Kapitola 1: Renálne tubulárne peroxizómy sú nevyhnutné pre normálnu funkciu obličiek

Pre viac informácií kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Peroxizómy sú špecializované bunkové organely zapojené do rôznych metabolických procesov. U ľudí spôsobujú mutácie vedúce k úplnej strate peroxizómov multiorgánové zlyhanie (poruchy Zellwegerovho spektra, ZSD), vrátaneporucha funkcie obličiek. Avšak (pato)fyziologická úloha peroxizómov vobličkyzostáva neznámy. Venovali sme sa úlohe peroxizómov vfunkcie obličieku myší s podmienenou abláciou peroxizomálnej biogenézy v renálnom tubule (myši cKO). Funkčné analýzy neodhalili žiadny zjavný fenotyp obličiek u myší cKO. Dojčatá samce cKO myší však mali nižšiu telesnú hmotnosť a hmotnosť obličiek a dospelí samci cKO myší vykazovali podstatné zníženie hmotnosti obličiek a pomeru hmotnosti obličiek/telesnej hmotnosti. Stereologická analýza ukázala zvýšenie hustoty mitochondrií v bunkách proximálnych tubulov cKO myší. Integrované analýzy transkriptómu a metabolómu odhalili hlboké preprogramovanie niekoľkých metabolických dráh, vrátane metabolizmu glutatiónu a biosyntézy/biotransformácie niekoľkých hlavných tried lipidov. Hoci táto analýza navrhla kompenzovaťoxidačný stres, výzva s kŕmením s vysokým obsahom tuku neindukovala významné poškodenie obličiek u cKO myší. Ukazujeme, že renálne tubulárne peroxizómy sú pre normálnu funkciu obličiek nepostrádateľné. Naše údaje tiež naznačujú, že poruchy funkcie obličiek u pacientov so ZSD sú extrarenálneho pôvodu.

Kliknutím sem sa dozviete o výhodách extraktu z cistanche tubulosa

Úvod

Peroxizómy sú organely viazané na jednu membránu, ktoré prvýkrát našiel v obličkách myší Rhodin v roku 1954(1). Súčasné odhady naznačujú, že peroxizómy obsahujú viac ako 50 enzýmov zapojených do rôznych bunkových funkcií, vrátane -oxidácie mastných kyselín s veľmi dlhým reťazcom (VLCFA), mastných kyselín s dlhým reťazcom (LCFA) a dikarboxylovej kyseliny s dlhým reťazcom; a- a -oxidácia mastných kyselín s rozvetveným reťazcom; oxidácia prostaglandínov a leukotriénov; metabolizmus aminokyselín; biosyntéza éterových fosfolipidov (vrátane plazmalogénov) a žlčových kyselín; redoxná homeostáza; detoxikácia glyoxylátom; a feroptóza. Peroxizómy sú všadeprítomne prítomné takmer vo všetkých cicavčích bunkách, s najvyšším zastúpením v bunkách proximálnych tubulov obličiek a hepatocytoch. V týchto bunkách peroxizómy zaberajú asi 3 percentá bunkového objemu, ale ich počet, veľkosť a tvar sa výrazne líšia počas embryonálneho a postembryonálneho vývoja (2); ich počet môže výrazne rásť v rôznych stresových podmienkach (3). Hoci mnohé peroxizomálne enzýmy boli dobre charakterizované, štúdie zaoberajúce sa ich expresiou a funkčnou úlohou v obličkách sú obmedzené. Okrem toho celkový funkčný význam peroxizómov v obličkách zostáva do značnej miery neznámy.

Dôkazy o úlohe peroxizómov v obličkovej (pato)fyziológii pochádzajú najmä zo štúdií ľudskej genetiky. Boli identifikované dva typy mutácií vedúcich k ľudským peroxizomálnym poruchám: (i) mutácie v takzvaných peroxínových (PEX) génoch zapojených do biogenézy peroxizómov a (ii) mutácie v špecifických peroxizomálnych enzýmoch. Prvý typ mutácie vedie k generalizovanej peroxizomálnej dysfunkcii spôsobujúcej poruchy cerebrohepatorenálneho Zellwegerovho spektra (ZSD)(4). Dojčatá s ťažkými formami ZSD zvyčajne zomierajú počas prvého roku života na multiorgánové zlyhanie. Aj keď prítomnosť kortikálnych obličkových cýst a/alebo obličkových oxalátových kameňov u pacientov so ZSD bola v priebehu rokov dobre zdokumentovaná (5, 6), molekulárne mechanizmy vedúce k týmto poruchám zostávajú zatiaľ neznáme. Ďalšie možné renálne abnormality pri ZSD neboli skúmané, pretože v tomto ochorení dominujú neurologické komplikácie. Vplyv stredných alebo miernejších foriem ZSD na funkciu obličiek nebol systémovo hodnotený. Dôkazy spájajúce deficit jedného peroxizomálneho enzýmu s renálnou patofyziológiou sú tiež obmedzené.

