Posilnenie protirakovinovej aktivity taxolu "endofytu jojoby" Aspergillus Favus prostredníctvom konjugácie s nanočasticami zlata sprostredkovanej ožiarením

Taxol Alternatívne čínske bylinky Cistanche

Kľúčové slová:Aspergillus favus · Jojoba · Endofytické huby · Nanočastice zlata · Taxol · -Ožarovanie · Optimalizácia výživy

Úvod

Taxol je jedným z najviac komercializovaných širokospektrálnychprotirakovinové lieky[1]. Aktivita Taxolu vychádza z jeho jedinečnej špecifickosti pre väzbu s bunkovým heterodimérom tubulínových podjednotiek, čím podporuje polymerizáciu tubulínu, čím narúša mitotické delenie nádorových buniek [2]. Taxol vykazoval silnú aktivitu proti rakovine prsníka, pľúc, hlavy a krku, rakovine maternice a pokročilým formám Kaposiho sarkómu [3]. Taxol sa najskôr vyrábal z kôry tisu Taxus brevifolia "čeľaď Taxaceae" [4, 5]; avšak nižší výťažok Taxolu<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,zápal, arakovina[32]. Hlavným cieľom tejto práce teda bolo preskúmať nový fungálny izolát z jojobovej rastliny s jedinečnou metabolickou stabilitou pre produkciu taxolu, zhodnotiť rôzne prístupy na maximalizáciu ich výťažku taxolu, ako aj na zvýšenie antiproliferatívnej aktivity extrahovaných taxolových zlúčenín. cez konjugáciu s nanočasticami zlata, sprostredkovanú gama žiarením.

Materiál a metódy

Izolácia a kultivácia endofytických húb

Rôzne časti jojoby (Simmondsia chinensis) ako listy, kôry, vetvičky a puky boli zozbierané z Poľnohospodárskej fakulty Káhirskej univerzity a použité ako zdroj endofytických húb. Časti rastlín boli zozbierané a umyté pod tečúcou vodou z vodovodu, povrchovo sterilizované 70 percentným etanolom počas 1 minúty a potom opláchnuté sterilnou vodou [28]. Povrchovo sterilizované časti rastlín boli za sterilných podmienok narezané na malé kúsky a umiestnené na platne so zemiakovo-dextrózovým agarom (PDA), médium Czapek's-Dox a agarové médium so sladovým extraktom [33–36] a platne boli inkubované pri 30 stupňoch. 10 dní. Účinnosť povrchovej sterilizácie častí rastlín bola hodnotená odstredením oplachovej vody, potom bolo k zrazenine pridaných 500 ul sterilnej vody a nanesené do PDA média [37]. Vyčistené izoláty endofytických húb boli naočkované na šikmé PDA počas 7 dní a skladované pri 4 stupňoch

Skríning, extrakcia a kvantifikácia taxolu z endofytických húb

Získané endofytické huby obývajúce jojobu boli testované na produkciu taxolu pestovaním na bujóne zemiakovej dextrózy (PDB) [38]. Jedna zátka každého zo 7 dní starých izolátov huby sa naočkovala do 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyerových úloh, inkubovaných 15 dní pri 30±1 stupňoch za podmienok trepania (120 otáčky za minútu). Po inkubácii sa kultúry prefiltrovali a filtrát sa doplnil 0,2 percentným hydrogénuhličitanom sodným, aby sa vyzrážali mastné kyseliny. Taxol sa extrahoval dichlórmetánom a organická fáza sa zhromaždila a odparila do sucha a zvyšky sa znova rozpustili v metanole [17, 39]. Taxol sa oddelil a identifikoval pomocou TLC s použitím vopred potiahnutých silikagélových platní Merck 1 mm (20 x 20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Nemecko), detekovaných UV žiarením pri 254 nm [39]. Predpokladané škvrny Taxolu boli zoškrabané z TLC silikagélových platní a rozpustené v metanole, intenzívne vortexované počas 10 minút a centrifugované pri 1000 otáčkach za minútu počas 5 minút. Častice vyzrážaného oxidu kremičitého sa odstránili a supernatant sa odobral na kvantifikáciu Taxolu a kontrolu čistoty pomocou HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Kórea) na kolóne C18 s reverznou fázou (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, kat. č. 959,963–902). Použitou mobilnou fázou bol metanol/acetonitril/voda (25:35:40, v/v/v) pri prietokovej rýchlosti 1,0 ml/min počas 20 minút [40] a frakcie taxolu sa merali pri 227 nm a ich chemická identita a koncentrácie boli potvrdené z retenčného času a plochy absorpčného piku v porovnaní s autentickou vzorkou.

