá bola podrobená chromatografickej analýze, bola pozorovaná vysoká koncentrácia zlúčenín obsahujúcich dusík. Postupné chromatografické separácie, ako je opísané v časti Extrakcia a izolácia, viedli k izolácii a identifikácii trinástich chemických zložiek (1-13, obrázok 1), deviatich alkaloidov odvodených od izochinolínu 1-9 a štyroch benzylovaných dihydroflavónov 10-13. Štruktúry týchto izolovaných zlúčenín (obrázok 1) boli stanovené rozsiahlou analýzou s použitím 1D a 2D NMR spektroskopie v kombinácii s MS (doplnkové údaje), ako aj porovnaním s údajmi z literatúry.

Zlúčenina 5 sa získala ako hnedý amorfný prášok a testovala sa pozitívne na Dragendorffovo činidlo. Ukázala protónovanú molekulu pri m/z328 [M plus H]' v LR-ESI(plus)MS-kompatibilnom s molekulovým vzorcom C18H1NO5. 'H a 13C-NMR spektrá zlúčeniny 5 (tabuľka 1) boli v súlade so spektrom retikulínu (4)[27, s výnimkou neprítomnosti metylovej skupiny viazanej na dusík (CH3-}N) a signálu metínová skupina v polohe 1, ktorá bola nahradená signálom pri 8c 165,1 v typickom 13C-NMR spektre imínovej skupiny konjugovanej s karbonylovou skupinou pri bc 192,8. V 'H-NMR spektre, tri vodíky smerom dole pri 8H 6,88（1H,d, J=8,4 Hz, H-5'）,5H7,57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）a δH 7,60（1H, dd, J=8,4 a 2,0 Hz, H-6'） odhalili prítomnosť ABX spojovacieho systému. Dva singletové signály pri6H 6,90(1H,s,H-8) a 6,71(1H,s,H-5) indikovali prítomnosť 1,2,4,5-tetrasubstituovaného fenylového kruhu. Okrem toho H-NMR spektrum 5 tiež ukázalo signály pre dve metoxyskupiny rezonujúce pri bH 3,93 (3H, s) a 6H 3,95 （3H,s） a signály pre dve metylénové skupiny rezonujúce pri 5μ 2,79（2H,t, J=7,8 Hz） a 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Hz), pripísané H-4 a H-3, v tomto poradí (tabuľka 1) . Tieto údaje naznačujú, že alkaloid 5 má benzyltetrahydroizochinolínový skelet [28-30].

Tieto skupiny boli vytvorené na základe dvoj- a trojväzbovej 'H-13korelačnej mapy z experimentu HMBC-NMR (obrázok 2 a tabuľka 1). Táto analýza odhalila, že vodík pri δH 3,89 （H-3）ukázal trojpásmovú 'H-13C koreláciu s uhlíkmi pri 6c130.1（4a） a δc165.{101} {42}}（C-1）a dvojväzbová lH-13C korelácia s uhlíkom atδc 25,4(C-4), čo potvrdzuje prítomnosť imínovej skupiny v molekule. Na druhej strane signály pri δH 7,57 （H-2'） a δH 7,60（H-6'）ukázali trojväzbovú lH-13C koreláciu s uhlíkmi pri δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）a δc192,8（C-7） a 5c116,0（C-2'）,6c 151,4 (C-4') a c 192,8(C-7'), v tomto poradí, čím sa vytvorí karbonylová skupina v molekule (obrázok 2 a tabuľka 1). Preto, na základe týchto NMR údajov, zlúčenina 5

vznikol ako benzyltetrahydroizochinolínový alkaloid 34-dihydro-7-hydroxy-6-metoxy-1-izochinolinyl)(3-hydroxy-4-metoxyfenyl)metanón, ktorý bol pomenovaný ako dehydro-oxonorretikulín. Tento alkaloid je v literatúre po prvýkrát opísaný ako prírodný produkt. Jeho prvý a jediný záznam opísali Dörnyei et al. v roku 1982 【31】 ako produkt syntetického pôvodu. Iba 'H-NMR údaje sú opísané s určitými neurčenými násobkami. Kompletné priradenia pre všetky 1H- a 13C-NMR chemické posuny boli teda stanovené jednoväzbovými (HSOC) a dvoj- a trojväzbovými (HMBC)' H-13C-NMR korelačnými experimentmi a boli opísané v Stôl 1.