Mutácie peroxizomálneho alanínu v pečeni: glyoxylátaminotransferáza kódovaná génom AGXT vedie k primárnej hyperoxalúrii typu I, ochoreniu charakterizovanému ukladaním kryštálov šťavelanu vápenatého v obličkách (prehľad v odkaze 7). Nedávno bola identifikovaná autozomálne dominantná mutácia vedúca k renálnemu Fanconiho syndrómu alebo generalizovanej dysfunkcii proximálneho tubulu v peroxizomálnom enzýme enoyl-CoA hydratáze a 3-hydroxy acyl CoA dehydrogenáze (EHHADH)(8) . Táto mutácia spôsobuje nesprávne zameranie EHHADH na mitochondrie a poškodenie mitochondriálnej funkcie. Genetické štúdie uskutočnené na kongénnych kmeňoch potkanov ukázali, že peroxizomálny enzým hydroxykyseliny oxidáza 2 (HAO2) môže hrať úlohu pri kontrole krvného tlaku (9,10). Či je však tento fenotyp spôsobený zmenenou funkciou HAO2 v obličkách alebo iných tkanivách, zostáva neznáme. Vo všeobecnosti stále chýbajú údaje zo zvieracích modelov s obličkovo špecifickými defektmi peroxizómovej biogenézy alebo obličkovo špecifickou inaktiváciou jedného peroxizomálneho enzýmu. Tu sme sa zaoberali úlohou peroxizómov vo funkcii obličiek u samcov a samíc myší s podmienenou abláciou peroxizomálnej biogenézy v renálnom tubule.

Výsledky

Generovanie a základná charakterizácia mláďat samcov a samíc myší s podmienenou abláciou peroxizomálnej biogenézy v renálnom tubule. Biogenéza peroxizómov v renálnom tubule bola narušená podmienečnou inaktiváciou Pex5 kódujúceho cytosolický peroxizómový targeting signál 1 (PTS1) receptora, ktorý je nevyhnutný pre import proteínov obsahujúcich PTS1 motív do peroxizómov (11,12). Podmienená delécia Pex5 v renálnom tubule bola dosiahnutá použitím doxycyklínom indukovateľného (DOX-indukovateľného) systému (myši PexSanlo/Pax8-rtTA/LC1, ref. 13). Pretože funkčný význam peroxizómov môže závisieť od veku(14), základná charakterizácia deficitu Pex5 v obličkách bola vykonaná u novorodencov aj dospelých myší. V experimentoch s malými myšami sa excízia floxovanej alely Pex5 dosiahla podávaním DOX (2 mg/ml v pitnej vode) gravidným samiciam v E14 a udržiavala sa až do P7. Dojčatá myši boli usmrtené v P28. Ako kontroly sa použili myši s genotypom Pex5oilo. Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 1A (doplnkový materiál dostupný online s týmto článkom; https://doi.org/10.1172/jci.insight.155836DS1), liečba DOX viedla k takmer úplnej excízii floxovanej alely Pex5 v Pexswn/Pax{{{ 29}}GTA/LC1 samce a samice malých myší. Analýza obličkových rezov neodhalila žiadne zjavné histologické abnormality alebo obličkové kamene u malých myší bez Pex.5 v obličkovom tubule (nezobrazené). Albuminúria chýbala v bodových vzorkách moču Pex5-bez malých mláďat myší obochpohlavia(Doplnkový obrázok 1B). Telesná hmotnosť (BW) a hmotnosť obličiek (KW), ale nie pomer KW/BW, boli nižšie u samcov myší bez Pex{1}} v porovnaní s kontrolami súrodencov (doplnkový obrázok 1C).

