Bioaktívne bakteriálne nanocelulózové membrány obohatené o Eucalyptus Globulus Labill. Vodný extrakt z listov na aplikácie starostlivosti o pleť proti starnutiu

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Bakteriálne nanocelulózové (BNC) membrány s pozoruhodnými fyzikálnymi a mechanickými vlastnosťami sa ukázali ako všestranný biopolymérny nosič bioaktívnych zlúčenín pre aplikácie starostlivosti o pleť. V tejto štúdii boli membrány BNC naplnené glycerolom (ako plastifikátor a zvlhčovadlo) a rôzne dávky (1-3 ug cm-2) vodného extraktu získaného hydrodestiláciou Eucalyptus globulus Labill. listy (HDE), na aplikáciu ako plátové pleťové masky. Všetky membrány sú odolné a vysoko tvárne v suchom aj mokrom stave, s podobnými alebo dokonca lepšími mechanickými vlastnosťami ako komerčná BNC maska. Okrem toho sa zistilo, že HDE dodáva čistému BNC antioxidačnú aktivitu závislú od dávky. Okrem toho, po 3 mesiacoch skladovania pri 22-25 stupňoch a 52 percentách relatívnej vlhkosti (RH) alebo pri 40 °C a 75 percentách relatívnej vlhkosti sa potvrdilo, že antioxidačná aktivita a makroskopický vzhľad membrány s 2 ug cm{{10 }} HDE boli zachované. Ukázalo sa tiež, že membrány sú necytotoxické voči bunkám HaCaT a NIH/3T3 a membrána s 2 ug cm{15}} HDE spôsobila významné zníženie aktivity galaktozidázy spojenej so starnutím v bunkách NIH/3T3. Tieto zistenia naznačujú vhodnosť a potenciál získaných membrán ako bioaktívnych tvárových masiek pre aplikácie proti starnutiu.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Kľúčové slová:bakteriálna nanocelulóza; Eucalyptus globulus Labill. listy; vodný extrakt; antioxidačná aktivita; Plechové masky na tvár; proti starnutiu; aplikácie starostlivosti o pleť

1. Úvod

Svetová populácia značne starne v dôsledku poklesu pôrodnosti a zlepšenia prežitia a následného predĺženia priemernej dĺžky života, čo súvisí s medicínskym a technologickým vývojom dosiahnutým za posledné desaťročia [1,2]. Očakáva sa, že celosvetová populácia vo veku 60 a viac rokov dosiahne do roku 2050 približne 2,1 miliardy, čo predstavuje približne dvojnásobný nárast od roku 2017 a očakáva sa, že počet ľudí vo veku 80 a viac rokov sa v rovnakom období takmer strojnásobí 3]. Napriek zlepšenej životnosti je však starnutie pokožky nevyhnutným procesom, a preto sa očakáva rastúci dopyt po výrobkoch starostlivosti o pleť proti starnutiu.

