CaWRKY30 pozitívne reguluje imunitu korenia zacielením CaWRKY40 proti Ralstonia Solanacearum očkovaním prostredníctvom modulácie génov súvisiacich s obranou, časť 2

2.5. CaWRKY30 Prechodná nadmerná expresia stimulovaná HR-podobná bunková smrť, produkcia H2O2 a transkripčná upregulácia markerových génov súvisiacich s imunitou

Experimenty VIGS ukázali, že CaWRKY30 pozitívne reguluje imunitu papriky voči RSI. Experimenty s prechodnou nadmernou expresiou sa uskutočnili infiltráciou buniek GV3101 nesúcich 35S:00 (EV) alebo 35S: CaWRKY30 do listov papriky na ďalšie overenie tejto špekulácie. Študovali sme úlohu prechodnej nadmernej expresie CaWRKY30 na indukciu bunkovej smrti podobnej HR a akumuláciu H2O2 v rastlinách papriky. Expresia CaWRKY30 v rastlinách papriky bola stanovená experimentmi Western blotting (obrázok 5A).

Bunková smrť podobná HR a akumulácia H202 boli potvrdené farbením trypánovou modrou a DAB. Výsledky ukázali, že prechodná nadmerná expresia CaWRKY30 spôsobila bunkovú smrť podobnú HR a akumuláciu H2O2 v listoch papriky, ktorá sa prejavila tmavším farbením trypánovou modrou a tmavohnedým farbením DAB (obrázok 5B). Vodivosť sa uskutočnila na štúdium intenzity bunkovej nekrózy spôsobenej prechodnou nadmernou expresiou CaWRKY30 a výsledky ukázali, že listy papriky prechodne nadmerne exprimujúce CaWRKY30 vykazovali väčší únik iónov 24 a 48 hodín po Agro-infiltrácii v porovnaní s nadmernými listami papriky. exprimujúci prázdny vektor (obrázok 5C). Relatívne hladiny transkripčnej expresie markerových génov spojených s obranou, ako je CaPR1 súvisiaci s ET-biosyntézou, CaNPR1 súvisiaci so SA, CaABR1 reagujúci na ABA a markerový gén CaHIR1 spojený s HR, boli detegované analýzou qRT-PCR.

Naše výsledky ukázali, že prechodná nadmerná expresia CaWRKY30 v paprike zanecháva výrazne zosilnenú transkripčnú akumuláciu CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1 v paprike v porovnaní s prechodne nadmernou expresiou prázdnych vektorových rastlín papriky pri 48 dpi (obrázok 5D). Tieto výsledky ukazujú, že CaWRKY30 pôsobí ako pozitívny regulátor rastlinnej bunkovej smrti podobnej HR, produkcie H2O2 a transkripčnej upregulácie markerových génov súvisiacich s imunitou.

Obrázok 5. Prechodná nadmerná expresia CaWRKY30 indukovanej bunkovej smrti podobnej HR, akumulácie H202 a expresie markerových génov spojených s imunitou v listoch papriky. Úspešná nadmerná expresia CaWRKY30-Flag bola potvrdená experimentom western blotting (A), bunková smrť podobná HR spustená prechodnou nadmernou expresiou 35S: CaWRKY30, potvrdená detekciou fenotypu, expozíciou pod UV svetlom a farbenie DAB a trypánová modrá pri 48 hpi; Mierka=50 µm (B), Meranie úniku elektrolytu (iónová vodivosť) na odhadnutie odozvy bunkovej smrti v kotúčoch listov papriky po 24 a 48 hodinách po agroinfiltrácii (C), test qRT-PCR na skontrolujte hladiny transkripčnej expresie markerových génov spojených s imunitou, vrátane CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1 v 35S: CaWRKY30 exprimoval listy papriky pri 48 dpi (D). Relatívna úroveň expresie známych obranných markerových génov v listoch papriky prechodne nadmerne exprimujúcich prázdny vektor bola nastavená na "1". Údaje predstavujúce priemer ± SE zo štyroch biologických replikátov. Chybové úsečky sú štandardné chyby prostriedkov. Rôzne písmená nad stĺpcami označujú významné rozdiely medzi prostriedkami.

2.6. Vzájomný vzťah medzi CaWRKY30 a CaWRKY40

Uvádza sa, že rôzne WRKY TF tvoria siete spolu a predtým sme uviedli, že rôzni členovia WRKY TF, tj CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY40, sú navzájom výrazovo a funkčne prepojení. Preto predpokladáme, že CaWRKY30 sa môže týkať iných členov rodiny WRKY, vrátane CaWRKY40, čo je pozitívny regulátor imunity papriky proti RSI. Analýza qRT-PCR sa uskutočnila na ďalšie skúmanie možnej spätnoväzbovej regulácie CaWRKY40 pomocou CaWRKY30 a na štúdium potenciálnej modulácie CaWRKY30 pomocou testu prechodnej nadmernej expresie CaWRKY40 alebo umlčaním CaWRKY40 pomocou VIGS.