Generovanie a základná charakterizácia dospelých samcov a samíc myší s podmienenou abláciou peroxizomálnej biogenézy v renálnom tubule. Delécia Pex5 v obličkovom tubule dospelých myší bola vyvolaná 2-týždňovou liečbou DOX 8-týždňových samcov a samíc myší Pex5xio/Pax8-ntTA/LC1, ďalej len ako cKOm a cKOf myši, v tomto poradí (pozri Metódy). Paralelne bola rovnaká liečba DOX poskytnutá ich kontrolám z jedného vrhu (myši Pex5a/lx, ďalej označované ako Ctrlm a Ctrlf myši, v tomto poradí). Všetky experimenty na dospelých myšiach sa uskutočnili 4 týždne po ukončení liečby DOX. Ako je znázornené na obrázku 1A, expresia mRNA Pex5 bola významne znížená v obličkách myší cKOm aj cKOf. Avšak u cKOf myší bola tiež detegovateľná určitá reziduálna mRNA Pex5 s plnou dĺžkou, čo naznačuje neúplnú excíziu floxovanej alely. Podobne proteín PEX5 prakticky chýbal v obličkách cKOm myší, ale stále bol detegovateľný u cKOf myší, aj keď na podstatne nižšej úrovni. Tento rozdiel bol viditeľný, keď sa obličkové extrakty z myší cKOm a cKOf naniesli na rovnaký gél SDS-PAGE a spoločne sa imunoblotovali (obrázok 1B). Myši Kim aj cKOf boli životaschopné, nevykazovali žiadne zjavné abnormality a mali normálnu BW v porovnaní s kontrolnými myšami (doplnková tabuľka 1). Pomery KW a KW/BW boli podstatne nižšie u myší cKOm v porovnaní s myšami Ctrl, ale nie u myší cKOf v porovnaní s myšami Ctrlf (obrázky 1, C a D). Analýza 24-hodinových vzoriek moču a plazmy neodhalila účinok genotypu u myší oboch pohlaví, s výnimkou nižších hladín draslíka v plazme u myší cKOm v porovnaní s myšami Ctrl (doplnková tabuľka 1). Albuminúria chýbala v moči myší cKOm aj cKOf (doplnkový obrázok 2A). V obličkách cKOm myší neboli pozorované žiadne hrubé morfologické zmeny, usadeniny oxalátu vápenatého alebo akumulácia lipidov (doplnkový obrázok 2, BD).

Hodnotenie buniek proximálneho tubulu u dospelých cKO myší pomocou elektrónovej mikroskopie. Hodnotenie kôry obličiek elektrónovou mikroskopiou odhalilo vysoký počet peroxizómov v bunkách proximálnych tubulov myší Ctrlm a Ctrlf (obrázok 2, A a B). Peroxizómy prakticky chýbali v proximálnych tubuloch myší cKOm a cKOf (obrázok 2, Cand D). Stereologické nástroje sa použili na kvantitatívnu analýzu buniek

organely a bunkové rozmery v proximálnych tubuloch myší Ctrlm a cKOm. Objemová hustota peroxizómov (počet/μm² cytoplazmy) aj percento cytoplazmy obsadenej peroxizómami v bunkách proximálnych tubulov boli u cKOm myší dramaticky znížené (obrázok 3, A a B), naopak, mitochondriálna objemová hustota, ako aj percento cytoplazmy obsadenej mitochondriami v bunkách proximálnych tubulov sa zvýšilo u myší cKOm v porovnaní s myšami Ctrl (obrázok 3, C a D). Tiež objemová hustota a percento cytoplazmy obsadenej lyzozómami v bunkách proximálnych tubulov sa medzi myšami Kim a Ctrlm nelíšili (obrázok 3, E a F). Ako je znázornené na obrázku 3G, bunky proximálnych tubulov z myší cKOm mali tendenciu zmenšovať šírku buniek (P= 0.083).