Starnutie kože je komplexný biologický proces spájajúci endogénne a exogénne mechanizmy [4]. Endogénne starnutie je determinované najmä genetickými faktormi a hormonálnymi zmenami, ktoré sa vyskytujú pri normálnom procese starnutia [4]. Na druhej strane, exogénne starnutie je sprostredkované vonkajšími faktormi (napr. nadmerná expozícia ultrafialovému žiareniu (fotostarnutie), gravitácia, fajčenie, znečistenie a zlá výživa)[5]. V oboch procesoch starnutia, ale najmä v tom exogénnom, sa všeobecne uznáva, že kľúčovú úlohu zohráva zvýšený oxidačný stres vyvolaný reaktívnymi formami kyslíka (ROS) a vyplývajúci z nerovnováhy medzi produkciou ROS a antioxidačnou obranou [{{3} }]. S pribúdajúcim vekom sa tiež znižuje schopnosť buniek ľudskej kože opravovať poškodenú DNA, čo tiež prispieva k starnutiu pokožky [8].Cistanche Extract Anti RadiationProces starnutia teda spôsobuje niekoľko biochemických zmien v zložení pokožky s vplyvmi na jej štruktúru a funkciu [9], čo vedie k viditeľným znakom, ako sú vrásky, suchosť, strata elasticity, stenčenie, hrubá štruktúra alebo nepravidelná pigmentácia [7,10]. . Preto s rastúcou snahou o zdravie a pohodu, v ktorej je zahrnuté aj zdravie pokožky a estetika, je vývoj kozmetických prípravkov obsahujúcich bioaktívne zlúčeniny na prevenciu alebo zmiernenie starnutia pokožky a jeho vonkajších príznakov, čím sa zlepšuje vzhľad pokožky. v popredí výskumu a inovácií v kozmetickom priemysle za posledné desaťročia. V tomto kontexte a medzi kozmetickými prípravkami na topickú liečbu sú kozmetické masky, a najmä masky na tvár, rastúcim trhom s očakávanou zloženou ročnou mierou rastu (CAGR) 8,1 percenta od roku 2019 do roku 2027 [11]. Tento typ masky je obzvlášť atraktívny pre moderných spotrebiteľov, a to najmä vďaka jednoduchej a ľahkej aplikácii, rýchlemu použitiu a účinnosti]12. Ako nosnú matricu týchto plátenných masiek možno použiť niekoľko materiálov, menovite syntetické polyméry (napr. poly(vinylalkohol) a silikón, tkaniny (napr. netkané textílie a bavlna), hydrogély (napr. hydrogély na báze kolagénu a hodvábu )alebo celulózové nanovlákna, ako je bakteriálna nanocelulóza (BNC)[13]. So zvyšujúcim sa dopytom po produktoch starostlivosti o pleť získaných z prírodných zdrojov nadobudla BNC na význame a teraz predstavuje vynikajúci materiál na biologickej báze, ktorý už preskúmali a komercializovali niektorí popredné kozmetické spoločnosti (napr. Lancome, Elizabeth Arden a DHC)[14], ktoré sledujú trend dopytu spotrebiteľov orientovaných na zelenú.

Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90 percent), vysoká hydrofilnosť a nanoporézna štruktúra [17]. Pri výrobe v statickej kultúre sa BNC získa ako želatínová membrána podobná hydrogélu s premenlivou hrúbkou a tvarom kultivačnej nádoby (pozri tvarovateľnosť in situ), čo je výhodou, keď sa požaduje vopred definovaný tvar [18]. Súbor jedinečných vlastností BNC tiež zahŕňa vysokú kryštalinitu a čistotu, pozoruhodnú mechanickú pevnosť a tepelnú stabilitu [19]. Okrem toho, že BNC je biologicky odbúrateľný, preukázal aj dobrú znášanlivosť pokožky a biokompatibilitu v niekoľkých štúdiách in vivo [20-22], vďaka čomu je ideálnym materiálom pre produkty starostlivosti o pleť. V tomto ohľade a kvôli jeho poréznej nanoštruktúre bola použiteľnosť a účinnosť BNC ako nosiča na dodávanie kožne aktívnych zlúčenín stredobodom niekoľkých prác, napríklad na dodávanie kofeínu [23], hodváb-sericín [24], retinol [25] alebo rutín [26]. Na ďalšie čítanie poskytuje nedávny prehľad komplexný prehľad o všestrannosti a použiteľnosti BNC v zelenej kozmetike, a to aj ako nosiča kožných aktívnych látok [27].

cistanche môže proti starnutiu

Prírodné bioaktívne zlúčeniny sú široko používané v kozmetike starostlivosti o pleť proti starnutiu [28].cistanche herbaNajmä rastlinné extrakty sú bohatým zdrojom bioaktívnych zlúčenín (napr. polyfenoly, terpenoidy, vitamíny atď.) s potenciálnym mnohonásobným pôsobením na pokožku, pričom hlavnými doteraz uvádzanými výhodami sú antioxidačné a antimikrobiálne aktivity inhibície tyrozinázy [ 29]. Preto vzhľadom na súčasný trend prírodných produktov v kozmetike sa rastlinné extrakty javia medzi najsľubnejšími zložkami pre vývoj produktov starostlivosti o pleť. Okrem toho sa na kozmetické účely skúmalo aj začlenenie prírodných extraktov do membrán BNC. Príkladom sú práce uvádzajúce začlenenie extraktu propolisu, o ktorom je známe, že má antiseptické a adstringentné účinky[13,30], extrakty z ovsa a rozmarínu s hydratačnými účinkami [13], alebo kozmetický prípravok zložený z ovocia Adansonia digitata, kvetu Hibiscus sabdariffa, Koláč z kávovníka arabského, plod Kigelia Africana a výťažky z cibúľ akácie a Crocus chrysanthus s vlastnosťami proti starnutiu, najmä vyhladzovaním vrások [21]. Nedávno prehľad priniesol kritický pohľad na dôležitosť spájania BNC s rastlinnými fenolmi, aby sa zabránilo poškodeniu kože spôsobenému UV žiarením [31].

