Autofágia sprostredkovaná chaperónom pri neurodegeneratívnych ochoreniach a akútnych neurologických inzultoch v centrálnom nervovom systéme 2. časť

4. Experimentálne výskumné nástroje na testovanie aktivity CMA

V tejto časti popisujeme experimentálne výskumné nástroje dostupné na testovanie aktivity CMA in vitro a in vivo. Metódy bežne používané na získanie informácií korelujú s aktivitou CMA, ako aj funkčnými testami CMA.

CMA (Certified Management Accountant) je profesionálna certifikácia manažérskeho účtovníka, ktorej cieľom je certifikovať ľudí, ktorí majú dostatočné prevádzkové schopnosti a odborné znalosti v oblasti manažérskeho účtovníctva. Pamäť, schopnosť ľudského mozgu, označuje schopnosť zapamätať si informácie, vedomosti alebo skúsenosti.

Medzi CMA a pamäťou existuje určitý vzťah. V prvom rade skúška CMA vyžaduje, aby si kandidáti zapamätali veľké množstvo vedomostných bodov a pojmov a zároveň od kandidátov vyžaduje, aby ovládali zručnosti na aplikáciu týchto vedomostných bodov. Preto vynikajúca pamäť bude hrať veľmi dôležitú úlohu pri dosahovaní dobrých výsledkov v skúške CMA.

Po druhé, pamäť sa dá zlepšiť učením a cvičením, čo tiež pomáha pri štúdiu na skúšku CMA. Napríklad opakovaným prezeraním vedomostných bodov, učením sa a zapamätávaním si informácií rôznymi spôsobmi a používaním pamäťových techník môžete zlepšiť pamäť a pomôcť kandidátom lepšie zvládnuť vedomostné body a zručnosti požadované pre skúšku CMA.

Napokon, štúdium CMA nie je len skúška, ale aj zlepšenie profesionálnej kvality. V kariérnom rozvoji, ak chcete lepšie uplatniť svoje profesionálne schopnosti, prirodzene potrebujete určitú pamäťovú schopnosť, ktorá vám pomôže lepšie plniť vaše pracovné úlohy.

Stručne povedané, existuje úzky vzťah medzi CMA a pamäťou. Pokus o zlepšenie pamäte vám pomôže nielen získať dobré známky, ale tiež vám pomôže lepšie dokončiť pracovné úlohy a uvedomiť si svoju osobnú hodnotu a kariérne úspechy, keď sa vaša kariéra vyvíja. Je vidieť, že musíme zlepšiť našu pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože má antioxidačné, protizápalové a anti-aging účinky, ktoré môžu pomôcť znížiť oxidáciu a zápal v mozgu, a tým chrániť zdravie nervový systém. Okrem toho môže Cistanche deserticola tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónovej siete. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, schopnosť učenia a rýchlosť myslenia a môžu tiež zabrániť výskytu kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.

Kliknutím na položku Know zvýšite výkon pamäte

4.1. Užitočné analýzy na monitorovanie aktivity CMA

Hodnotenie zmien v množstvách hlavných molekulárnych zložiek CMA možno použiť ako nepriamy spôsob hodnotenia aktivity CMA [46]. Okrem toho je možné analyzovať počet a distribúciu CMA-aktívnych lyzozómov, aby sa odvodili zmeny v aktivite CMA [46].

Tieto analýzy však poskytujú iba údaje korelujúce so stavom CMA. Preto by tieto analýzy mali byť doplnené funkčnými testami [47]. Imunoblotting a zobrazovanie na vyhodnotenie zmien hlavných zložiek CMA sú najčastejšie používané metódy na hodnotenie aktivity CMA.

Keďže lyzozomálne hladiny LAMP2A sú pre CMA obmedzené [48], zmeny v abundancii LAMP2Aproteínu v lyzozómoch zvyčajne korelujú s aktivitou CMA. Preto by sa pri zobrazovacích hodnoteniach mala analyzovať prítomnosť LAMP2A na lyzozomálnej membráne [47].

Imunoblotting pre LAMP2A s použitím frakcií obohatených o lyzozómy alebo aspoň frakcie membránových buniek je informatívnejší ako pri použití celkových celobunkových lyzátov [46]. Hladiny lyzozomálneho hsc70 tiež súvisia s aktivitou CMA [49].

Avšak hsc70 je jedným z najrozšírenejších bunkových chaperónov a frakcia nachádzajúca sa v lyzozómoch je malá. Imunoblotting pre hsc70 v celkových bunkových lyzátoch preto nie je informatívny pre CMA [46]. Kolokalizácia hsc70 s lyzozomálnymi markermi (napr. LAMP1) sa môže použiť na detekciu CMA-aktívnych lyzozómov [49].

Počet týchto lyzozómov kolokalizovaných s hsc70 v pomere k celému lyzozomálnemu poolu sa zvyšuje, keď je aktivovaná CMA [12]. Okrem toho analýza elektrónového mikroskopu s použitím imunogold farbenia pre hsc70 môže tiež poskytnúť informácie o súbore CMA-aktívnych lyzozómov [49].

V analýzach s použitím izolovaných lyzozómov z buniek alebo tkanív môžu zvýšené hladiny dobre známych substrátov CMA (napr. GAPDH) indikovať zníženú aktivitu CMA [46].

Vo všeobecnosti sú substráty CMA po translokácii rýchlo degradované [6]. Porovnanie lyzozomálnych hladín substrátov CMA v bunkách alebo zvieratách medzi modelmi ošetrenými alebo neošetrenými inhibítormi lyzozomálnych proteáz (tj leupeptínom) teda umožňuje meranie toku hodnôt CMA [24].

4.2. Funkčné testy

Niekoľko funkčných testov umožňuje sledovanie aktivity CMA v priebehu času v bunkách, tkanivách a izolovaných organelách.

4.2.1. Hodnotenie degradácie intracelulárneho proteínu

CMA môže byť degradovaných približne 30 % celkových cytosolických proteínov [9]. Skutočná frakcia cytosolického proteínu degradovaného CMA sa však líši v závislosti od typu bunky a bunkových podmienok [6].

Preto je meranie zásoby bunkových proteínov, ktoré podliehajú degradácii prostredníctvom CMA, bežnou metódou na stanovenie celkovej aktivity dráhy CMA [46].

Na rozlíšenie proteínov podliehajúcich degradácii CMA od proteínov riadených inými cestami možno použiť pulzné a chase experimenty s použitím rádioaktívne značenej aminokyseliny a inhibítorov buď lyzozomálnych proteáz alebo iných autofagických dráh [50].

4.2.2. Fotokonvertibilní reportéri CMA

Okrem toho by bola metóda monitorovania lyzozomálnej asociácie umelých fluorescenčných reportérov CMA tiež užitočná na sledovanie dodávania substrátu a degradácie prostredníctvom CMA [51].

Pomocou fotokonvertibilných fluorescenčných reportérov [51] je možné sledovať asociáciu fotokonvertovaného proteínu s lyzozómami v inom fluorescenčnom kanáli. Zvýšenie počtu fluorescenčných bodov na bunku by bolo dobrým indikátorom aktivácie CMA [46].

4.2.3. In vitro analýzy CMA s použitím izolovaných lyzozómov

Cross-talk medzi rôznymi autofagickými dráhami sťažuje presné posúdenie aktivity CMA v intaktných bunkách [41]. Preto musíme samostatne analyzovať všetky funkčné kroky zapojené do procesu dynamickej degradácie dráh CMA [46,49].

Najspoľahlivejší prístup na analýzu aktivity CMA je získaný in vitro rekonštitúciou CMA s izolovanými lyzozómami [52]. Izolácia špecifickej frakcie lyzozómov aktívnych v CMA umožňuje analýzu obsahu endogénnych substrátov CMA v kompartmentoch CMA [47].

Izolované lyzozómy tiež umožňujú rekonštitúciu CMA in vitro, aby nasledovali kroky spojené s väzbou CMA na substrát, lyzozomálnym vychytávaním a lyzozomálnou degradáciou [50].

Liečba inhibítormi lyzozomálnych proteáz, po ktorej nasleduje inkubácia so substrátom CMA, umožní meranie naviazaného na substrát a translokáciu do lyzozómov (väzba a vychytávanie) [39].

Odpočítaním množstva substrátu naviazaného na lyzozóm, ktorému sa nezabránilo proteolýze, by potom bolo možné vypočítať vychytávanie [39,53].

Izolované lyzozomálne frakcie tiež umožňujú priame porovnanie zmien v obsahu, posttranslačnú modifikáciu a organizáciu zložiek CMA na lyzozomálnej membráne. Zníženie hladín lyzozomálneho LAMP2A alebo lys-hsc70 v izolovaných lyzozómoch naznačuje zníženú aktivitu CMA [54,55], zatiaľ čo zvýšenie hladín LAMP2A naznačuje upreguláciu aktivity CMA [56].

Okrem toho, pomer lyzozomálnej LAMP2A zostavenej do multimérneho komplexu v danom čase možno určiť pomocou bluenatívnej elektroforézy izolovaných lyzozómov a imunoblotu pre LAMP-2A [57].

5. Neurodegeneratívne choroby a CMA

Neuróny sú postmitotické bunky a vyžadujú účinný mechanizmus degradácie proteínov na udržanie bunkovej homeostázy v stresových podmienkach [58,59]. Porucha procesu degradácie proteínov v CNS spôsobuje agregáciu aberantných alebo poškodených proteínov, čo je charakteristická črta mnohých neurodegeneratívnych ochorení.

Boli zhromaždené podstatné dôkazy, že dysfunkcia CMA je spojená s rôznymi patologiami pri rôznych neurodegeneratívnych ochoreniach postihujúcich CNS [1,14].

Pri týchto ochoreniach boli ako substráty CMA identifikované rôzne patogénne proteíny, ako napríklad -synukleín pri PD [60], tauproteín pri AD [61], huntingtín (Htt) pri HD [62,63] a TDP{5} } v ALS a FTLD [64,65].

5.1. Parkinsonova choroba

PD je jednou z najčastejších neurodegeneratívnych porúch. Hlavnými patologickými znakmi PD sú postupná strata dopaminergných neurónov v substantia nigra a agregácia proteínu -synukleínu v Lewyho telieskach.

Početné štúdie ukázali, že poškodenie CMA súvisí s hlavnou patogenézou PD [4,66]. U pacientov s PD je hladina proteínu LAMP2A v mozgu znížená, čo naznačuje, že aktivita CMA je oslabená [67,68].

Mnohé predchádzajúce štúdie naznačili, že inhibícia CMAdegradačnej dráhy spôsobuje akumuláciu -synukleínu, ktorá je spojená s postupnou stratou dopamínergných neurónov [8].

Dôležité je, že mutantné formy A53T a A30P -synukleínu identifikované pri familiárnej PD nemôžu byť degradované pomocou CMA. Okrem toho sa tieto mutantné formy pevne viažu na LAMP2A na lyzozomálnej membráne a následne inhibujú normálnu degradáciu iných substrátov CMA in vitro [60,69]. Mutácia G2019S v proteíne kinázy 2 bohatej na leucín (LRRK2) môže byť patologickou príčinou familiárnej PD [70].

Mutant G2019S inhibuje dynamické zostavenie CMAtranslokačného komplexu na lyzozomálnej membráne, čo spôsobuje dysfunkciu CMA v amouse modeli PD a mozgu pacientov s mutantnou LRRK2 PD [25]. Okrem toho sa patogénne mutantné formy LRRK2 viažu na cytosolický Hsc70 a abnormálne interagujú so zložkami CMA, čím blokujú degradáciu iných substrátov CMA a neuronálnu proteinhomeostázu in vitro [25,71].

Ubikvitínová C-terminálna hydroláza L1 (UCH-L1) fyzicky interaguje s LAMP-2A, Hsc70 a Hsp90 a je zapojená do regulačného mechanizmu dráhy CMA [72]. V predchádzajúcej štúdii bola mutantná forma I93M UCH-L1 bol identifikovaný v jednej rodine PD [73].

Tiež sa uvádza, že mutácia I93M v UCH-L1 abnormálne zosilnila interakciu s cytosolickou oblasťou LAMP2A, čím inhibovala dráhu CMA in vitro [74]. Okrem toho expresia I93M mutantnej formy UCH-L1 cicavčích buniek indukovala zvýšenie množstva synukleínu spojené s CMA inhibíciou [74].

Tieto zistenia naznačujú, že aberantná interakcia I93M mutantnej formy UCH-L1 s mechanizmom CMA môže byť základom patogenézy PD spojenej s agregáciou -synukleínu. Proteín 7 Parkinsonovej choroby (PARK7), známy aj ako DJ-1, je multifunkčný proteín zapojený do rôznych bunkových aktivít, vrátane odolnosti voči oxidácii [75].

PARK7/DJ-1hrá dôležitú úlohu pri udržiavaní mitochondriálnej homeostázy [75]. Uvádza sa, že mutácia v géne DJ-1 sprostredkováva autozomálne recesívne a skoré formy PD [76]. Nedostatok DJ-1 urýchlil degradáciu LAMP2A v lyzozómoch, čo viedlo k agregácii -synukleínu [77 ].

Na rozdiel od toho DJ-1 bol schopný inhibovať akumuláciu -synukleínu reguláciou CMA [78]. Celkovo sa za základ patogenézy PD považujú rôzne molekulárne mechanizmy spôsobujúce dysfunkciu CMA.

Patologické mechanizmy spojené s CMA však zostávajú do značnej miery nejasné. Na objasnenie vzťahu medzi procesom CMA a skutočnými patológiami PD bude potrebný ďalší výskum.

5.2. Alzheimerova choroba

AD je najčastejším neurodegeneratívnym ochorením u starších ľudí. Hlavnou patogenézou AD je tvorba amyloidných plakov a agregácia Tau spôsobená poruchou homeostázy proteínov. Niekoľko proteínov súvisiacich s AD bolo identifikovaných ako CMA substráty. Ukázalo sa, že degradácia CMA týchto proteínových substrátov je u pacientov s AD narušená [45,61,79].

Progresívna akumulácia amyloidných oligomérov je centrálnym toxickým javom pri AD [80,81]. Nedávna štúdia ukázala, že označovanie amyloidových oligomérov viacerými KFERQ motívmi podporilo ich vstup do endozómov a lyzozómov a chránilo ľudské primárne kultivované kortikálne neuróny pred neurotoxicitou [82]. Amyloidový prekurzorový proteín (APP) je dôležitou patogénnou molekulou pri AD, pretože ho možno spracovať na amyloid[83].

APP obsahuje na svojom C-konci motív podobný KFERQ. Tento motív je dôležitý pre normálne spracovanie a degradáciu APP, aby sa zabránilo akumulácii APP-C-terminálnych fragmentov [84]. Nedávna štúdia odhalila, že APP je substrát CMA, ktorý sa viaže na Hsc70 [85].

Inhibícia degradácie CMA APP zvyšuje jeho cytotoxicitu. Okrem toho aktivácia CMA nadmernou expresiou Hsc70 alebo metformínom znížila nahromadené hladiny amyloidných plakov v mozgu a zvrátila molekulárne a behaviorálne fenotypy AD na myšom modeli AD [85]. Tau je cytosolický proteín, ktorý normálne stabilizuje mikrotubuly v neurónových bunkách.

Tauproteín má CMA-cieliace motívy a môže byť degradovaný CMA dráhou [79]. Agregácia mutantných proteínov Tau, ktorá vedie k hyperfosforylácii Tau a tvorbe neurofibrilárnych klbiek, je charakteristickým znakom AD a súvisiacich tauopatií [86,87].

Okrem toho môžu mutantné Tau proteíny abnormálne interagovať s LAMP2A a inhibovať translokáciu do lúmenu lyzozómu, čím zhoršujú aktivitu CMA [79]. Regulátor kalcineurínu 1 (RCAN1) je substrátom CMA [45] a je zvýšený u pacientov s AD [88].

RCAN1 je inhibítor defosforylácie Tau proteínov závislej od kalcineurínu. Dôležité je, že aktivita CMA môže byť inhibovaná zvýšením hladiny RCAN1, čím sa zhorší degradácia iných substrátov CMA [45].

5.3. Huntingtonova choroba

HD je neurodegeneratívna porucha s neskorým nástupom charakterizovaná nekontrolovaným pohybom, demenciou a emočnou poruchou. HD je dominantne dedičné ochorenie spôsobené akumuláciou a agregáciou mutantného proteínu Htt v striatálnych a kortikálnych neurónoch.

Htt obsahuje abnormálne rozšírený N-terminálny polyglutamínový (polyQ) trakt [62,63,89]. Dysfunkcia degradácie Htt sa považuje za hlavnú patogenézu HD.

Predchádzajúce štúdie ukázali, že CMA sa podieľa na degradácii mutantného Htt v bunkových a myších modeloch HD [62]. Htt nesie domnelý motív KFERQ a interaguje s kľúčovými komponentmi CMA, Hsc70 a LAMP2A. Okrem toho mutant Htt s expanziou polyQ traktu vykazuje zhoršenú absorpciu CMA in vitro [89].

Na degradácii Htt sa podieľa nielen CMA, ale aj makroautofágia [90]. Htt sa môže viazať na LAMP2A aj na proteín Atg7 súvisiaci s makroautofágiou v procese degradácie [89,91,92].

Aktivita CMA je údajne upregulovaná v bunkových a zvieracích modeloch HD v počiatočnom štádiu ochorenia. V neskoršom štádiu ochorenia však aktivita CMA klesá [91]. Tieto zistenia naznačujú, že skoré zvýšenie aktivity CMA môže byť kompenzačnou reguláciou v reakcii na neefektívnosť makroautofágie. Pokles hladiny lyzozomálneho LAMP2A naznačuje, že dochádza k strate funkcie CMA v neskorej fáze HD [91].

5.4. Amyotrofická laterálna skleróza a frontotemporálna lobárna degenerácia

ALS a FTLD sú neurodegeneratívne ochorenia s mnohými podobnými klinickými a patologickými znakmi [93]. Transaktivačná odpoveď Proteín viažuci DNA 43 kDa (TDP-43) je ribonukleárny proteín regulujúci mnohé aspekty metabolizmu RNA.

Akumulácia TDP-43 C-terminálnych fragmentov v neurónových bunkách sa často zisťuje u pacientov s ALS a FTLD [65]. Akumulácia TDP-43 sa teda všeobecne považuje za charakteristický znak týchto chorôb.

Proteín TDP{0}} obsahuje motív podobný KFERQ viažuci sa na Hsc70 a môže byť degradovaný procesom CMA [94,95]. Expresia Hsc70 bola údajne znížená v lymfomonocytoch sporadických pacientov s ALS a prispela k akumulácii TDP-43 [64].

Mutácia motívu podobného KFERQ v TDP-43 môže narušiť jeho degradáciu prostredníctvom CMA, čo indukuje akumuláciu TDP-43 a inhibíciu CMA v kultivovaných bunkách [94]. CMA môže pomôcť kontrolovať obrat fyziologických a patologických foriem TDP-43 [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com