Integrované transkriptomické a metabolomické analýzy naznačujú hlboké preprogramovanie metabolických, antioxidačných a lipidových syntéznych dráh v obličkách cKO myší. Na identifikáciu molekulárnych zmien v obličkách cKO myší (GSE179202) sa uskutočnilo integrované sekvenovanie hlbokého transkriptómu a analýza metabolómu. Porovnania transkriptómov odhalili 1350 transkriptov odlišne exprimovaných v obličkách myší Ctrlm a cKOm (obrázok 4A a doplnková tabuľka 2, FDR< 5%)and="" 121="" transcripts="" differentially="" expressed="" in="" kidneys="" of="" ctrlf="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 4b="" and="" supplemental="" table="" 3,="">< 5%).="" 61="" differentially="" expressed="" transcripts="" were="" present="" in="" both="" sexes(figure="" 4c="" and="" supplemental="" figure="" 3).="" enrichment="" analysis="" of="" 100="" genes="" encoding="" proteins="" related="" to="" peroxisomal="" function(kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" [kegg]="" pathway="" hsa04146)performed="" on="" transcriptomes="" of="" ctrlm="" and="" ckom="" mice="" revealed="" 52="" transcripts="" either="" up-or="" downregulated="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 4d="" and="" supplemental="" figure="" 4).="" gene="" set="" enrichment="" analysis(gsea)="" performed="" on="" the="" kegg="" pathway="" database="" (release="" on="" december="" 11,="" 2020)showed="" downregulation="" of="" pathways="" related="" to="" the="" metabolism="" of="" pyruvate,="" glyoxylate="" and="" dicarboxylate,="" amino="" acids="" (arginine,="" proline,="" cysteine,="" methionine,="" tryptophan,="" alanine,="" and="" histidine),="" or="" glutathione(figure="" 4e="" and="" supplemental="" figure="" 5)="" and="" upregulation="" of="" pathways="" related="" to="" fatty="" acid="" synthesis="" and="" degradation,="" ppar="" signaling,="" and="" abc="" transporters="" (figure="" 4f="" and="" supplemental="" figure="" 6).="" no="" enrichment="" was="" found="" in="" pathways="" linked="" to="" inflammation="" or="" fibrosis.="" targeted="" analysis="" of="" several="" groups="" of="" functionally="" related="" genes="" that="" are="" not="" represented="" in="" kegg="" pathways="" revealed="" substantial="" changes="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" the="" peroxisomal="" metabolism="" of="" fatty="" acids="" (acsl1/3/4/6,="" acsvl1,="" acot3/4,="" acnat1,="" acox3,="" abcd3,="" ehhadh,="" and="" acaa1b),="" plasmalogen="" biosynthesis="" (far1="" and="" agps),="" bile="" acid="" synthesis(amacr="" and="" hsd17b4),="" and="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)="" detoxification(cat="" and="" sod1)="" (supplemental="" figure="" 3).="" alterations="" were="" also="" noted="" in="" the="" expression="" of="" a="" large="" number="" of="" genes="" critical="" for="" membrane="" transport="" processes="" in="" the="" proximal="" tubule,="" thick="" ascending="" limb="" (tal),="" and="" distal="" nephron(supplemental="" figure="" 7="" and="" supplemental="" table="" 4).="" for="" instance,="" in="" the="" proximal="" tubule,="" we="" found="" a="" reduction="" in="" the="" expression="" of="" an="" aquaporin-1="" water="" channel(agp1);="" megalin="" (lrp2);="" phosphate="" transporter="" napi-2a="" (slc34al);="" urate="" transporters="" uratl="" (slc22a12),="" npt1/4="" (sic17al/3),="" and="" oat1="" (slc22a6);="" and="" numerous="" other="" organic="" anion="" and="" amino="" acid="" transporters.="" in="" the="" tal="" and="" distal="" nephron,="" there="" was="" a="" substantial="" increase="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" proteins="" involved="" in="" sodium="" reabsorption:="" nkcc2="" (slc12a1),="" clc-kb="" (clcnkb),="" βenac="" (scnn1b)=""><0.05), and="" ncc="" (slc12a3)(fdr="">

<0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" alt="Figure 4. Transcriptional reprogramming in the kidneys of cKO mice. (A and B) Volcano plot representing the relative transcriptional expression of all renal transcripts in cKOm versus Ctrlm (A) or cKOf versus Ctrlf (B). Transcripts depicted in blue are significantly downregulated while transcripts depicted in red are significantly upregulated. (C) Venn diagrams showing the number of transcripts significantly downregulated or upregulated in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. A significant transcript regulation is considered when the adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Z celkového počtu 852 detegovaných metabolitov 207 vykazovalo rozdielne množstvo v obličkách myší Ctrlm a cKOm a 118 vykazovalo rozdielne množstvo v obličkách myší Ctrlf a cKOf (doplnková tabuľka 5, FDR<5%). seventy-nine="" metabolites="" demonstrating="" differential="" abundance="" were="" common="" in="" both="" comparisons(figure="" 5a="" and="" supplemental="" table="" 6).among="" metabolites="" showing="" the="" most="" significant="" differences="" were="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins(decreased="" abundance)and="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids="" (increased="" abundance)="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5b="" and="" supplemental="" figure="" 8,="" respectively).="" global="" analysis="" of="" metabolome="" confirmed="" that="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins="" constituted="" a="" majority="" of="" metabolites="" showing="" a="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5c).lcfa="" dicarboxylates,="" very="" long-chain="" fatty="" acyl-carnitines,="" phosphatidylcholines,="" and="" phosphatidylethanolamines="" were="" present="" among="" metabolites="" with="" increased="" abundance,="" in="" addition="" to="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids(figure="">