Eucalyptus globulus Labill. vždyzelený strom je dobre známym zdrojom bioaktívnych zlúčenín, konkrétne fenolových zlúčenín, ako sú fenolové kyseliny, flavonoidy alebo hydrolyzovateľné taníny [32-36]. Antioxidačné a antimikrobiálne aktivity extraktov E.globulus obsahujúcich tieto zlúčeniny boli preukázané v niekoľkých štúdiách [34,35]. Pokiaľ ide o aplikáciu v kozmetickej oblasti, nedávna štúdia preukázala ochranný účinok in vitro (u ľudských dermálnych fibroblastov) aj in vivo (bezsrsté myši) 50-percentného etanolového extraktu zo sušenej komerčnej biomasy E.globulus proti starnutiu spôsobenému UV žiarením. so sľubnými výsledkami, pokiaľ ide o prevenciu tvorby vrások a suchosti pokožky [37]. Podľa našich najlepších vedomostí však extrakty E.globulus neboli nikdy preskúmané v kombinácii s polymérnym substrátom na výrobu bioaktívnych pleťových masiek pre starostlivosť o pleť proti starnutiu.

Z tohto hľadiska bolo účelom tejto práce vyrobiť membrány BNC naplnené vodným extraktom odvodeným z hydro-destilácie (hydro-destilačný extrakt, HDE) listov E.globulus. Hydrodestilácia je metóda bežne používaná v priemysle na extrakciu éterických olejov [38]. Okrem toho bol do membrán BNC (7,5 mg cm-2) ​​zakomponovaný aj glycerol (G), široko používaná zvlhčujúca zložka v kozmetike [39], aby sa zvýšila ich pružnosť a zároveň prispôsobivosť koža. Cieľom tejto práce teda bolo získať úplne biologický materiál s funkčnými vlastnosťami pre potenciálne použitie ako tvárová maska ​​proti starnutiu. BNC membrány zaťažené rôznymi dávkami hydrodestilačného extraktu boli charakterizované z hľadiska ich morfológie, mechanických vlastností, tepelnej stability a kapacity absorpcie vlhkosti. Okrem toho sa hodnotila aj chemická antioxidačná aktivita rôznych membrán, ako aj ich in vitro cytotoxicita (v ľudských keratinocytoch a bunkových líniách myších fibroblastov). Okrem toho stabilita antioxidačnej aktivity po 3 mesiacoch skladovania, v tme, pri 22-25 stupňoch a 52 percent relatívnej vlhkosti (RH) alebo pri 40 stupňoch a 75 percentách relatívnej vlhkosti membrány s 2 ug cm{{19} } HDE bolo hodnotených. Nakoniec sa ďalej skúmala in vitro anti-senescenčná aktivita membrány BNC s 2 ug cm-2 HDE.

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie a materiály

Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99.0 percent) a 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid (MTT) (väčší viac alebo rovných 97,5 percenta) boli zakúpené od Sigma-Aldrich (Lisabon, Portugalsko). Všetky ostatné chemikálie boli laboratórnej kvality.rast penisu cistancheChlorid vápenatý, Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), etopozid, Folin-Ciocalteuovo fenolové činidlo, chlorid horečnatý, pyruvát sodný, roztok trypsínu-EDTA, N-(2-hydroxyetyl)piperazín-N'-({{6} }kyselina etánsulfónová),4-(2-hydroxyetylpiperazín-1-kyselina etánsulfónová (HEPES) a 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) boli dodáva Sigma-Aldrich (Lisabon, Portugalsko). Peptón a kvasinkový extrakt boli získané od Himedia Laboratories GmbH (Einhausen, Nemecko).Fetálne hovädzie sérum (FBS), penicilín a streptomycín boli zakúpené od Gibco (Carlsbad, CA, USA).