Morfologická a molekulárna identifikácia obnovených endofytických húb

Endofytické izoláty húb boli identifikované podľa ich druhovej úrovne na základe ich makro a mikromorfologických vlastností pestovaním na PDA, Czapek's-Dox a sladovom extraktovom médiu podľa referenčných kľúčov [33–36]. Identita najsilnejších izolátov húb produkujúcich taxol bola ďalej molekulárne potvrdená na základe sekvencie interného transkribovaného spaceru (ITS) [41, 42]. Plesňová genómová DNA (gDNA) bola extrahovaná rozdrvením mycélia (~0,2 g) v tekutom dusíku a následným rozdelením do 1 ml CTAB extrakčného pufra (2 percentá CTAB, 2 percentá PVP40, { {21}},2 percent 2-merkaptoetanolu, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl v 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). Súbory PCR primérov boli ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ a ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR reakcia obsahuje 10 ul 2×PCR master zmesi (i-Taq™, kat. č. 25027), 2 ul gDNA, 1 ul každého priméru (10 pmol/ul) a doplnené na 20 ul sterilným destilovaným voda. PCR bola naprogramovaná na počiatočnú denaturáciu pri 94 stupňoch počas 2 minút, denaturáciu pri 94 stupňoch počas 30 s, žíhanie pri 55 stupňoch počas 10 s, predĺženie pri 72 stupňoch počas 30 s počas 35 cyklov a konečné predĺženie pri 72 stupňoch počas 2 sekúnd min. PCR amplikóny sa analyzovali pomocou 1,5 percentného agarózového gélu v 1 x TBE pufri (Ambion kat. č. AM9864), s použitím 1 kb DNA rebríka (kat. č. PG010-55DI) a vizualizovali sa pomocou gélového dokumentačného systému. Amplikóny boli purifikované a sekvenované pomocou Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, verzia 6.0 s rovnakými sadami primérov. Získané sekvencie boli neredundantne prehľadané BLAST v databáze NCBI, importované do softvéru MEGA 6.0 a zoradené s svalovým algoritmom Clustal W [43] a fylogenetický strom bol skonštruovaný metódou susedného spájania MEGA 6.0 [44].

Chemická štruktúra extrahovaného taxolu

Predpokladané škvrny Taxolu boli zoškrabané z TLC silikagélových platní a purifikované a čistota a koncentrácia boli stanovené pomocou UV-Vis analýz pri λ 227 nm (RIGOL, Ultra{2}} Series) v porovnaní s autentickým taxolom. [39]. Ako negatívna základná línia pre spektrofotometrické analýzy sa použili prázdne médiá za rovnakých podmienok. FT-IR spektrum purifikovaných vzoriek taxolu sa analyzovalo JASCO FT-IR 3600 spektrofotometrom. Vzorka Taxolu bola rozomletá s KBr peletami, zlisovaná do kotúčov vo vákuu a bola meraná absorpcia v oblasti 400 až 4000 cm-1 [3] v porovnaní s autentickou. Chemická štruktúra extrahovaného taxolu bola potvrdená pomocou HNMR spektroskopie (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) v porovnaní s autentickým taxolom. Vzorky boli rozpustené v CDCI3, chemické posuny sú uvedené v ppm (8-škála) a väzbové konštanty sú vyjadrené v hertzoch (Hz).

Vplyv rôznych typov médií na produkciu taxolu

Dve agarové zátky (9 mm) zo 7 dní starých kultúr každého izolátu húb boli naočkované trojmo do 100 ml média/250 ml Erlenmeyerovej banky zemiakovej dextrózy (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D a sladového extraktu (ME). ) bujónové médium. Nenaočkované kontroly z každého média, ktoré neobsahujú spóry húb, boli použité ako negatívna kontrola, inkubované pri 30 stupňoch počas 15 dní za rovnakých podmienok. Po inkubácii sa kultúry húb prefiltrovali a Taxol sa extrahoval a stanovil sa, ako je uvedené vyššie.

Bioprocesová optimalizácia nutričných podmienok na maximalizáciu výťažku taxolu

Optimalizácia zloženia média na maximalizáciu výťažku taxolu silným izolátom huby sa uskutočnila pomocou metodológie povrchu odozvy s použitím dizajnu Placket-Burman, po ktorom nasledoval centrálny kompozitný dizajn [17–20, 45]. Z návrhov RSM boli pozitívne a významné premenné ovplyvňujúce produkciu taxolu silným fungálnym izolátom hodnotené pomocou štatistického softvérového balíka od Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Každý experiment sa uskutočnil v troch biologických replikátoch a zvážili sa priemerné hodnoty. Po inkubácii za požadovaných podmienok sa fungálna biomasa prefiltrovala a Taxol sa extrahoval a kvantifikoval pomocou TLC a HPLC, ako je opísané vyššie.