Zlúčeniny 6 a 7 boli identifikované ako benzyltetrahydroizochinolínové alkaloidy (plus)-1S,2R-retikulín-N-oxid, respektíve (plus)-1S,2S-retikulín-N-oxid. Údaje H-NMR týchto alkaloidov sa porovnali s údajmi opísanými v Lee et al. [28]s použitím rovnakého deuterovaného rozpúšťadla (CD3OD) a pozorovali sa určité nezrovnalosti (tabuľka 1), najmä vo vzťahu k H-1, H-8 a H, C-NO. V literatúre nie sú pre tieto alkaloidy opísané žiadne13C-NMR údaje. Na základe obmedzených údajov 1H- a 13C-NMR, ako aj nejednoznačností pozorovaných pre tieto molekuly, sa uskutočnili experimenty 'H a 13C 1D a 2D NMR, aby sa určilo ich správne priradenie a multiplicita.

Správna poloha vodíka H{{0}} a H-1 oboch izomérov 6 a 7 bola stanovená na základe trojväzbovej 'H-13C korelačnej mapy z HMBC -NMR experiment (obrázok 2). Pre izomér 6 analýza odhalila, že vodík pri δH 5,78（H-8）ukázal trojväzbovú 'H-13C koreláciu s uhlíkmi pri 6c 79,8（C-1）,δc120 0,6（4a） a δc 149,4 （C-6）, zatiaľ čo vodík pri δH 4,13 （H-1）ukázal trojväzbovú 'H-13C koreláciu s uhlíkmi pri c 60,7（C-3）,6c 115,7（C-8）,δc 120,6（C-4a） a 131,2 （C-1'）, čím sa správne polohy vodíkov H-8 a H-1 pre izomér 6. Toto prisúdenie môže byť ďalej potvrdené analýzou vodíka pri δH 6,76（H-5）, ktorá ukázala tri väzby H-13C korelácia s uhlíkmi priδc 27,0（C-4）,δc 127,1（C-8a） a δc 145,7 （C-7））））. Pre izomér 7 analýza odhalila, že vodík pri δH 6,30 （H-8）ukázal trojväzbovú 'H-13koreláciu s uhlíkmi pri δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a） a δc 148,9 （C-6）, zatiaľ čo vodík pri δH 4,46 （H-1）ukázal trojväzbové H-13C korelácie s uhlíkmi pri δc-6） {82}}）,5c 115,5（C-8）, bc 122,8（C-4a） a 131,4（C-1'）, čím sa určia správne polohy vodíkov H -8 a H-1 pre izomér 7. Táto atribúcia bola potvrdená aj analýzou vodíka pri δH 6,71 （H-5）, ktorá ukázala trojväzbové lH-13C korelácie s uhlíkmi pri δc26,3（C-4）, δc 126,9（C-8a） a 6c 146,1（C-7）(obrázok 2). Uskutočnil sa aj experiment NOESY na stanovenie správnej stereochémie izomérov 6 a 7. V tomto experimente silná korelácia NOE medzi H-1（δH 4,13）a H, CN(5 3.15) indikovala -orientácia kyslíka v izoméri 6. Na druhej strane, v experimente 2D-NOESY pre 7 nebolo možné nájsť žiadnu zjavnú koreláciu NOE medzi H-1(6H 4,46) a HAC-N(5H 3,20), čo ukazuje orientáciu kyslíka v izoméri 7 (obrázok 2). Tieto malé rozdiely v chemických posunoch týchto izomérov sú jasne pozorované v dôsledku stereochémie dusíka ovplyvneného polohami a kyslíka. Porovnania 'H- a 13C-NMR údajov získaných pre zlúčeniny 6 a 7 s údajmi molekúl s blízkymi štruktúrami, ako je hexapetalín A a hexapetalín B [30] podporujú údaje opísané v tabuľke 1 bez nejednoznačnosti.

Zlúčeniny 1-4 a 8-13 boli identifikované ako talifolín (1) [32], anonaín (2) [33]liriodenín (3)[10,34], (S)-(plus)-retikulín ( 4)[27], koreximín (8) [34,35], bisnorargemonín (9)[36], izochamanetín (10) [37], dichamanetín (11) [37] a zmes uvarinolu (12) a isouvarinolu (13) [37] na základe ich spektroskopických profilov a porovnania s hodnotami v literatúre. 1H- a 13C 1D a 2D-NMR spektrá, ako aj hmotnostné spektrá všetkých izolovaných zlúčenín, sú dostupné ako doplnkové materiály.