Na účely porovnania sa v mechanických testoch a testoch absorpcie vlhkosti použili vzorky z komerčnej listovej tvárovej masky BNC. Komerčná maska ​​na tvár BNC (Superstart Probiotic Boost Skin Renewal Biocelulóza maska, Elizabeth Arden, New York, NY, USA) je opísaná ako odvodená z prírodnej kokosovej vody a vložená do kozmetického prípravku s vlastnosťami obnovy pokožky, ktorý okrem iných zložiek obsahuje, probiotiká (Lactococcus fermentovaný lyzát, Lactobacillus), rastlinné extrakty (extrakt z kvetov ruže Althea, šťava z koreňa Polymnia sonchifolia, extrakt z Crithmum maritimum), kofeín a zvlhčovadlá, ako je glycerol, kyselina hyalurónová alebo polyetylénglykol (PEG)-450 . Vzorky BNC-komerčnej dosky boli pred použitím vysušené vo vetranej sušiarni pri 358 °C.výhody cistanche salsaČerstvý E.globulus Labill. listy boli zozbierané z dospelých stromov z priemyselnej plantáže The Navigator Company neďaleko Aveiro v Sever do Vouga (Bracal) (Aveiro, Portugalsko) a podrobené procesu hydrodestilácie až do úplnej extrakcie frakcie esenciálneho oleja (2-3 h) použitím modifikovaného prístroja typu Clevenger. Nakoniec sa vodný extrakt, HDE, získal a lyofilizoval, skladoval a chránil pred svetlom v exsikátore pri izbovej teplote až do použitia [40].

2.2. Celkový obsah fenolov v HDE

Celkový obsah fenolov (TPC) v HDE bol stanovený pomocou Folin-Ciocalteuovej metódy, ako je opísané inde [41], s určitými modifikáciami. Stručne povedané, na 96-jamkovej platni sa 150 μl Folin-Ciocalteuovho činidla vopred zriedi (1–10, o/ø） vodou a 120 l vodného roztoku uhličitanu sodného （75 g L- ）boli pridané do 30 μl vodného roztoku HDE v koncentráciách v rozsahu od 1,95 ug do 500 ug ml-1 extraktu. Reakčné zmesi sa inkubovali v tme pri teplote miestnosti počas 60 minút. Po inkubačnej dobe sa merala absorbancia pri 760 nm oproti slepému pokusu (voda namiesto extraktu) v čítačke mikrodoštičiek Thermo Scientific MultiskanTM FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). TPC sa vypočítalo ako ekvivalenty kyseliny galovej (GAE) z kalibračnej krivky štandardných roztokov kyseliny galovej (5.13-205,0 ug ml-1) a vyjadrilo sa ako mg GAE lyofilizovaného extraktu. Test sa uskutočnil päťkrát a každá vzorka sa analyzovala trojmo.

2.3. Výroba membrán BNC

BNC membrány boli vyrobené v našom laboratóriu s použitím tekutého kultivačného média Hestrin-Schramm (HS) (20g L-1glukózy, 5g L-1peptónu, 5g Ll kvasinkového extraktu, 2,7g L -1 hydrogenfosforečnan sodný, 1,15 g kyseliny L-citrónovej, pH 5) naočkovaných baktériami kyseliny octovej Gluconacetobacter sacchari za podmienok statickej kultivácie [42]. Po 4-6 dňoch kultivácie pri 30 stupňoch boli BNC membrány zozbierané a ošetrené dvakrát 0,5 M NaOH pri 80 stupňoch počas 30 minút. Potom sa membrány niekoľkokrát premyli destilovanou vodou, aby sa odstránili zostávajúce zložky média a bakteriálne bunky. Nakoniec sa membrány BNC vybielili 1% vodným roztokom chlórnanu sodného, ​​po čom nasledovalo opakované premytie destilovanou vodou, kým sa nedosiahlo neutrálne pH. Vyčistené membrány sa skladovali v ultračistej vode pri plus 4 stupňoch až do použitia.