Dizajn Placket-Burman

Placket-Burmanov dizajn sa často používa na optimalizáciu zložky média pre rast húb a produkciu bioaktívnych sekundárnych metabolitov, pričom sa hodnotia významné premenné ovplyvňujúce produkciu taxolu [18, 20, 46]. Výber faktora bol založený na médiách použitých pri kvalitatívnom a kvantitatívnom skríningu. Bolo zahrnutých jedenásť faktorov; sladový extrakt, peptón, sacharóza, sója, glutamín, hovädzí extrakt a hodnoty a faktory teploty, pH, inkubačnej doby a rýchlosti trepania sa menili na dvoch úrovniach a vybrali sa rozsahy minimálnych a maximálnych hladín. Na vytvorenie súboru 12 experimentov sa použil štatistický Design-Expert 7.0. Pre každý experiment sa produkcia taxolu stanovila v troch biologických replikátoch a zvážil sa priemer výťažku taxolu.

Regresná analýza údajov sa uskutočnila pomocou štatistického softvéru. Účinok každej premennej sa vypočítal (Biometrika, 2020) pomocou nasledujúcej rovnice:

kde E je účinok testovacej premennej, M plus a M- sú koncentrácie taxolu v pokusoch, pri ktorých bol parameter na vyšších a nižších úrovniach, a N je počet vykonaných experimentov. Účinok každej premennej na produkciu bol stanovený výpočtom ich príslušných E-hodnôt.

Kde Tot high je celkový počet odpovedí na vysokej úrovni, Tot low je celkový počet odpovedí na nízkej úrovni a No je počet pokusov.

Centrálny kompozitný dizajn a interakcie medzi faktormi ovplyvňujúcimi produkciu taxolu

Najvýznamnejšie pozitívne faktory ovplyvňujúce produkciu taxolu vybraným izolátom húb boli optimalizované pomocou experimentálneho návrhu modelu CCD modelu povrchu odozvy [47]. Použitím CCD sa optimalizovali koncentrácie zložiek média a ich študované interakcie sa použili na vytvorenie celkovo 20 experimentov pre tri premenné. Na určenie optimálnych hladín premenných na produkciu taxolu zo silného izolátu húb boli vynesené trojrozmerné (3D) krivky povrchu odozvy, aby sa študovala interakcia medzi rôznymi faktormi a aby sa určili variabilné podmienky každého faktora ovplyvňujúceho produkciu taxolu. 3D grafy boli uskutočnené tak, že sa konštanty troch faktorov udržiavali na ideálnej úrovni a získaná odozva výťažku taxolu bola vynesená pre rôzne úrovne ostatných dvoch faktorov.

Vplyv gama ožiarenia na výťažok taxolu

Silné endofytické izoláty produkujúce Taxol boli vystavené ožiareniu 60zdrojom kobaltu (gama bunka 4000-A-India) pri rôznych dávkach gama žiarenia (0,25–3,0 kGy) v porovnaní na kontrolu neožiarenej kultúry; dávkový príkon 1,2 kGy/h v čase experimentov. Optimalizované médiá boli naočkované ožiarenou kultúrou za štandardných kultivačných podmienok v porovnaní s neožiareným inokulom spór ako kontrolou. Kultúry sa inkubovali pri 30 ± 2 stupňoch počas 15 dní na rotačnej trepačke (120 otáčok za minútu). Po inkubácii sa kultúry prefiltrovali a Taxol sa extrahoval, čistil a kvantifikoval pomocou TLC a HPLC, ako je opísané vyššie.

Syntéza a charakterizácia nanočastíc zlata (AuNP); Konjugácia s taxolom

Protirakovinová aktivita taxolu

Aktivita purifikovaných konjugátov Taxol a Taxol-PVP-AuNP proti karcinómu pečene (HPG2) a karcinómu prsníka (MCF7) bola stanovená pomocou 3- (4,5-dimetyltiazol- 2-yl) Test -2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT) [48]. 96-jamková doštička bola naočkovaná 103 bunkami na jamku a inkubovaná cez noc pri 37 stupňoch, potom boli pridané rôzne koncentrácie liečiva a doštičky boli reinkubované počas 48 hodín. Pridalo sa MTT činidlo (25 ul) a inkubovalo sa 2 hodiny a fialová farba vyvinutého formazanového komplexu sa merala pri X 570 nm. Hodnota IC50 bola vyjadrená množstvom liečiva znižujúceho rast 50 percent počiatočného počtu nádorových buniek normalizovaných na pozitívnu kontrolu.

Antimikrobiálna aktivita konjugátov taxolu a taxolu-AuNP

Antimikrobiálna aktivita konjugátov Taxol a Taxol-AuNPs bola hodnotená proti rôznym bakteriálnym izolátom; Bacillus subtilis ATCC 6633 a Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli a Enterobacter agglomerans, okrem Candida albicans. Testované bakteriálne bunky sa suspendovali v sterilnej peptónovej vode, aby sa získalo štandardné inokulum ~0,5 McFarland (1–1,5) × 1{{10}}8 CFU/ml pri λ6{{18 }}0 nm. Inhibícia rastu (mm) rastu mikrobiálnych patogénov bola hodnotená metódou difúzie na agarovom disku. Sterilné štandardné antibiotické disky s priemerom 6,0 mm sa použili ako pozitívne kontroly. Sterilné antibiotické disky (6,0 mm) boli naplnené 20 ul metanolu a kyseliny amoxicilín-klavulánová (AMC) ako negatívna a pozitívna kontrola. Na disky sa naplnila rovnaká koncentrácia Taxolu, Taxolu-PVP-AuNP a AuNP (1,0 ug/ml). Boli pripravené tri biologické replikáty. Platne sa inkubovali pri 37 stupňoch počas 24 hodín a zmerali sa zóny inhibície. Amoxicilín kyselina klavulanová (AMC) a nystatín sa použili na normalizáciu antimikrobiálnej aktivity Taxolu. Inhibičná zóna rastu bola určená posuvným meradlom (mm).

Štatistické analýzy

Morfologická a molekulárna identifikácia silných producentov taxolu

Morfologické znaky taxolu produkujúceho silný fungálny izolát sa skúmali podľa makroskopických a mikroskopických popisných kľúčov, ako je opísané v časti Materiály a metódy, a odhalili sa jeho morfologická blízkosť k A. favus (obr. 2). Izolát húb sa pestoval na PDA pri 30 stupňoch počas 10 dní a makroskopické a mikroskopické znaky odhalili jeho identitu, ako sú hlavičky konídií, spôsob vetvenia, identita stigmy a ontológia konídií a tvorba plodníc podľa univerzálneho morfologické kľúče [33] a zistilo sa, že sú totožné s Aspergillus favus. Silný izolát A. favus produkujúci taxol bol ďalej identifikovaný na základe ich ITS sekvencií s použitím gDNA ako templátu. PCR amplikóny (~550 bp) A. favus boli rozlíšené, purifikované a sekvenované (obr. 2). Sekvencia ITS A. favus bola neredundantne prehľadávaná v databáze NCBI, pričom vykazovala 99-percentnú podobnosť s A. favus, s nulovými hodnotami E. a 95-percentným pokrytím dotazov. Z mikroskopických a molekulárnych analýz bol teda cieľový izolát potvrdený ako A. favus a uložený v GenBank s prístupovým číslom MW485934.1, ako aj izolát bol uložený v Assiut University Mykological Center (AUMC), Egypt s depozitné číslo AUMC13892. Súčasný izolát mal 99-percentnú podobnosť s izolátmi A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Obr. 1 Morfologický pohľad na jojobovú rastlinu. B Platňové kultúry silných endofytických húb produkujúcich taxol; A. favus Bdl (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) a A. oryzae Bd (25) na PDA po 8 dňoch inkubácie pri 30 stupňoch. Izoláty húb boli pestované na PDB a inkubované za štandardných podmienok a Taxol bol extrahovaný a skontrolovaný TLC (C). D HPLC chromatogram Taxolu zo silných izolátov húb. E Výťažok taxolu kvantifikovaný z HPLC. F, UV-Vis spektrálna analýza extrahovaného taxolu z izolátov húb. G FT-IR analýza extrahovaného taxolu v porovnaní s autentickým

Obr. 2 A Makromorfologické znaky A. favus, endofytu jojoby po 3, 5 a 8 dňoch rastu na PDA. Mikromorfologické znaky, hlavička konídií A. favus pri 400-násobnom zväčšení. C PCR amplikón oblasti ITS A. favus s 500 bp, normalizujúci sa na 1 kb rebrík (kat. č. SM0312). D Fylogenetická analýza ITS A. favus metódou maximálnej pravdepodobnosti [44]