Z pohľadu chemofenetiky (nový termín pre rastlinnú chemosystematiku/chemotaxonómiu rastlín) je dôležité poznamenať, že prítomnosť C-benzylovaných flavanónov a C-benzylovaných dihydrochalkónov sú špeciálnym typom flavonoidov odvodených od dobre známeho flavanónového pinocembrínu. a boli opísané najmä u druhov rodu Uoaria patriacich do čeľade Annonaceae [3,38-42]. Prítomnosť týchto zlúčenín v D. calycina naznačuje úzke chemofenetické vzťahy s Uoaria. Na druhej strane by sa mali vykonať ďalšie výskumy s inými časťami rastliny, ako aj s inými druhmi Diclinanona, aby sa potvrdil tento chemofenetický vzťah. Flavanóny a chalkóny sú rozšírené vo vyšších rastlinách, ale pridanie benzylových skupín je dosť zriedkavé a zdá sa, že je obmedzené v Annonaceae na rod Uoaria [3,39-42] a teraz na rod Diclinanona. Benzylové skupiny pravdepodobne vznikajú z C6-C1 dráhy, ale o-hydroxyfunkčná skupina je nezvyčajná. Neprítomnosť substituentov v B-kruhu vo všetkých týchto flavonoidoch Uoaria a Diclinanona môže byť spojená s predchádzajúcim pozorovaním týkajúcim sa flavonoidov Popowia cauliflora [38].

Alkaloidy odvodené od izochinolínu izolované a opísané v tejto práci už boli zaregistrované u niekoľkých druhov Annonaceae v rôznych rodoch. Niektoré z nich, ako napríklad liriodenín a anonaín, sa považujú za chemofenetické markery a prítomnosť týchto alkaloidov v D.calycina ďalej posilňuje vzťah týchto chemofenetických markerov v čeľade Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Stojí za zmienku, že podľa Zidorna [44] sú chemofenetické štúdie definované ako štúdie, ktorých cieľom je opísať súbor špecializovaných sekundárnych metabolitov v danom taxóne, ako už bolo pozorované v niekoľkých publikovaných prácach [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Chemofenetické štúdie teda prispievajú k fenetickému popisu taxónov, podobne ako anatomické, morfologické a karyologické prístupy, ktoré už boli uznané za veľmi dôležité pre vytvorenie „prirodzených“ systémov a ktoré majú naďalej mimoriadny význam pre popis klasifikovaných organizmov pomocou moderných molekulárnych metód [44].

2.2. Cytotoxický test

In vitro cytotoxická aktivita izolovaných zlúčenín (tabuľka 2), s výnimkou zlúčenín 2, 3, 5 a 8 (v dôsledku ich nízkeho výťažku), sa hodnotila protirakovinová bunkalínie HL-60 (ľudská promyelocytická leukémia), MCF-7 (ľudský adenokarcinóm prsníka), HepG2 (ľudský hepatocelulárny karcinóm), HCT116 (ľudský karcinóm hrubého čreva) a nerakovinová bunková línia MRC{5} } (ľudský pľúcny fibroblast) s použitím testu Alamar blue po 72 hodinách inkubácie.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetín (11) vykazoval cytotoxickú aktivitu proti HL-60 a HCT116 s hodnotami IC50 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1） a 18,99 ug·mL-1）(40,56 umol.L-1）). Zmes uvarinolu (12) a isouvarinolu (13) preukázala cytotoxickú aktivitu proti HL-60 s hodnotou ICs0 9,74 ug∶mL-1 a HCT116 s hodnotou ICs0 17,31 ug∶mL{ {30}}. Spomedzi benzylovaných dihydroflavónov iba izohamnetín (10) vykazoval cytotoxickú aktivitu proti HepG2 s hodnotou IC50 19,79 ugs:mL-1 (54,65 umol.L-1). Podľa literatúry sú benzylované dihydroflavóny opísané s cytotoxickými vlastnosťami [39-42]. Spomedzi tých, ktoré sú opísané v tejto práci, sú izohamnetín (10), dichamanetín (11) a uvarinol (12) opísané v rámci vitro cytotoxických vlastností proti ľudským nádorovým bunkovým líniám karcinómu nosohltanu (KB) a P-388 lymfocytovej leukémie (PS) s hodnotami IC50 5,3 a 4,1, 4,8 a 1,8 a 5,9 a 9,7 ug.mL-1, v uvedenom poradí [39,40]. Tieto rôzne aktivity možno pripísať prítomnosti jednej alebo viacerých hydroxybenzylových skupín prítomných v molekulách, ako aj polohe, v ktorej sú tieto skupiny spojené. Na potvrdenie tohto pozorovania je však potrebné ďalšie skúmanie.