2.4. Príprava BNC-G-HDE membrán

Mokré BNCmembrány （priemer∶ cca.7.0±0.5 cm; hrúbka∶ 7000± 1000 μm）boli zaťažené rôznymi dávkami HDE (vyjadrené ako hmotnosť HDE na plochu membrány) a glycerolu (7,5 mg cm-2) ​​(tabuľka 1), použitím metódy impregnácie. Stručne povedané, vlhké membrány BNC sa odvážili (asi 180 mg suchého BNC) a vysušili sa ručným lisovaním absorpčným papierom laboratórnej kvality, kým sa obsah vody neznížil na takmer 40 percent (odhadom podľa úbytku hmotnosti). Potom sa membrány namočili do 5 ml vodného roztoku obsahujúceho príslušné dávky HDE aj glycerolu a udržiavali sa pri teplote miestnosti až do úplnej absorpcie roztoku HDE-G. Nakoniec sa membrány BNC sušili (v Petriho miskách) pri 35 stupňoch vo vetranej peci (línia Venticell Eco, skupina MMM, Planegg, Nemecko) počas najmenej 20 hodín. Vysušené membrány sa skladovali a chránili pred svetlom v exsikátore pri teplote miestnosti až do použitia. Na účely porovnania boli čisté membrány BNC (bez extraktu a glycerolu) vysušené, ako bolo opísané vyššie, a membrány naplnené glycerolom (BNC-G) boli pripravené podľa rovnakého postupu.

2.5. Charakterizácia membrán

2.5.1.Hrúbka

Hrúbka suchých membrán bola meraná na piatich náhodných miestach pomocou ručného digitálneho mikrometra (Mitutoyo Corporation, Tokio, Japonsko) s presnosťou 1 μm

2.5.2. Morfológia

Morfológie povrchu a prierezu (kryo-fraktúrne) membrán boli analyzované skenovacou elektrónovou mikroskopiou (SEM). Mikrofotografie boli získané pomocou vysokonapäťového mikroskopu (HR-FESEMSU 70 Hitachi, Tokio, Japonsko) prevádzkovaného pri 4,0 kV. Pred získaním obrazu boli vzorky umiestnené na oceľový nosič a potiahnuté uhlíkom.

2.5.3. Mechanický výkon

Mechanické vlastnosti membrán v suchom a mokrom stave (80 percent vlhkosti) boli hodnotené ťahovými skúškami. Obsah vlhkosti mokrých membrán bol definovaný podľa obsahu vlhkosti stanoveného v komerčnom BNC. Ťahové testy sa uskutočňovali na jednoosovom testovacom stroji Instron 5564 (Instron Corporation, Norwood, MA, USA) v ťahovom režime pri rýchlosti krížovej hlavy 10 mm min-I s použitím 500 N statického silomera. Všetky merania sa uskutočňovali najmenej v piatich replikátoch s použitím obdĺžnikových testovacích vzoriek （5×1 cm²） a meranej dĺžky 30 mm. Boli vynesené krivky napätia (MPa) a deformácie (% percent) a pomocou softvéru Instron BlueHill 3 sa určil Youngov modul, pevnosť v ťahu a predĺženie pri pretrhnutí. V týchto testoch sa na porovnanie testovali aj vzorky komerčnej tvárovej masky BNC v rovnakých podmienkach.

2.5.4. Tepelná stabilita

Termogravimetrická analýza (TGA) sa uskutočňovala pomocou analyzátora SETSYS Setaram TGA (SITARAM Instrumentation, Lyon, Francúzsko) vybaveného platinovým článkom. Vzorky sa zahrievali z teploty miestnosti na 800 °C konštantnou rýchlosťou 10 stupňov min-1 pod dusíkovou atmosférou.

2.5.5. Kapacita absorpcie vlhkosti

Kapacita absorpcie vlhkosti všetkých membrán bola hodnotená umiestnením vysušených vzoriek (2 x 2 cm-) každej membrány do exsikátora pri izbovej teplote s relatívnou vlhkosťou cca. 52 percent s použitím nasýteného vodného roztoku dusičnanu horečnatého (52,89 ± 0,22 percent pri 25 stupňoch)[43]. Vzorky boli odobraté z exsikátora a odvážené po 0,5 h, 1 h, 2,5 h, 24 h a 48 h. Všetky membrány boli testované trojmo. Príjem vlhkosti sa vypočítal takto:

kde Who je počiatočná hmotnosť vzorky a Wwi je hmotnosť v každom časovom bode.

