Krátka inhalácia sevofluranu môže znížiť tvorbu gliových jaziev po hypoxicko-ischemickom poranení mozgu u novorodených potkanov, časť 1

Abstraktné

Predchádzajúce štúdie ukázali, že postkondicionovanie sevofluranom môže poskytnúť neuroprotekciu po hypoxicko-ischemickom poškodení a zlepšiť funkciu učenia a pamäte pri vývoji mozgu hlodavcov.

Hypoxicko-ischemické poškodenie sa týka patologického stavu spôsobeného cerebrálnou ischémiou, hypoxiou, metabolickou poruchou a poškodením nervových buniek v dôsledku porúch kardiovaskulárneho a cerebrovaskulárneho systému. So sociálnym pokrokom a zmenami životného štýlu sa hypoxicko-ischemické poškodenie stáva čoraz bežnejším. Tento stav môže spôsobiť mnohé škody na ľudskom zdraví, vrátane ovplyvnenia inteligencie a pamäti.

Hoci hypoxia a ischémia môžu spôsobiť pokles funkcie mozgu, neznamená to, že bude negatívne ovplyvnená pamäť. Práve naopak, správnymi metódami môžeme zlepšiť pamäť a zvýšiť výkonnosť mozgu. Tu je niekoľko spôsobov, ako zlepšiť pamäť:

1. Zdravá strava: Vplyv stravy na pamäť je veľmi dôležitý. Potraviny bohaté na bielkoviny, vitamíny a minerály môžu pomôcť udržať zdravý nervový systém a funkciu myslenia.

2. Viac cvičte: Fyzické cvičenie môže podporiť krvný obeh, zvýšiť prietok kyslíka, posilniť imunitu tela a znížiť riziko chorôb. Cvičením môžete zlepšiť svoju pamäť.

3. Posilnite sebavedomie: Dôvera je dôležitým faktorom v pamäti človeka. Ak veríte, že dokážete splniť určitú úlohu, ľahko dosiahnete požadované výsledky a navyše si môžete efektívne zlepšiť pamäť.

Je vidieť, že hypoxicko-ischemické poškodenie nie je stav, ktorý nevyhnutne poškodí ľudskú pamäť. Pokiaľ ovládame správne metódy a dobre sa staráme o svoj mozog, môžeme prijať zdravú budúcnosť s pozitívnym prístupom. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál, ktorý má mnoho jedinečných účinkov, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinnosť Cistanche deserticola pochádza z viacerých aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Klasický Rice-Vannucciho model bol použitý na vyvolanie hypoxického ischemického poškodenia a novonarodené (postnatálny deň 7) potkany boli liečené 2,4 % sevofluranom počas 30 minút po hypoxicko-ischemickom poškodení.

Naše výsledky ukázali, že postkondicionovanie sevofluranom významne zlepšilo funkciu učenia a pamäte potkanov, znížilo astrogliózu a tvorbu glialscarov, zvýšilo počet dendritických tŕňov a chránilo histomorfológiu hipokampu. Mechanicky postkondicionovanie sevofluranom znížilo expresiu von Hippel-Lindau faktora indukovateľného hypoxiou-1 a zvýšilo expresiu DJ-1.

Injekcia 1,52 ug inhibítora hypoxiou indukovateľného faktora-1 YC-1 (Lificiguat) do ľavej laterálnej komory 30 minút pred hypoxicko-ischemickým poškodením zvrátila neuroprotekciu vyvolanú sevofluranom. Toto zistenie naznačuje, že sevofluran môže účinne zmierniť astrogliózu v hipokampe a znížiť poruchy učenia a pamäti spôsobené tvorbou gliových jaziev po hypoxicko-ischemickom poškodení.

Základný mechanizmus môže súvisieť s upregulovanou expresiou DJ{0}}, zníženou ubikvitináciou faktora indukujúceho hypoxiu-1 a stabilizovanou expresiou faktora indukovateľného hypoxiou-1. Táto štúdia bola schválená Výborom pre starostlivosť o laboratórne zvieratá Čínskej lekárskej univerzity v Číne (č. schválenia 2016PS337K) dňa 9. novembra 2016.

Kľúčové slová: poranenie mozgu; mozog; centrálny nervový systém; in vivo; zranenie; Model; plasticita; potkan; zotavenie; regenerácia; repairChinese Library Classification No. R453; R741; R614.2+1.

Úvod

Neonatálna hypoxicko-ischemická encefalopatia (HIE) je bežnou komplikáciou v novorodeneckom období spôsobenou mnohými faktormi, ako je novorodenecká asfyxia, vnútromaternicové ťažkosti a hyalinemembránové ochorenie (Douglas-Escobar a Weiss, 2015;Barkhuizen et al., 2017).

HIE je hlavnou príčinou úmrtí dojčiat a primárnym zdrojom neurologických následkov (Edwards a kol., 2010; Descloux a kol., 2015). Deväťdesiat percent ľudí, ktorí prežili HIE, má dlhodobú neurologickú dysfunkciu, ako sú poruchy učenia, kognitívne a motorické dysfunkcie a andepilepsia (Doi a kol., 2012; Davies a kol., 2019). Súčasná liečba HIE sa zameriava hlavne na symptomatickú liečbu vrátane mechanickej ventilácie, korekcie hypotenzie, suplementácie glukózy a podľa potreby na obmedzenie príjmu tekutín.

Vyžaduje sa však účinná liečba schopná zvrátiť alebo znížiť dlhodobé poškodenie mozgu (Stankowski a Gupta, 2011; Davidson a kol., 2015). Ako kľúčová súčasť učenia a rozpoznávania je hipokampus, vrátane gyrus dentatus (DG) , CA1 a CA3 regióny, sa podieľa na transformácii a integrácii periférnych informácií do nervových centier (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Hipokampus je precitlivený na hypoxicko-ischemické (HI) poškodenie, ktoré môže vyvolať apoptózu hipokampálnych neurónov, stimulovať nadmernú reaktívnu gliózu a viesť k tvorbe glialscaru (Hopkins a Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Proliferácia astrocytov je rozhodujúca pre utesnenie miesta infarktu, remodeláciu štruktúry hipokampu a dočasnú kontrolu miestnych imunitných reakcií počas akútnej fázy (Rolls et al., 2009).

Hypertrofia a tvorba gliových jaziev však prispievajú k aberantnej neurogenéze, bránia rastu dendritickej chrbtice a bránia tvaru synapsie, čo ďalej zhoršuje funkcie učenia a rozpoznávania (Yiuand He, 2006; Wanner a kol., 2008; Burda a Sofroniew, 2014; Pekny a kol. 2014; Shi a kol., 2017).

Gliálny fibrilárny kyslý proteín (GFAP) a chondroitín sulfátové proteoglykány, ako je neurokan, sú patologické markery astrogliózy a gliálnych jazvičiek, ktorých expresia môže byť upregulovaná vysoko aktivovanými astrocytmi (Pekny a Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Inhibícia astrogliózy a gliálnych jaziev teda môže byť terapeutickým cieľom pre HIE a jej dlhodobé neurologické následky.

Ukázalo sa, že aplikácia sevofluranu zmierňuje poškodenie HI u hlodavcov. Štúdie skúmajúce význam sevofluranového postconditioningu (SPC) na zmiernenie poškodenia HI zvýšením regulácie hypoxiou indukovateľného faktora-1 (HIF-1) u dospelých hlodavcov a novorodených potkanov identifikovali niekoľko potenciálnych mechanizmov (Wang et al., 2019b; Yanget al., 2019; Du et al., 2020;

Ako kľúčový fyziologický senzor hypoxie je HIF-1 transkripčný faktor so stovkami downstream molekúl zapojených do mechanizmov inischemickej tolerancie, ako je vaskulárny endotelový rastový faktor a erytropoetín (Na et al., 2015). Bolo overené, že hypoxické postkondicionovanie znižuje aktiváciu astrocytov a mikroglií po HI v mozgoch neonatálnych potkanov (Teo et al., 2015).

Preto sme predpokladali, že HIF-1 môže prispievať k zmierneniu tvorby gliových jaziev a astroglióze. HIF-1 môže konštitutívne existovať v neurónoch, čím sa rýchlo zvyšuje expresia a v hypoxických podmienkach sa hromadí. Keď sa však kyslík vráti do normálu, expresia HIF1 nemôže byť udržiavaná na dostatočne vysokej úrovni, aby nepretržite vykazovala neuroprotektívny účinok z dôvodu degradácie prolyl-hydroxylázy proteínmi a následnej ubikvitylácie von Hippel-Lindau (VHL) proteínmi (Berra et al., 2003; Zhang a kol., 2018).

DJ-1 (kódovaný Park7) je údajne neuroprotektívny proteín, najmä v oxidačných podmienkach (Aleyasin et al., 2007, 2010). potvrdené na modeli aParkinsonovej choroby (PD). Okrem toho Parsanejad et al. (2014) ukázali, že DJ-1 inhibuje ubikvityláciu závislú od VHL a stabilizuje expresiu HIF-1.

Predpokladali sme teda, že sevoflurán stabilizuje proteín HIF{0}} v hipokampe zvýšením regulácie DJ-1, aby sa inhibovala ubikvitylácia HIF{2}}, čím sa zlepšuje funkcia dlhodobého učenia a pamäte.

Na preskúmanie úlohy HIF-1 vo vzťahu medzi sevofluranom a astrogliózou sme použili YC-1 (Lificiguat), selektívneho antagonistu HIF-1, na úplnú inhibíciu expresie HIF-1 na post-transkripčnej úrovni. V tejto štúdii sme skúmali úlohu HIF-1a pri neuroprotekcii novorodeneckých potkanov HIE liečených SPC.

Materiály a metódy

Zvieratá
Výskum na zvieratách sa uskutočnil v synaptickom štádiu vývoja potkana, ktorý sa začína 7. deň po narodení (P7), čo zodpovedá dobe rastu ľudských dojčiat od neskorej gravidity do 3 rokov po narodení (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Sedemdňové potkany Sprague-Dawley s hmotnosťou 12–16 g boli vybrané z 20 gravidných potkanov (zakúpené v Laboratóriu nemocnice Shengjing, Čínska lekárska univerzita, Čína; pomer samcov/samic, 1:1).

Všetky potkany mali voľný prístup k vode a potrave a udržiavali sa pri štandardnej vlhkosti a teplote v laboratóriu s 12-hodinovými cyklami svetlo/tma (8:00/20:00). Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali podľa pokynov Národného inštitútu zdravia (Bethesda, MD, USA) pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat.

Výbor pre starostlivosť o laboratórne zvieratá Čínskej lekárskej univerzity formálne schválil opísané experimenty (Shenyang, Čína; schválenie č. 2016PS337K) 9. novembra 2016.

Z 25 gravidných potkanov sa vybralo 249 potkanov P7 a náhodne sa rozdelili do skupín na základe tabuľky náhodných čísel (Wang a kol., 2019a). Naša konečná analýza zahŕňala celkovo 201 novorodencov; miera úmrtnosti po liečbe HI bola 19 %.

Týchto 201 novorodených potkanov bolo náhodne rozdelených do štyroch skupín: falošné (n=54), HI (n=54), HI + sevofluran (HIS) (n=54) a HIS+ YC{{ 6}} (n=39) skupín. V každej skupine sa použilo 24 potkanov na test western blot, 5 sa použilo na imunohistochémiu a Golgiho farbenie a 10 sa použilo na behaviorálne testovanie. Zvyšných 45 potkanov v simulovaných, HI a HIS skupinách sa použilo na reverznú transkripčnú polymerázovú reťazovú reakciu (RT- PCR).

Experimentálny dizajn a vystavenie anestetiku

Použitý model HIE bol opísaný skôr (Zhao a kol., 2007; Grandvuillemin a kol., 2017). Na základe vzdialenosti medzi konečníkom a reprodukčnými orgánmi bola dokončená identifikácia pohlavia postnatálnych potkanov. Na vytvorenie modelu HIE bola hlava každého potkana P7 vložená do priehľadnej plastovej rúrky, ktorá bola pred uvoľnením sevofluranu utesnená bavlnou (Wang a kol., 2019a; Xue a kol., 2019).

Ľavá spoločná karotická artéria každého potkana bola trvalo podviazaná a medzi dvoma ligáciami bola artéria prerezaná; každá operácia bola ukončená do 5 minút. Následne sa potkany prebudili bez ovplyvnenia anestéziou a boli umiestnené späť do klietok svojej matky na 2 hodiny. Na podanie SPC sa potkany umiestnili do priehľadnej komory (Lingzhi Company, Hangzhou, Čína) pripojenej k odparovaču asevofluranu; jeden kanál pomáhal pri ventilácii, zatiaľ čo druhý odvádzal vzorku plynu z komory do monitora.

Komora bola ventilovaná 30 % 02 a 70 % N2 počas 2 hodín pre simulovanú skupinu, zatiaľ čo 8 % 02 a 92 % N2 boli podávané počas 2 hodín skupine HI. SPC sa nastavilo okamžite po HI: 2,4 % sevofluranu (1 minimálna alveolárna koncentrácia) inhalovali potkany v komore s atmosférou 30 % O2 a 70 % N2 a rýchlosťou prietoku vzduchu 2 l/min počas 30 minút. Vyhrievací bazén stabilizoval teplotu vo vnútri komory na 37 stupňov.

Podávanie liekov

Presne 30 minúty pred HI bolo 1,52 ug HIF-1 inhibítora (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) injikované do ľavej bočnej komory (Paxinos a Franklin, 2013) pomocou 5-striekačku μLHamilton (Yingweida Technology, Peking, Čína). Ako už bolo opísané, YC-1 bol rozpustený v umelej mozgovomiechovej tekutine v koncentrácii 0,304 ug/μl (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot analýza

Potkany P7 sa anestetizovali 2 % sevofluranom a hippokampálne tkanivá sa z mláďat extrahovali 12, 24 a 48 hodín a 28 dní po operácii. Po extrakcii sa tkanivá ihneď umiestnili na ľad.

Celkový supernatant proteínov sa izoloval pridaním rádioimunoprecipitačného testovacieho činidla (Beyotime, Haimen, Čína). Koncentrácie proteínov sa stanovili pomocou súpravy One BCA Kit (Beyotime).

Potom boli vzorky separované na 12,5 % dodecylsulfát-polyakrylamidových géloch a prenesené na nitrocelulózové membrány. Po blokovaní 5 % hovädzím sérovým albumínom (Sigma-Aldrich) pri 4 stupňoch bola membrána inkubovaná s vhodnými primárnymi protilátkami, vrátane anti-glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH; 1:2000; kat. č. 5174S; CellSignaling Technology , Danvers, MA, USA), anti-DJ-1 (1:1000;kat.č. ab18257; Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo), anti-VHL (1:5000;polyklonálne;kat.č. ab77262; Abcam), proti -HIF-1 (1:900;polyklonálne; Cat# ab2185; Abcam), anti-neurocan (1:200;monoklonal; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas,TX, USA) , anti-postsynaptický denzitný proteín 95 (PSD95; 1:1000;monoklonálny; kat. č. 3409S; Cell Signaling Technology), anti-rastový proteín 43 (GAP43; 1:2000; polyklonálny;kat. č. 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology Chicago, IL, USA) a anti-GFAP (1:5000, polyklonálne, kat. č. ab53554; Abcam).

Potom sa bloty inkubovali s anti-králičím IgG (1:5000; kat. č. ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Peking, Čína) alebo anti-myším IgG (1:5000; kat. č. ZB-2301; Zhongshanjinqiao) 2 hodiny pri izbovej teplote.

Proteínové bloty sa vizualizovali pomocou vylepšených chemiluminiscenčných detekčných činidiel (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Proteínové pásy boli kvantifikované pomocou softvéru ImageJ (National Institutes ofHealth). Na analýzu western blotov sa údaje normalizovali na GAPDH.

Imunohistochémia

Dvadsaťosem dní po chirurgickom zákroku bolo potkanom podané anestetikum s použitím metódy opísanej vyššie, perfundované 4% formalínom a ich mozgy boli odstránené na imunofluorescenčné farbenie.

Mozgy boli ponorené do 4% paraformaldehydu pri 4 stupňoch na 48 hodín, následne dehydratované v etanolovej sérii a nakoniec vložené do parafínu. Potom boli tkanivá zaliate parafínom narezané na rezy s hrúbkou 2.{5}}μm pomocou vibratómu a výsledné rezy boli uložené pri izbovej teplote.

Každý mozog bol kontinuálne narezaný a tri diskontinuálne mozgové rezy boli vybrané na farbenie NeuN (marker neurónov), GFAP (marker astrocytov) a neurocan (marker gliálnej jazvy). GFAP (1:250; polyklonálny; Cat# ab53554; Abcam), králičie antigény (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) a/alebo myšací anti-neurocan (1:200; monoklonálny; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) pri 4 stupňoch cez noc vo zvlhčenej komore.

Následne boli rezy premyté 0.1 M fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokom a inkubované 2 hodiny pri izbovej teplote s príslušnými sekundárnymi protilátkami, vrátane anti-králičieho IgG konjugovaného s Alexa Fluor{5}} (1:200; Životnosť Technologies, Grand Island, NY, USA), anti-myší IgG konjugovaný s Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies) a anti-kozí IgG konjugovaný s fluoresceín izotiokyanátom (1:200; Life Technologies).

Kontrafarbenie bunkových jadier bolo realizované 4',6-diamidino-2-fenylindolom (Beyotime) počas 5 minút.

Na pozorovanie zafarbených rezov sa použil mikroskop Olympus BX51 (OlympusCorporation, Tokio, Japonsko). Z každého rezu boli náhodne vybrané tri zorné polia ľavého hipokampu na fotografovanie. Na odhad kvantitatívnej kolokalizácie a teda na výpočet Mandersovho koeficientu prekrytia sa použil softvér ImageJ.

For more information:1950477648nn@gmail.com