<0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" alt="Figure 5. Remodeling of the renal metabolome in cKO mice. (A) Venn diagrams representing the number of detected renal metabolites showing a significantly decreased or increased abundance in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. (B) Volcano plot representing the relative abundance of all detected metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm. Metabolites depicted with blue dots are significantly less abundant, and transcripts depicted with red dots are significantly more abundant in kidneys of cKOm mice as compared with Ctrlm mice. The names of some representative metabolites are depicted using colors shared for related metabolites. (C and D) Heatmaps of metabolites showing a significantly decreased (C) or increased (D) abundance in cKO mice of both sexes as compared with Ctrl mice. A significant difference of abundance is considered when adjusted P value from a 2-way ANOVA referred to as " fdr"="" is=""><0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Analýza spoločných dráh (MetaboAnalyst 5.0) transkriptov a metabolitov vykazujúcich zvýšený alebo znížený výskyt v obličkách cKOm myší v porovnaní s Ctrl myšami identifikoval 22 downregulovaných a 7 upregulovaných dráh (obrázok 6, A a B, v tomto poradí; FDR<0.1; supplemental="" table="" 7).="" nitrogen="" metabolism,="" pyruvate="" metabolism,="" glycolysis,="" and="" gluconeogenesis="" were="" identified="" among="" the="" downregulated="" pathways="" while="" fatty="" acid="" degradation="" was="" identified="" among="" the="" upregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b,="" respectively).="" glutathione="" metabolism="" and="" retinol="" metabolism="" were="" present="" among="" both="" up-and="" downregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b).="" detailed="" analysis="" of="" transcripts="" and="" metabolites="" related="" to="" glutathione="" metabolism="" identified="" 16="" transcripts="" and="" 3="" metabolites="" with="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 6,="" c="" and="" d,="" respectively),="" along="" with="" 6="" transcripts="" and="" 8="" metabolites="" exhibiting="" increased="" abundance(figure="" 6,="" e="" and="" f,="" respectively).="" the="" oxidized="" form="" of="" glutathione(gssg)was="" present="" in="" ckom="" but="" not="" in="" ctrlm="" mice,="" thereby="" suggesting="" oxidative="" stress="" in="" ckom="" mice(figure="">

<0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" alt="Figure 6. Joint analysis of transcriptional and metabolic changes in cKOm mice. (A and B) Scatter plot of significantly downregulated (A) or upregulated (B) metabolic pathways, based on a joint pathway analysis of both regulated transcripts and modulated metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm mice. Pathways are sorted by their absolute impact, and a significant pathway regulation is considered when adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Výzva kŕmenia s vysokým obsahom tukov nevedie u ckKOmice k ďalšiemu oxidačnému stresu. Zmeny v dráhach súvisiacich s glutatiónom, deplécia plazmogénov a znížená expresia katalázy naznačujú oxidačný stres a / alebo preskupenie rôznych antioxidačných obranných systémov v obličkách myší cKOm. Aby sme otestovali tieto hypotézy, vyzvali sme myši cKOm diétou s vysokým obsahom tukov (HFD) počas 4 týždňov. Táto výzva neviedla k albuminúrii, ale k zvýšeniu objemu moču a vylučovaniu vápnika a urátu močom. Nebol pozorovaný žiadny rozdiel v testovaných parametroch plazmy, vrátane kalcémie a urikémie (doplnková tabuľka 8). V obličkách myší Ctrlm a cKOm napadnutých HFD sa nezistili žiadne hrubé morfologické zmeny ani akumulácia lipidov (obrázok 7A). Celková a neenzymatická antioxidačná kapacita hodnotená testom Trolox (obrázok 7B), ako aj hladiny malondialdehydu v tkanivách, markera peroxidácie polynenasýtených mastných kyselín (obrázok 7C), sa medzi ošetreniami a genotypmi nelíšili. Množstvo produktu peroxidácie lipidov 4-hydroxynonenal (4-HNE) sa zvýšilo u Ctrlm myší liečených HFD v porovnaní s Ctrl myšami na kontrolnej diéte, ale nebol pozorovaný žiadny rozdiel u cKOm myší liečených 2 diéty (obrázok 7D).