2.6. In Chermico Antioxidačná aktivita

Antioxidačná aktivita membrán naplnených HDE bola odhadnutá pomocou metódy zachytávania voľných radikálov DPPH podľa vyššie uvedeného postupu [44] s určitými modifikáciami. Reakcia je založená na znížení absorbancie roztoku DPPH v dôsledku vychytávania radikálov antioxidačnými zlúčeninami s následnou zmenou farby roztoku DPPH z fialovej na svetložltú [45]. Stručne, vzorky (2 x 5 cm²) každej membrány sa pridali do 3,75 ml etanolu (EtOH) a fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) (60∶40); pH 5,5). Potom sa pridalo 250 ul roztoku DPPH (1 mM) v etanole a výsledné zmesi sa inkubovali v tme za jemného miešania (100 ot./min.) pri 22 stupňoch počas 0,5 hodiny, 1 hodiny a 2,5 hodiny a potom sa absorbancia pri 517 nm sa odčítalo oproti slepému pokusu (EtOH: PBS1 x pH 5,5) s použitím čítačky mikrodoštičiek MultiskanTM FC (Thermo Scientific, Waltham, Massachusets, EUA). Na porovnanie, reakčné zmesi obsahujúce HDE zriedený v EtOH: PBS1 x pH 5,5 v konečnej koncentrácii ekvivalentnej maximálnemu množstvu HDE, ktoré by sa mohlo uvoľniť z každej membrány (HDE 1:2,5 ug ml-1; HDE1. 5∶3,75 ug ml-1; HDE 2∶5,0 ug ml-1; HDE 3∶7,5 ug ml-）bolo tiež zahrnuté do testu. Kontrola pozostávajúca z EtOH: PBS 1 × pH 5,5 s DPPH a bez membrány. Pre každú vzorku sa uskutočnili tri nezávislé testy. Aktivita zachytávania DPPH radikálov sa vypočítala z absorbancie každej vzorky (A vzorka) vzhľadom na kontrolnú absorbanciu DPPH (ApppH) nasledovne:

2.7. Hodnotenie stability membrány BNC-G-HDE2 pri skladovaní

Na základe „Pokynov pre testovanie stability kozmetických výrobkov“[46] sa hodnotila stabilita BNC-G-HDE2 pri skladovaní. Na tento účel sa vzorky (14 cm²) BNC-G (ako kontrola) a membrán BNC-G-HDE2 umiestnili do sklenených fľaštičiek a skladovali sa 3 mesiace v tme pri očakávaných normálnych podmienkach skladovania pri izbovej teplote ({{10 }} stupeň) a 52 percent RH (podmienka I, s použitím nasýteného roztoku dusičnanu horečnatého [43]) a pri zrýchlených podmienkach 40 stupňov C a 75 percent RH (podmienka I, s použitím nasýteného roztoku chloridu sodného [43] ). Relatívna vlhkosť sa pravidelne monitorovala pomocou termohydrometra, aby sa zabezpečila konštantná vlhkosť počas celej doby skladovania. Všetky vzorky boli analyzované pred a po 1, 2 a 3 mesiacoch skladovania z hľadiska ich antioxidačnej aktivity (ako je opísané v časti 2.6). Zaznamenal sa aj makroskopický aspekt membrán. Pre každú podmienku sa všetky vzorky analyzovali trojmo.

2.8. Biologické testy in vitro

2.8.1. Bunková kultúra

Bunkové línie ľudských keratinocytov (HaCaT, od CLS, Cell Lines Service, Eppelheim, Nemecko) a myších fibroblastov (NIH/3T3, ATCC CRL-1658, Manassas, VA, USA) sa kultivovali pomocou Dulbeccovho modifikovaného Eagleho média (DMEM) , pri 37 stupňoch, vo zvlhčenej atmosfére vzduchu s 5 percentami CO2-95 percent. Médium bolo doplnené 10 percentami (o/v) tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (FBS), 1 percentom (o/ø) pen/strep, 3,7 g hydrogénuhličitanu L-sodného a 1 mM pyruvátu sodného. Bunky boli oddelené roztokom trypsín-EDTA 1x.