CaWRKY40 je transkripčný faktor WRKY, ktorý sa podieľa na reakciách rastlín na rôzne biotické a abiotické stresy. Štúdie ukázali, že CaWRKY40 je indukovaný v paradajkách a môže zvýšiť odolnosť rastlín pri suchom a nízkoteplotnom ošetrení. Okrem toho štúdia tiež zistila, že nadmerná expresia CaWRKY40 môže zlepšiť odolnosť paradajok voči suchu a zmierniť inhibíciu rastu spôsobenú soľným stresom, ale odolnosť voči patogénom si vyžaduje ďalšie štúdium. Preto CaWRKY40 hrá dôležitú úlohu v imunitnej odpovedi rastlín a má určitý potenciál pre zvýšenie poľnohospodárskeho výnosu. Zároveň treba dbať aj na našu imunitu. Imunita nášho tela je veľmi dôležitá. Cistanche má výrazný vplyv na zlepšenie imunity. Cistanche je bohatá na rôzne antioxidačné látky, ako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atď. Tieto zložky dokážu vychytávať voľné radikály, znižovať oxidačný stres a zlepšovať odolnosť imunitného systému.

Kliknite na doplnok cistanche deserticola

Naše výsledky vyjadrili transkripčné hladiny CaWRKY30 v listoch papriky, ktoré prechodne nadmerne exprimujú CaWRKY40, sa zvýšili na 24 a 48 hp v porovnaní s rastlinami prechodne nadmerne exprimujúcimi prázdny vektor (EV) (obrázok 6A), zatiaľ čo transkripčné hladiny CaWRKY40 sa v týchto rastlinách prechodne zvýšili. nadmerne exprimujúci CaWRKY30 v porovnaní s rastlinami prechodne nadmerne exprimujúcimi EV (obrázok 6B). Naopak, naše výsledky ukázali, že transkripčná akumulácia CaWRKY40 bola výrazne znížená v umlčaných rastlinách CaWRKY30- infikovaných Ralstoniou v porovnaní s neumlčanými rastlinami (obrázok 6C). Okrem toho bola transkripčná akumulácia známych markerových génov spojených s imunitou, napr. CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1 úplne alebo čiastočne potlačená v CaWRKY30 umlčaných rastlinách, ktoré boli spustené CaWRK40 (obrázok 6D).

Tieto údaje naznačujú transkripčnú reguláciu CaWRKY40 pomocou CaWRKY30 a prítomnosť pozitívnej regulačnej slučky zahŕňajúcej CaWRKY30 a CaWRKY40.

Obrázok 6. Vzájomný vzťah medzi CaWRKY30 a CaWRKY40. Transkripčný výraz lev. els CaWRKY40 v listoch papriky prechodne nadmerne exprimujú CaWRKY30 v časovom intervale 24 a 48 dpi (A), úrovne transkripčnej expresie CaWRKY30 v listoch papriky prechodne nadmerne exprimujú CaWRKY40 v časovom intervale 24 a 48 dpi (B), gRT-PCR analýza hladín transkripčnej expresie CaWRKY40 v CaWRKY30-umlčaných a neumlčaných rastlinách papriky pri 48 dpi (C)gRT-PCR test transkripčných hladín obranných markerových génov v CaWRKY{21}}umlčaných a neumlčané rastliny papriky prechodne nadmerne exprimujúce 35S: CaWRKY40-HA a 35S:00pri 48 hpi (D). Údaje sú priemer plus SE zo štyroch biologických replikátov. Chybové úsečky sú štandardné chyby prostriedkov. Rôzne písmená nad stĺpcami ukazujú významné rozdiely medzi prostriedkami.

2.7. Vzájomný vzťah medzi CaWRY30 a CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27

V našich predchádzajúcich štúdiách sa zistilo, že CaWRKY40 je expresne a funkčne spojený s rôznymi WRKY TF, ako sú CaWRKY6 a CaWRKY22. Vzťah medzi CaWRKY30 a CaWRKY40 naznačuje, že CaWRKY30 je pravdepodobne spojený s rôznymi WRKY TF, ktoré sa podieľajú na imunite papriky proti RSI. Na potvrdenie tohto predpokladu sa vykonala analýza RT-PCR na štúdium vzťahu medzi CaWRKY30 a rôznymi WRKY TF, o ktorých sa predtým uvádzalo, že sa podieľajú na imunite korenia proti RSI, vrátane CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27. Naše výsledky ukázali, že transkripčná akumulácia CaWRKY30 bola zosilnená v rastlinách CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27 prechodne nadmerne exprimujúcich papriku pri 48 dpi (obrázok 7A), zatiaľ čo transkripčná akumulácia CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27 bola prechodne zvýšená aj v listoch papriky. CaWRKY30 pri 48 dpi (obrázok 7B). Naše výsledky testu qRT-PCR naznačujú, že CaWRKY30 a CaWRKY6, CaWRKY22 a CaWRKY27 sú navzájom výrazovo a funkčne prepojené.

3. Diskusia

Proteín WRKY je jednou z najväčších rodín rastlinných transkripčných faktorov (TF). Je známe, že skupina členov rodiny WRKY TF, hlásených z Arabidopsis thaliana a Oryza sativa, sa zúčastňuje a zohráva kľúčovú úlohu v regulácii imunity rastlín. Boli hlásené značné funkčné variácie medzi úzko štruktúrnymi homológmi WRKY [17,48] a funkcie WRKY TF v imunite nemodelových rastlín, ako je korenie, nie sú dostatočne skúmané.

V súčasnej štúdii bol funkčne charakterizovaný CaWRKY30, gén skupiny Ill WRKY. Výsledky naznačujú, že CaWRKY30 pozitívne reguluje imunitu papriky proti RSl a je dôležitou zložkou siete WRKY zahŕňajúcej CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 a CaWRKY40. Zapletenie CaWRKY30 do imunity papriky je podporované cis-elementmi reagujúcimi na patogén, vrátane prvku TGA, TGACG-motifIATC-boxu, TATA-boxu a W-boxu prítomných v promótorovej oblasti CaWRKY30. Tento predpoklad bol v súlade s upreguláciou transkripčných hladín CaWRKY30 po a po exogénne dodávanom ETH, ABA a SA [49,50].

Pretože je často známe, že gény spustené vystavením určitému stresovému faktoru sa podieľajú na reakcii na tento stres [51], špekulovali sme, že CaWRKY30 by mohol pozitívne regulovať imunitu papriky voči RSI. Táto špekulácia bola podporená údajmi o umlčaní CaWRKY30 pomocou VIGS a testom prechodnej nadmernej expresie CaWRKY30. Táto obmedzená imunita v dôsledku straty funkcie CaWRKY30 bola sprevádzaná zosilneným rastom RSI a downreguláciou markerových génov súvisiacich s imunitou, ako je SA-dependentný CaPR1 (52CaNPR1 [53], CaDEF1 súvisiaci s JA (54], CaABR1 spojený s ABA [55) ] a CaHIR1 asociovaný s HR (561. Na druhej strane HR-podobná bunková smrť a sekrécia H202 boli spustené prechodnou nadmernou expresiou CaWRKY30 sprevádzanou transkripčnou upreguláciou markerových génov súvisiacich s imunitou, ako sú CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 a CaHIR1. To naznačuje úlohu CaWRKY30 ako pozitívneho regulátora bunkovej smrti podobnej HR a imunity papriky proti RSI. Podobne sa v predchádzajúcich štúdiách pozorovalo, že AtWRKY30, homológ CaWRKY30 v Arabidopsis, pozitívne reguluje im. -munitv proti biotickým a abiotickým stresom 157 581. To môže naznačovať, že CaWRKY30 je upregulovaný po infekcii Ralstonia, čo vedie k zníženej zraniteľnosti papriky voči infekcii bakteriálnym patogénom.

Fytohormóny ako ET, ABA a SA sú nevyhnutné signálne molekuly, ktoré sa podieľajú na reakcii rastlín na útoky patogénov a vysokoteplotný stres. Tie sa tiež podieľajú na presluchoch medzi reakciami rastlín na biotické a abiotické stresy [59]. SA podnecuje rezistenciu proti biotrofným patogénom, zatiaľ čo ET hrá dôležitú úlohu v imunite rastlín proti nekrotrofným patogénom [60]. Vo všeobecnosti je syntéza SA, ET a JA spojená s imunitou spúšťanou PAMP (PTI) alebo imunitou spúšťanou efektorom (ETI). Tieto fytohormóny môžu hrať svoju úlohu synergicky aj antagonisticky na základe ich koncentrácií počas obrannej signalizácie [61]. Synergická asociácia medzi týmito tromi signálnymi prvkami bola zistená v PTI, zatiaľ čo kompenzačná asociácia bola zistená v ETI [62]. CaWRKY30 bol neustále indukovaný exogénne dodávanými fytohormónmi. Známe markerové gény súvisiace s imunitou závislou od SA, ET a ABA, ako sú CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 a CaABR1, boli znížené umlčaním CaWRK30; boli však upregulované prechodnou nadmernou expresiou CaWRKY30 v rastlinách papriky, čo ukazuje, že CaWRKY30 sa podieľa na synergicky sprostredkovanej obrannej signalizácii SA, ET a ABA, čo vedie k PTI.

Analýza celého genómu ukázala zapojenie niekoľkých WRKY TF do imunity rastlín [63–65]. Podľa štúdií funkčnej genomiky, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] a -75 [78] boli funkčne charakterizované v imunite Arabidopsis, regulujúc imunitu pozitívne alebo negatívne. Tieto WRKY TF boli navrhnuté tak, aby sa usporiadali do WRKY transkripčnej siete, obsahujúcej kladné a záporné spätnoväzbové slučky a dopredné moduly [12]. Konfigurácia týchto sietí WRKY však zostáva zle pochopená.

V skorších štúdiách sme zistili, že CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 a CaWRKY40 sú pozitívne regulátory imunity papriky voči RSI [9,44,45], zatiaľ čo CaWRKY58 je negatívny regulátor [46]. Súčasná štúdia usudzuje, že CaWRKY30 pôsobí ako pozitívny regulátor pri bunkovej smrti podobnej HR paprike a reakcii papriky na infekciu R. solanacearum. Úrovne transkripčnej expresie CaWRKY30 boli upregulované po prechodnej nadmernej expresii CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 a CaWRKY40. Naopak, prechodná nadmerná expresia CaWRKY30 upregulovala transkripčnú akumuláciu CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 a CaWRKY40, čo naznačuje prítomnosť sietí WRKY TFs a plusové slučky spätnej väzby medzi CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY40 a CaWRKY. Predpokladá sa, že na imunite rastlín sa podieľajú podobné kladné spätné väzby [47]. Rovnaký druh kladnej spätnej väzby bol prítomný medzi CaWRKY40 a CaWRKY6, CaWRKY40 a CabZIP63, CaWRKY40 a CaCDPK15. V predchádzajúcich štúdiách sa tiež zistilo, že CaWRKY6 [44] a CabZIP63 [16] sa priamo a transkripčne podieľajú na regulácii expresie CaWRKY40 proti RSI. Vzhľadom na tieto výsledky možno navrhnúť, že CaWRKY40 môže byť koordinovaný rôznymi TF. Záverom možno povedať, že expresia CaWRKY40 je koregulovaná CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 a CabZIP63 po RSI a expresia CaWRKY40 je regulovaná CaWRKY6 a CabZIP63, ale nie CaWRKY30 v korení po vystavení vysokej teplote.

4. Materiály a metódy

4.1. Rastlinné materiály a podmienky rastu

Semená kultivaru papriky 'Mexi' a Nicotiana benthamiana boli získané z Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Pakistan. Semená papriky a N. benthamiana boli zasadené do plastových kvetináčov so zmesou pôdy [rašelina a perlit; 2/1 (v/v)] a udržiavané v rastovej miestnosti za kontrolovaných podmienok, tj teplota 25 ◦C, intenzita svetla 60–70 µmol fotónov m−2 s −1 a 70 percent relatívna vlhkosť pri 16 hodinách svetla/8 h tmavá fotoperióda.

4.2. Generovanie vektorov

Na generovanie vektorov sa použila technika klonovania brány. Na konštrukciu satelitných vektorov sa CaWRKY30 ORF plnej dĺžky (s terminálnym kodónom alebo bez terminálneho kodónu) klonoval do vstupného vektora pDONR207 pomocou reakcie BP. Potom sa tento konštrukt preniesol do cieľových vektorov pMDC83, CD3687 (HA-tag), CD3688 (Flag-tag) a Pk7WG2 vykonaním LR reakcie, aby sa vytvorili vektory pre subcelulárnu lokalizáciu a nadmernú expresiu.

Na konštrukciu vektorov pre VIGS sa vybral 364 bps fragment v 30 -netranslatovanej oblasti (UTR) CaWRKY30 a špecificita sa potvrdila pomocou BLAST proti sekvencii genómu v databáze CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (prístup 29. októbra 2021)) a Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (prístup 29. októbra 2021)). Ďalej sa uskutočnila BP reakcia na klonovanie tohto fragmentu do pDONR207/201 potom, čo sa tento konštrukt preniesol do vektora PYL279 vykonaním LR reakcie.

4.3. Postupy rastu patogénu a inokulácie

Izolovali sme kompatibilný virulentný kmeň R. solanacearum z rastlín papriky infikovaných Ralstonia z Dera Ghazi Khan, Pakistan. Metóda tetrazóliumchloridu sa použila na purifikáciu exsudátov nadzemných častí cievneho tkaniva rastlín infikovaných patogénom [9,45]. Izolovaný R. solanacearum sa kultivoval v SPA médiu v termoregulačnej trepačke (200 g zemiakov, 20 g sacharózy, 3 g hovädzieho extraktu, 5 g tryptónu a 1 l dvakrát destilovanej H2O) pri 200 ot./min a 28 ◦C pre cez noc. Potom sa kultivovaný kmeň R. solanacearum centrifugoval pri 6500 pm a 28 °C počas 10 minút. Kvapalný supernatant po centrifugácii sa vylial a pelety na dne centrifugačnej skúmavky sa zriedili v sterilizovanom 10 mM roztoku MgCl2. Hustota bakteriálnych buniek bola upravená na 108 cfu ml-1 (OD{20}}.8).

Na štúdium účinkov RSI na transkripčné hladiny CaWRKY30 a na odolnosť rastlín papriky voči napadnutiu R. solanacearum bol vrchný tretí list rastlín papriky infiltrovaný 10 ul roztoku R. solanacearum injekčnou striekačkou bez ihly. Vzorky listov ošetrených patogénom boli zozbierané v špecifických časových bodoch na experimenty s histochemickým farbením (napr. farbenie DAB alebo farbenie trypánovou modrou), elektrickou vodivosťou, cfu a extrakciou RNA pre ďalšie experimenty. Pri fenotypizačnom experimente CaWRKY30-umlčaných a neumlčaných rastlín boli korene poškodené pomocou sklenenej tyčinky a infiltrované kompatibilným virulentným R. solanacearum. Rastliny sa udržiavali v rastovej komore v kontrolných podmienkach pri teplote 28 ± 2 ◦C, intenzite svetla 60–70 µmol fotónov m–2 s–1, 70-percentnej relatívnej vlhkosti a pod 16-svetlom/{{12 }}h tmavá fotoperióda po inokulácii R. solanacearum. Obrázky fenotypu boli zachytené po RSI v špecifických časových intervaloch.

4.4. Listová aplikácia fytohormónov

Na štúdium účinkov fytohormónov sa zdravé rastliny papriky postriekali 100 uM ETH, 100 uM ABA a 1 mM SA v štádiách štyroch listov. Falošné (kontrolné) rastliny boli ošetrené sterilnou ddH20. Vzorky ošetrené fytohormónmi sa odoberali v požadovaných časových bodoch na extrakciu RNA a ďalšie štúdium.

4.5. Vyšetrenie subcelulárnej lokalizácie CaWRKY30

Bunky Agrobacterium s 35S: CaWRKY30-GFP alebo 35S:GFP (kontrola) sa kultivovali cez noc v LB médiu obsahujúcom zodpovedajúce antibiotiká. Kultivačné médium sa centrifugovalo pri 6500 ot./min., tekutý supernatant sa vylial a peleta na dne sa zriedila v indukčnom médiu (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 a 150 uM acetosyringónu) a nastavila sa na OD{{ 10}}.8. Agrobacterium obsahujúce 35S: CaWRKY30-GFP a 35S:GFP boli injikované do listov N. benthamiana pomocou injekčnej striekačky bez ihly. Vyššie opísaná metóda bola použitá na farbenie 4,6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI) [9]. Pri 48 hpt boli pozorované fluorescenčné signály GFP a DAPI a obrázky boli zachytené laserovým skenovacím konfokálnym mikroskopom (TCS SP8, Leica, Solms, Nemecko) s excitačnou vlnovou dĺžkou 488 nm a pásmovou emisiou 505–530 nm. filter.

4.6. Histochemické farbenie

Histochemické farbenie (trypánová modrá a 3, 30 -diaminobenzidín) sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie [9,11,79]. Na vykonanie testu farbenia trypánovou modrou sa listy korenia varili v roztoku trypánovej modrej (10 ml kyseliny mliečnej, 10 ml glycerolu, 10 ml fenolu, 40 ml etanolu, 10 ml ddH20 a 1 ml trypánovej modrej) počas 30 minút. Potom sa listy udržiavali pri teplote miestnosti počas 8 hodín, ponorili sa do roztoku chloralhydrátu (2,5 g chloralhydrátu rozpusteného v 1 ml destilovanej vody) a odfarbili sa varom počas 30 minút. Roztok chloralhydrátu sa niekoľkokrát zmenil, aby sa znížilo pozadie, a potom sa vzorky umiestnili do 70 percentného glycerolu. Listy sa umiestnili do 1 mg/ml roztoku DAB cez noc na test farbenia DAB. Listy zafarbené DAB sa varili v zmesi kyselina mliečna:glycerol: absolútny etanol [1:1:3 (v/v/v)] a potom sa cez noc odfarbili v absolútnom etanole [80]. Obrázky trypánovej modrej a listov zafarbených DAB boli urobené fotoaparátom a svetelným mikroskopom (Leica, Wetzlar, Nemecko).

4.7. Umlčanie CaWRKY30 prostredníctvom vírusom indukovaného umlčania génov (VIGS)

Na umlčanie CaWRKY30 v rastlinách papriky sa použil už skôr opísaný systém na umlčanie génov vyvolaný vírusom (VIGS) založený na víruse tabakového rachotu (TRV) [47,81,82]. Konštrukty Agrobacterium GV3101 obsahujúce PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 a PYL279-PDS (OD600=0.8) sa zmiešali v pomere 1:1. Táto zmes bola infiltrovaná do 2-týždenných kotyledónov rastlín papriky injekčnou striekačkou bez ihly. Infiltrované rastliny sa inkubovali v rastovej komore počas 56 hodín v tme pri teplote 16 ◦C a 45 percent relatívnej vlhkosti a potom sa presunuli do rastovej miestnosti v kontrolovaných podmienkach pri 25 ± 2 ◦C, 60–70 µmol fotónov m-2 s -1 a relatívnou vlhkosťou 70 percent pri fotoperióde 16 h svetlo/8 h tma.

4.8. CaWRKY30 Prechodná nadmerná expresia v listoch papriky

Bunky Agrobacterium GV3101 obsahujúce CaWRKY30-Flag a EV sa kultivovali v LB médiu v termoregulačnej trepačke so zodpovedajúcimi antibiotikami cez noc do OD600=1.0. Potom boli tieto Agrobacterium GV3101 centrifugované pri 6000 pm a 28 °C počas 10 minút. Po odstredení sa kvapalný supernatant odstránil a tuhá peleta na dne sa zriedila na OD600=0,8 v indukčnom médiu (10 mM MES, pH 5,4, 10 mM MgCl2, 200 uM acetosyringón). Táto zmes bola infiltrovaná do listov injekčnou striekačkou bez ihly. Tieto prechodne nadmerne exprimované listy sa pozorovali na bunkovú smrť podobnú HR alebo sa odobrali vzorky na uskutočnenie experimentov s farbením DAB a trypánovou modrou a na izoláciu RNA pre ďalšie experimenty.

4.9. Extrakcia RNA a kvantitatívna RT-PCR v reálnom čase

Na extrakciu celkovej RNA zo vzoriek listov ošetrených rastlín papriky a z falošných sadeníc sa použila metóda TRIzol reagent (Invitrogen). Potom sa na reverznú transkripciu extrahovanej RNA použila súprava Prime Script RT-PCR (TaKaRa, Dalian, Čína). Na štúdium relatívnych transkripčných hladín cieľových markerových génov sa uskutočnila analýza qRT-PCR v reálnom čase. Spracovanie údajov sa uskutočnilo podľa skôr opísaných metód [45,82] so špecifickými primérmi (doplnková tabuľka S3), s použitím pokynov výrobcu pre systém Bio-Rad Real-time PCR (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) a Systém SYBR premix Ex Taq II (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Odhad ELEKTRICKEJ vodivosti

Elektrická vodivosť (únik iónov) sa vypočítala použitím metódy opísanej vyššie s malými zmenami [44,83]. Šesť listových kotúčikov (šírka 4 mm) sa získalo použitím dierovača. Disky sa trikrát premyli sterilizovanou ddH20 a okamžite sa inkubovali v 10 ml ddH20. Potom sa tieto listové kotúče udržiavali v jemne trepacom (60 ot./min.) trepačke pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Na zaznamenávanie údajov o elektrickej vodivosti sa použil merač vodivosti (Mettler Toledo 326 Mettler, Zurich, Švajčiarsko).

4.11. Imunoblotting

Na extrakciu proteínu z listov papriky bol použitý skôr opísaný postup proteínového extrakčného pufra [3]. Extrahovaný proteín sa inkuboval cez noc s antiHA agarózou pri 4 °C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Magnetická trhlina sa použila na zber guľôčok a trikrát sa premyla Tris pufrom (TBS) a tweenom 20 (0,05 percenta). Eluovaný proteín bol pozorovaný s použitím imunoblotu a anti-HA-peroxidázy (Abcam, Cambridge, UK).

5. Závery

Na záver sme toho názoru, že CaWRKY30 transkripčne aktivuje imunitu korenia proti RSI. Umlčanie CaWRKY30 pomocou VIGS obmedzilo imunitu rastlín papriky voči infekcii bakteriálnym patogénom, zatiaľ čo prechodná nadmerná expresia CaWRKY30 vyvolala rezistenciu voči R. solanacearum. Súhrnne je vytvorenie pozitívnej spätnej väzby a jej funkcia paralelne s inými TF dostatočným dôkazom jej aktivácie pri biotickom strese. Okrem toho navrhujeme vytvorenie stabilných transgénnych rastlín papriky CaWRKY30 a cieľového proteínu CaWRKY30, aby sme komplexne vysvetlili úlohu tohto génu proti bakteriálnym patogénom a tiež v rôznych metabolických dráhach.

Príspevky autora:

Konceptualizácia, AH, MIK, MA, BSA, ZL a ATKZ; Spracovanie údajov, AH, MIK a AME-S.; Formálna analýza, ZL a SF; Akvizícia financovania, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. a ATKZ; Administrácia projektu, AH a MIK; Zdroje, AH; Validácia, SM; Vizualizácia, SM a SF; Písanie – pôvodný návrh, AH a MIK; Písanie – recenzia a úprava, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF a ATKZ Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie:

Hlavný autor je vysoko zaviazaný pakistanskej komisii pre vysokoškolské vzdelávanie za finančnú pomoc pri realizácii tejto štúdie v rámci grantu SRGP č. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Súčasnú prácu financovalo číslo projektu výskumných pracovníkov univerzity Taif (TURSP2020/245), Univerzita Taif, Taif, Saudská Arábia. Štúdiu podporil aj projekt rozvojového fondu poľnohospodárskej a lesníckej univerzity Fujian (CXZX2018114, CXZX2020008A a CXZX2019024G).

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Všetky údaje sú v rukopise a jeho doplnkových súboroch.4

Konflikty záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Vplyv načasovania aplikácie FosetylAluminium na potlačenie strapky a ekonomickú návratnosť pšenice chlebovej (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, A.; Khan, MI; Arif, M.; Hussain, A.; Ullah, R.; Irfan, M.; Mahpara, S.; Shah, RU; Ansari, MJ; Kintl, A. Hlboké umiestnenie dusíkatého hnojiva zlepšuje výnos, efektivitu využitia dusíka a ekonomickú návratnosť presádzanej jemnej ryže. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, A.; Hussain, A.; Adnan, M.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, M.; Khan, KA; Ghramh, HA; On, S. Nový transkripčný faktor MYB CaPHL8 poskytuje vodítka o vývoji imunity papriky proti patogénu prenášanému pôdou. Microb. Patog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Zaynab, M.; Aqeel, M.; Anwar, M.; Ashraf, MF; Liu, Z.; Raza, A.; Mahpara, S. Molekulárna regulácia vrodenej imunity papriky a tolerancie stresu: Prehľad WRKY TF. Microb. Patog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Transkripčné profilovanie odhaľuje konzervované a druhovo špecifické obranné reakcie rastlín počas interakcie Physcomitrium patens s Botrytis cinerea. Plant Mol. Biol. 2021, 1.–21. [CrossRef]

6. Aerts, N.; Mendes, poslanec; van Wees, SC Viacnásobné úrovne presluchov v hormonálnych sieťach regulujúcich obranu rastlín. Závod J. 2021, 105, 489–504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Z.; Shi, L.; Weng, Y.; Zou, H.; Li, X.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, X.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 pôsobí ako nový cieľ WRKY40 na sprostredkovanie imunity papriky proti infekcii Ralstonia solanacearum. Mol. Interakcia medzi rastlinami a mikróbmi. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, A.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Optimalizácia geometrie výsadby pre systém medziplodín jačmeňa a egyptskej ďateliny v polosuchom subtropickom podnebí. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, A.; Li, X.; Weng, Y.; Liu, Z.; Ashraf, MF; Noman, A.; Yang, S.; Ifnan, M.; Qiu, S.; Yang, Y. CaWRKY22 pôsobí ako pozitívny regulátor v reakcii papriky na Ralstonia solanacearum vytváraním sietí s CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 a CaWRKY58. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, X.; Somssich, IE Objasnenie úlohy WRKY27 v mužskej sterilite u Arabidopsis. Rastlinný signál. Správaj sa. 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Y.; Liu, Z.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Noman, A.; Shen, L. CaWRKY40b v paprike pôsobí ako negatívny regulátor v reakcii na Ralstonia solanacearum priamou moduláciou obranných génov vrátane CaWRKY40. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, T.; Somssich, IE Siete transkripčných faktorov WRKY v obrannej signalizácii. Curr. Opin. Plant Biol. 2007, 10, 366–371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, M.; Oelmüller, R. WRKY transkripčné faktory: Jack of many trades in plants. Rastlinný signál. Správaj sa. 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Y.-P.; Xu, H.; Wang, B.; Su, X.-D. Kryštálové štruktúry N-terminálnych WRKY transkripčných faktorov a komplexov DNA. Proteínová bunka 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, X.; Li, C.; Wang, H.; Guo, Z. WRKY transkripčné faktory: Evolúcia, väzba a pôsobenie. Fytopatol. Res. 2019, 1, 13. [CrossRef]

16. Shen, L.; Liu, Z.; Yang, S.; Yang, T.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Y.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 pôsobí ako pozitívny regulátor počas Ralstonia solanacearum alebo výzvy vysokej teploty a vysokej vlhkosti v pozitívnej spätnej väzbe s CaWRKY40. J. Exp. Bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Regulácia špecializovaného metabolizmu pomocou WRKY transkripčných faktorov. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Áno, N.; Jiang, M.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY transkripčné faktory v reakciách rastlín na stres. J. Integr. Plant Biol. 2017, 59, 86–101. [CrossRef]

19. Yu, K.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Prospešné mikróby, ktoré prechádzajú do podzemia koreňovej imunity. Prostredie rastlinných buniek. 2019, 42, 2860–2870. [CrossRef]

20. Noman, A.; Liu, Z.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; He, S. Expresia a funkčné hodnotenie CaZNF830 počas reakcie papriky na Ralstonia solanacearum alebo vysokú teplotu a vlhkosť. Microb. Patog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. Noman, A.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Z.; On, S. CabZIP53 je cieľom CaWRKY40 a pôsobí ako pozitívny regulátor pri obrane papriky proti Ralstonia solanacearum a termotolerancii. Environ. Exp. Bot. 2019, 159, 138–148. [CrossRef]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Y.; Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Liu, Z.; Qiu, A.; Guan, D.; a kol. Capsicum annuum HsfB2a pozitívne reguluje reakciu na infekciu Ralstonia solanacearum alebo transkripčnú kaskádu tvoriacu vysokú teplotu a vysokú vlhkosť s CaWRKY6 a CaWRKY40. Plant Cell Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, K.; Ty, J.; Zhang, Y.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, X.; Zhu, X.; Jiang, S.; a kol. Sekvenovanie časového transkriptómu s vysokým rozlíšením odhaľuje ERF a WRKY ako hlavných hráčov v regulačných sieťach, ktoré sú základom sezamových reakcií na zamokrenie a obnovu. Genomika 2021, 113, 276–290. [CrossRef]

24. Yang, X.; Zhou, Z.; Fu, M.; Han, M.; Liu, Z.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Y.; Zhang, W.; a kol. Identifikácia génov rodiny WRKY v rámci celého transkriptomu a profilovanie ich expresie smerom k kyseline salicylovej v Camellia japonica. Rastlinný signál. Správaj sa. 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez, M.; Babar, M.; Iqbal, J.; Hasnain, M.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. In Silico štrukturálna a funkčná analýza génov Wrky1 a Wrky3 vo vybraných obilninách. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Y.-Y.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, H.-X.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, A.; a kol. SGT1 sa vyžaduje pri PcINF1/SRC2-1-indukovanej obrannej reakcii korenia prostredníctvom interakcie s SRC2-1. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Biologické aktivity červenej papriky (Capsicum annuum) a jej štipľavý princíp kapsaicínu: Prehľad. Crit. Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu, Z.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Y.; Weng, Y.; Li, X.; Hussain, A.; Noman, A.; He, S. Funkčná a promótorová analýza ChiIV3, chitinázy z papriky, v reakcii na infekciu Phytophthora capsici. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Ali, M.; Luo, D.-X.; Khan, A.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, H.-X.; Cheng, G.-X.; Mohamed, I.; Gong, Z.-H. Klasifikácia a analýza celého genómu génovej rodiny proteínov viažucich chitín v paprike (Capsicum annuum L.) a regulácia transkripcie na Phytophthora capsici, abiotické stresy a hormonálne aplikácie. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, A.; Liu, Z.; Aqeel, M.; Zainab, M.; Khan, MI; Hussain, A.; Ashraf, MF; Li, X.; Weng, Y.; He, S. Základné transkripčné faktory domény leucínového zipsu: Predvoje v imunite rastlín. Biotechnol. Lett. 2017, 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com