In vitro cytotoxickú aktivitu alkaloidov odvodených od izochinolínu anonaínu (2), líri-adenínu (3) a (S)-(plus)-retikulínu (4) nedávno opísali Menezes et al.[2{{16] }}], Souza a kol. [6] a Costa a kol. [43] s dôrazom na liriodenín, ktorý preukázal silnú cytotoxickú aktivitu proti rakovinovým bunkovým líniám B{{10}}}F10 (myší melanóm), HepG2 (ľudský hepatocelulárny karcinóm), HL{{13 }} (ľudská promyelocytická leukémia) a K562 (ľudská chronická myelocytová leukémia） s hodnotami IC5s0 nižšími ako 10,0 μmol.L-1【43】). Anonaín vykazoval miernu aktivitu proti B16-F10, HepG2, HL a K562 s hodnotami IC50 nižšími ako 19,0 umol.L-1[20]. (S)-(plus)-Retikulín vykazoval miernu aktivitu iba proti HepG2 s hodnotami IC50 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Materiály a metódy

3.1. Všeobecné experimentálne postupy

Optické rotácie v metanole (MeOH) sa zaznamenávali pomocou P{{0}}} polarimetra (Jasco, Tokio, Japonsko) pri 589 nm. 1D a 2D NMR experimenty boli získané v CDCI. (chloroform-d) alebo CDCI plus kvapka CD, OD (metanol-du a CD, COCD3 (acetón-d6) pri 298 K na AVANCE I HD NMR spektrometri (Bruker, Billerica, MA, USA) pracujúcom pri 11,75 T (Hand 13C pri 500 a 125 MHz, v tomto poradí) a na NMR spektrometri Bruker AVANCE I 600 pracujúcom pri 14,1 T('H a13Cat 60{ {63}} a 150 MHz). Všetky 1H- a13C-NMR chemické posuny （δ）sú uvedené v ppm relatívne k signálu tetrametylsilánu pri 0.00 ppm ako interná referencia a väzbové konštanty (D) sú uvedené v Hz. NMR spektrometer bol vybavený 5-mm viacjadrovou inverznou detekčnou sondou (1D a 2D NMR experimenty) s gradientom z. Jedna väzba (HSQC) a dva a trojväzbové (HMBC)1H-13C-NMR korelačné experimenty boli optimalizované pre priemernú interakčnú konštantu' JcH a LRJ(cH 140 a 8 Hz, v tomto poradí. Pre analýzu hmotnostnej spektrometrie s nízkym rozlíšením (LC-MS) vzorky izolovaných zlúčenín sa resuspendovali v metanole (čistota pre HPLC), čím sa vytvorila zásobná látka k roztokov (1 mg·ml-1). Alikvóty (5 ul) zásobných roztokov sa ďalej zriedili na 5 ug.ml a analyzovali sa priamou infúziou do trojitého štvorpólového hmotnostného spektrometra, model TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), vybaveného elektrosprejovou ionizáciou. (ESI) alebo zdroje chemickej ionizácie pri atmosférickom tlaku (APCI). Podmienky ESI-MS: rozprašovacie napätie, 5 kV; plášťový plyn, 10 ľubovoľných jednotiek (arb); pomocný plyn, 5arb;sweep plyn,0arb;teplota kapiláry, 250 stupňov; kapilárne napätie,40 V;trubicová šošovka, 70 V;hmotnostný rozsah, m/z 100 až 1000.APCI-MS podmienky: výbojový prúd,5 μA; teplota výparníka, 350 stupňov; tlak plynu v plášti,25 ľubovoľná jednotka （arb）; tlak iónového plynu, 0,0 arb; tlak pomocného plynu, 10 arb; kapilárna teplota, 250 °C; ofset tubusovej šošovky, 70 V; ofset skimmeru,0 V; hmotnostný rozsah, m/z 100 až 1000. Ako kolízny plyn sa použil argón a MS/MS spektrá sa získali s použitím kolíznych energií v rozsahu od 25 do 30 eV. Na kolónovú chromatografiu (CC) sa použil silikagél 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA, 70-230 mesh), zatiaľ čo silikagél 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Nemecko, 0,25 mm, hliník) bol použitý na analytickú a preparatívnu chromatografiu na tenkej lavete (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, sklo). Zlúčeniny boli vizualizované expozíciou pod UV254/365 svetlom, nástrekom p-anizaldehydovým činidlom s následným zahrievaním na horúcej platni a nástrekom Dragendorffovho činidla.

3.2. Rastlinný materiál

V tomto vyšetrovaní bol botanický materiál (kôra) D.calycina zozbieraný 27. mája 2017 v rezervácii Adolpho Ducke (geografické súradnice: 02 stupeň 53'36.1S a 59. stupeň 58'28.9"W), Manaus, štát Amazonas Antonio Carlos Webber, rastlinný taxonóm z Katedry biológie Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM). Poukážkový exemplár číslo 10 810 bol uložený v Herbári DB/UFAM. prístup (exemplár) bol zaregistrovaný v Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) so záznamom A70EDCD.

3.3. Extrakcia a izolácia

Kôra D.calycina sa najskôr sušila pri izbovej teplote počas 24 hodín a potom sa sušila v sušiarni s cirkuláciou vzduchu počas 48 hodín pri teplote 40 stupňov a následne sa rozdrvila v mlynčeku so štyrmi nožmi (Marconi, Piracicaba, SP , Brazília), čím sa získa práškový materiál (1340 g). Potom sa uskutočnila vyčerpávajúca macerácia s hexánom (8 x 4 1) nasledovaná MeOH (8 x 4 1). Získané extrakčné roztoky sa skoncentrovali na rotačnej odparke pri zníženom tlaku (40-50 stupeň), čím sa získali hexánové (24,85 g) a MeOH (199,43 g) extrakty.

TLC analýza odhalená Dragendorffovým činidlom ukázala vysokú prítomnosť alkaloidov v MeOH extrakte. Preto sa alikvot MeOH extraktu (188,3 0 g) najprv podrobil acidobázickej extrakcii, čím sa získali alkaloidné (5,46 g) a neutrálne (4,47 g) frakcie. Následne sa časť alkaloidnej frakcie (5,{56}}g) podrobila chromatografickej kolóne na silikagéli (CC), predtým upravenej 10-percentným roztokom NaHC03 [12], elúciou hexánom (100 %), hexánom-CHCI, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 a 10:90, obj./obj.), CH2CI2 (100 percent), CH2CI 2-EtOAc (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 a 10:90,0/u), EtOAc (100 percent), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 a 10:90, obj./o) a nakoniec MeOH, čím sa získa 250 frakcií (každá po 30 ml). Po TLC vyhodnotení s použitím zmesi CH2Cl2-MeOH v pomeroch 95:05, 90:10, 85:15 a 80:20 ako elučný systém (v/o), podobné vzorky sa spojili, čím sa získalo 16 frakcií (F1 až F16).

Frakcia F5 (181,2 mg) z počiatočnej CC eluovaná zmesou hexán-CH2C12 (50:50 až 10:90, obj./obj.) sa podrobila novému silikagélu C s rovnakou metodikou ako je uvedené vyššie a eluovala sa hexánom (100 percent), hexánom. -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 a 10:90,obj./o), CH,Cl ,(100 percent), CHCI2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 a 10:90 o/), EtOAc (100 percent), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 a 15:85, /o) a MeOH (100 percent), čím sa získa 118 frakcií ( po 15 ml), ktoré boli spojené do 12 podfrakcií (F5.1 až F5.12), podľa vyhodnotenia TLC analýzy s použitím zmesi CH2Cl2-MeOH v pomeroch 95:05 a 90:10. Subfrakcia F5 1 (28,9 mg) eluovaný hexánom (100 percent) sa podrobil preparatívnej TLC eluovanej CH,Cl-MeOH (95:05, obj./obj., dve elúcie), čím sa získali 2 (1,4 mg) a 3 (1,7 mg). resp. Subfrakcie F5.4 (21,5 mg) eluované zmesou hexán-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) eluované zmesou hexán-CH,Cl(80:20,70:30,60;40 a 50:50 ,v/) a F5.6 (15,4 mg) eluované hexánom-CHCl2 (50:50, 40:60 a 30:70, obj./o) sa spojili (53,6 mg) a tiež sa podrobili preparatívnej TLC eluovanej s CH,Cl-MeOH (95:05, obj./obj., dve elúcie), čím sa získa zlúčenina 3 (8,9 mg).

Frakcia F6(20}99,1 mg) z počiatočnej CC eluovaná zmesou hexán-CHCl(10:90,obj.)), CH2CI, (10}0 percent) a CH,Cl2-EtOAc (90:10 až 10:90, o/o) sa podrobil novému silikagélu CC s použitím rovnakej metodológie uvedenej vyššie a eluoval sa rovnakými systémami rozpúšťadiel, čím sa získalo 140 frakcií (30 každý ml). Po vyhodnotení TLC s použitím zmesi CH2Cl2-MeOH v pomeroch 95:05, 90:10 a 85:15 ako elučného systému (o/o) sa podobné vzorky spojili, čím sa získalo 13 subfrakcií (F6 .1 až F6.13). Subfrakcia F6.6 (1541,3 mg) sa podrobila novému silikagélu CC s použitím rovnakej vyššie uvedenej metodiky eluovanej s rovnakými systémami rozpúšťadiel, čím sa získalo 120 frakcií (každá po 30 ml), ktoré sa analyzovali pomocou TLC (použitím rovnakej metodiky vyššie), čím sa získalo 12 nových podfrakcie (F6.6.1 až F6.6.12). Subfrakcia F6.6.2 (17,0 mg) eluovaná zmesou hexán-CH,Cl, (60:40 a 50:50, obj./obj.) sa podrobila preparatívnej TLC eluovanej CH2CI2-MeOH (90:10, v/o, jedna elúcia), čo vedie k 3 (1,4 mg). Subfrakcia F6.6.3 (643,3 mg) eluovaná zmesou hexán-CH2CI2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 a 10:90, o/v), CH2CI2 (100 percent) a CH2CI2-EtOAc (90:10 a 80:20,o/o) sa podrobil preparatívnej TLC eluovanej CH2CI2-MeOH (90 :10, vfo, jedna elúcia) poskytujúca novú podfrakciu F6.6.3.1 (161,8 mg), ktorá sa podrobila novej preparatívnej TLC eluovanej zmesou EtOAc-MeOH (90:10, obj./o, jedna elúcia), čím sa získala zlúčenina 4(148,2 Subfrakcia F6.6.4 (90,2 mg) eluovaná CH2CI2-EtOAc (70:30 a 60:40, o/o) sa podrobila preparatívnej TLC eluovanej CH2CI-MeOH (90:10, v/o, jedna elúcia), čím sa získa 1 (1,4 mg) a 4 (50,1 mg). Subfrakcia F6.6.5 (83,4 mg) eluovaná CH,Cl-EtOAc (60:40 a 50:50, o/o) sa tiež podrobila preparatívnej TLC eluovanej CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, jedna elúcia), čím sa opäť získa 1 (1,5 mg) a 4 (45,5 mg). Subfrakcia F6.6.6 (101,4 mg) eluovaná CH,Cl{2-}EtOAc (50:50 a 40:60, obj./)) sa podrobila preparatívnej TLC eluovanej zmesou CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, jedna elúcia, čím sa získa zlúčenina 8 (3,4 mg) a ďalšia podfrakcia F6.6.6.1 (48,8 mg). Táto podfrakcia (F6.6.6.1) sa podrobí preparatívnej TLC a najprv sa eluuje zmesou EtOAc-MeOH (85 :15, obj., jedna elúcia) a následne CHCl-MeOH (90:10, obj./obj., jedna elúcia), čím sa opäť získa 4 (37,4 mg). Pre tento postup sa chromatografická platňa najskôr eluovala mobilnou fázou EtOAc-MeOH (85:15, obj./o, jedna elúcia). Po tejto elúcii sa chromatografická platňa vysušila, aby sa odstránilo rozpúšťadlo a následne sa podrobila novej elúcii mobilnou fázou CH,Cl,-MeOH (90:10, obj., jedna elúcia), čím sa získala 4. Subfrakcia F6.6.7 ( 109,0 mg) eluovaného CH,Cl2-EtOAc (40:60, 30:70, 20:80 a 10:90, vfo) sa podrobilo preparatívnej TLC eluovanej CH,Cl2-MeOH (90:10, obj., jedna elúcia), čím sa získa ďalšia podfrakcia F6.6.7.1 (24,8 mg), ktorá sa podrobí novej preparatívnej TLC eluovanej spočiatku zmesou EtOAc-MeOH (85:15, obj./o, jedna elúcia) a následne CH2CI2-MeOH (90:10, objemovo, jedna elúcia), čím sa získa zlúčenina 9 (11,1 mg). Izolačný postup použitý pre 9 bol rovnaký ako predtým opísaný pre 4. Subfrakcia F6.6.10 (92,0 mg) eluovaná EtOAc-MeOH (60:40 a 50:50, obj./o) sa podrobila preparatívnej TLC eluovanej CH, Cl,-MeOH (90:10, obj., jedna elúcia), čím sa získa 5 (1,7 mg) a 6 (7,8 mg). Subfrakcia F6.6.11 (326,0 mg) eluovaná EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80 a 10:90, obj./obj.) sa podrobila preparatívnej TLC eluovanej CHCI- MeOH (90:10, obj./o, jedna elúcia), čím sa získa 1 (2,4 mg) a 7 (12,5 mg).

Frakcia F7 (692,4 mg) z počiatočnej CCeluovanej s EtOAc (100 percent) a CHCI2-EtOAc (95:05, 90:10, 85:15 a 75:25, ofo) sa podrobila novému silikagélu CPoužitie rovnakej metodiky, ako je opísaná pre počiatočnú CC s rovnakými systémami rozpúšťadiel poskytujúcimi 110 frakcií (každá po 30 ml). Po TLC vyhodnotení pomocou zmesi CH2Cl2-MeOH v pomeroch 95:05, 90:10 a 85 :15 ako elučný systém (o/o), podobné vzorky sa spojili, čím sa získalo 12 subfrakcií (F7.1 až F7.12). F7.8 (147,4 mg) eluované CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 a 30:70, obj. percent) sa podrobil preparatívnej TLC s elúciou CHCl-MeOH (95:05, vfo, jedna elúcia), čím sa získali 10 (5,4 mg) a 11( 120,6 mg). F7.9 (144,2 mg) eluovaný CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 a 10:90, obj. percentá) sa tiež podrobil preparatívnej TLC eluovanej CH,Cl,-MeOH( 95:05, vo, jedna elúcia), čím sa získa zlúčenina 11 (91,2 mg) a zmes zlúčenín 12 a 13 (39,4 mg).

Thalifolín (1): hnedý amorfný prášok;' H-NMR a13C-NMR v súlade s literatúrou [32]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H]* plus m/z 208.

Anonaín (2): Hnedý amorfný prášok; 1H-NMR a 13C-NMR v súlade s literatúrou [33]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 266.

Liriodenín (3): žlté kryštály (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR a13C-NMR v súlade s literatúrou [10,34]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 276.

(S)-(plus)-Retikulín(4): Hnedý amorfný prášok; []p25 plus 71,60(c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR a 13C-NMR v súlade s literatúrou [27; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 30.

3,4-dihydro-7-hydroxy-6-metoxy-1-izochinolinyl)(3-hydroxy-4-metoxyfenyl)-metanón (dehydro-oxonorretikulín)(5 ): hnedý amorfný prášok; 'H a13C-NMR dáta, pozri tabuľku 1; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

(plus){{0}}S,2R-retikulín-N-oxid(6): hnedý amorfný prášok; [lp25 plus 136,4 (c 0,146 g/100 ml, MeOH); 1Hand13C-NMR údaje, pozri tabuľku 1;LR-APCI(plus)-MS [M plus H] plus m/2346

(plus){{0}}S,2S-N.-oxid retikulínu (7): hnedý amorfný prášok; []p25 plus 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH);'H a13C-NMR údaje, pozri tabuľku 1;LR-APCI(plus)-MS [M plus H] plus m/z346.

Coreximin (8): svetložltý amorfný prášok;[]p25 plus 201,1(c 0,08g/100ml, MeOH)'H-NMR a 13C-NMR v súlade s literatúrou[34,35];LR- ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

Bisnorargemonín (9): hnedý amorfný prášok; 1H-NMR a 13C-NMR v súlade s literatúrou [36]; LR-APCI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

izochamanetín (10): svetložltý amorfný prášok; [p25-12.4(c 0,5 g/100 ml, MeOH)1H-NMR a 13C-NMR v súlade s literatúrou [37; LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetín (11): Žltý amorfný prášok;[]D25-10.7(c 0.5g/100 ml, MeOH);1H-NMR a13C-NMR v súlade s literatúrou [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Zmes uvarinolu (12) a isouvarinolu (13): žltý amorfný prášok; H-NMR a13C-NMR v súlade s literatúrou [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4 Cytotoxický test in vitro

3.4.1. Bunky

HL-60 (ľudská promyelocytová leukémia), MCF-7 (ľudský adenokarcinóm prsníka), HepG2 (ľudský hepatocelulárny karcinóm), HCT116 (ľudský karcinóm hrubého čreva) a MRC-5 (ľudský pľúcny fibroblast) bunkové línie sa získali z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) a kultivovali sa podľa odporúčania sprievodcu ATCC pre kultiváciu zvieracích buniek. Všetky bunkové línie boli testované na mykoplazmu s použitím súpravy na farbenie mykoplazmy (Sigma-Aldrich), aby sa overilo použitie buniek bez kontaminácie.

3.4.2. Test cytotoxicity

Pre test cytotoxicity bola životaschopnosť buniek kvantifikovaná metódou Alamar blue, ako už bolo opísané [{{0}}]. Pre všetky experimenty boli bunky nanesené na 96-jamkové platne. Chemické zložky sa rozpustili v dimetylsulfoxide (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazília) a pridali sa do každej jamky a inkubovali sa 72 hodín. Doxorubicín (doxorubicín hydrochlorid, čistota väčšia alebo rovná 95 percentám, laboratórium IMA SAIC, Buenos Aires, Argentína) sa použil ako pozitívna kontrola. Na konci liečby sa 20 μl zásobného roztoku (0,312 mg/ml) resazurínu Do každej jamky sa pridal (Sigma-Aldrich Co.) Absorbancie pri 570 nm a 600 nm sa merali pomocou SpectraMax190 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). s 95-percentnými intervalmi spoľahlivosti (CI95 percent) pomocou softvéru GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, USA).

4. Závery

Fytochemický výskum kôry D.calycina viedol k izolácii a identifikácii trinástich zlúčenín (1-13); deväť alkaloidov odvodených od izochinolínu (1-9) a štyriflavonoidy(10-13). Alkaloidy patria do nasledujúcich podtried: jednoduchý izochinolín, thali online(1);aporfín, anonaín (2); oxoaporfín, liriodenín (3); benzyl-tetrahydroizochinolíny, (plus)-retikulín(4), dehydrooxonoretikulín(3,4-dihydro-7-hydroxy-6-metoxy-1-izochinolinyl)({{13} }hydroxy-4-metoxyfenyl)-metanón)(5), 1S,2R-retikulín-Ng-oxid (6) a 1S,2S-retikulín-N.-oxid (7); tetrahydroprotoberberín, koreximín (8); a pavín, bisnorargemonín (9). Zatiaľ čo flavonoidy patria medzi benzylované dihydroflavóny, izohamnetín (10), dichamanetín (11) a zmes uvarinolu (12) a izouvarinolu (13). Izolované zlúčeniny sú po prvýkrát opísané v D.calycina, ako aj v rode Diclinanona.

Cytotoxická aktivita izolovaných zlúčenín (okrem anonaínu, liriodenínu, 1,2-dihydro-oxonorretikulínu a koreximínu) sa hodnotila proti rakovine (HL-60, MCF-7, HepG2 a HCT116) a nerakovinové (MRC-5) ​​bunkové línie. Spomedzi nich boli najsľubnejšie výsledky pozorované pre benzylované dihydroflavóny dichamanetín (10) a

zmes uvarinolu (12) a isouvarinolu (13), ktorá vykazovala miernu cytotoxickú aktivitu proti testovaným rakovinovým bunkovým líniám（<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetín (11) vykazoval cytotoxickú aktivitu proti HL-60 a HCT116 s hodnotami IC50 15,78 ug·mL-1 （33,70 μmol-L-1）a 18,99 ug·mL-I（40,56 μmol .L-1）, zatiaľ čo zmes uvarinolu （12） a isouvarinolu (13) preukázala cytotoxickú aktivitu proti HL-60 s hodnotou IC50 9,74 ug∶mL-I a HCT116 s IC50 hodnotu 17,31 ug·mL-1. Tieto výsledky na nádorových bunkových líniách sú tiež po prvýkrát opísané pre benzylované dihydroflavóny. Cytotoxické aktivity retikulínu, anonaínu a liriodenínu boli stanovené už skôr, pričom liriodenín je najúčinnejšou zlúčeninou.

Výsledky získané v tejto práci naznačujú, že druhy čeľade Annonaceae sú sľubným zdrojom biologicky aktívnych zlúčenín s cytotoxickými vlastnosťami a naznačujú pokračovanie ich výskumu v iných modeloch biologických testov.

Referencie

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Včasná evolučná história čeľade kvitnúcich rastlín Annonaceae: Stála diverzifikácia a boreotropický geodisperz. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, poslanec Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brazília, 1984.

3. Leboeuf, M.; Cave, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Fytochémia Annonaceae. Fytochémia 1982, 21, 2783-2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: Prehľad. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237-278. [CrossRef]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Alkaloidy z Annonaceae: Výskyt a kompilácia ich biologických aktivít. In The Alkaloids; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Holandsko, 2015; kapitola 5; Zväzok 74, s. 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; a kol. Fenylpropanoidy odvodené od asarónu a alkaloidy odvodené od izochinolínu z kôry Duguetia pycnastera (Annonaceae) a ich cytotoxicita. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Alkaloidy odvodené od izochinolínu z kôry Guatteria olivacea (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Happi, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Prírodné produkty z liečivej rastliny Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Antioxidačné, protireumatické a protizápalové vyšetrenie extraktu a dicentrinónu z Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Hook. f. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 9.–16. [CrossRef]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Trypanocídna aktivita oxoaporfínu a pyrimidín{2}}karbolínových alkaloidov z vetiev Annona foetida Mart. (Annonaceae). Molekuly 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Silva, DB; Tulli, ECO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Protinádorové, trypanocídne a antileishmanické účinky extraktu a alkaloidov izolovaných z Duguetia furacea. Fytomedicína 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; a kol. Pyrimidín- -karbolín a ďalšie alkaloidy z Annona foetida s antileishmanickou aktivitou. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]