2.8.2. Test cytotoxicity

Cytotoxicita membrán bola hodnotená pomocou MTT redukčného testu. Vzorky (2,5 cm²) membrán (BNC-G, BNC-G-HDE1, BNC-G-HDE1.5, BNC-G-HDE2, BNC-G-HDE3) boli sterilizované dvakrát UV žiarením na každej strane počas 20 min a ďalej inkubované počas 24 hodín v 2,5 ml kompletného média DMEM pri 37 stupňoch vo zvlhčenej atmosfére 5 percent CO, -95 percent vzduchu, aby sa pripravil každý membránový extrakt.

Medzitým sa 2×10 a 1×104 bunky/jamka naočkovali na 96-jamkové platne pre bunky HaCaT a NIH/3T3, v danom poradí. Po 24 hodinách sa použil rovnaký objem membránového extraktu na nahradenie kultivačného média a bunky sa ďalej inkubovali počas 24 hodín pri 37 stupňoch. Ako kontrola boli bunky ošetrené rovnakým spôsobom, ako je opísané pre vzorky, ale vystavené iba médiu DMEM. Po 24 hodinách sa médium odstránilo a cytotoxicita sa stanovila, ako už bolo opísané [47]. V stručnosti, bol pridaný čerstvý roztok MTT (0,5 mg L-1) pripravený v Krebsovom médiu (pH 7,4) a inkubovaný pri 37 stupňoch počas 2 hodín (HaCaT bunky) alebo 4 h (NIH/3T3 bunky). Potom sa roztok MTT nahradil DMSO a inkuboval sa 10 minút za trepania, aby sa úplne rozpustili kryštály formazanu. Po inkubácii sa merala absorbancia pri 570 nm v spektrofotometri (SLT spektrum I). Výsledky 3 nezávislých experimentov, každý s 3 replikátmi, boli vyjadrené ako percento (percento) hodnoty absorbancie získanej v kontrole a graficky znázornené ako percento zníženia MTT.

2.8.3. Aktivita proti starnutiu

Anti-senescenčná aktivita membrány BNC-G-HDE2 sa hodnotila pomocou testu farbenia -galaktozidázou (-gal). Ako kontrola bola použitá membrána BNC-G. Na prípravu membránových extraktov sa sterilizované vzorky (10 cm-) inkubovali v 10 ml kompletného média DMEM, ako bolo opísané vyššie pre test cytotoxicity.

Bunky NIH/3T3 sa naočkovali na 12-jamkové platne v hustote 2,5 x 104 buniek/jamku a nechali sa stabilizovať 24 hodín. Následne sa 12,5 uM etopozidu použilo na vyvolanie bunkovej starnutia v NIH / 3T3 počas 24 hodín. Bunky stimulované etopozidom sa potom ošetrili membránovým extraktom BNC-G-HDE2 počas ďalších 24 hodín.cistanche tubulosa dávkovanie redditAko kontrola boli neošetrené bunky inkubované s médiom DMEM alebo s extraktmi membrán BNC-G a BNC-G-HDE. Po inkubácii sa kultivačné médium odstránilo a bunky sa premyli PBS a označili sa roztokom -gal pripraveným podľa popisu výrobcu (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Analýza pozitívnych buniek na starnutie sa uskutočnila pri 20-násobnom zväčšení s použitím mikroskopu so širokým poľom (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko). Uskutočnili sa aspoň 3 nezávislé experimenty v replike a percento -gal-pozitívnych buniek sa určilo pomocou štyroch mikroskopických obrázkov.

2.9. Štatistická analýza

Pri spracovaní výsledkov z charakterizácie, antioxidačnej aktivity a testu stability pri skladovaní membrán sa na vyhodnotenie hladiny významnosti použila jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) nasledovaná Tukeyho testom. Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka priemeru. Čo sa týka testov in vitro, normalita distribúcie údajov bola hodnotená testom normality D'Agostino-Pearson a Shapiro-Wilk. Štatistické porovnania medzi skupinami sa uskutočnili pomocou ANOVA, po ktorej nasledoval Dunnettov post-hoc test alebo nepárový Studentov t-test. Výsledky sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru uvedeného počtu experimentov.

Významnosť bola akceptovaná pri hodnotách p<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">

Tento článok je prevzatý z materiálov 2022, 15, 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials