Charakteristika kofeoylchínových kyselín z Lepisorus Thunbergianus a ich inhibičná aktivita na melanogenézu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung,* a Kooyeon Lee*

ABSTRAKT:Hyperpigmentácia spôsobená nadmernou aktiváciou tyrozinázy vedie k tmavším škvrnám alebo škvrnám na ľudskej koži. Hoci sú tieto javy neškodné, stále existuje veľký dopyt po inhibítoroch melanogenézy na prevenciu hyperpigmentácie inhibíciou tyrozinázy, enzýmu obmedzujúceho rýchlosť v melanogenéze. Hoci sa Lepisorus thunbergianus používal v ľudových liekoch ako diuretikum a hemostatikum, jeho účinok na melanogenézu ešte nebol zaznamenaný. V tejto štúdii sme pripravili extrakt L.thunbergianus a jeho rozpúšťadlové frakcie a vyhodnotili sme ich biologickú aktivitu proti voľným radikálom a syntéze melanínu. Extrakt z L. thunbergianus inhiboval aktivitu tyrozinázy húb účinnejšie ako arbutín in vitro as podobnou antioxidačnou aktivitou. Porovnávacie hodnotenie antimelanogenézy a antityrozinázovej aktivity rozpúšťadlových frakcií L. thunbergianus preukázalo, že inhibíciou tyrozinázovej aktivity má butanolová frakcia najvyšší potenciál na inhibíciu melanogenézy v bunkách melanómu. Štrukturálnou analýzou pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) a NMR spektroskopie sme zistili, že hlavnými zlúčeninami v butanolovej frakcii boli tri deriváty kyseliny kofeoylchínovej. Tieto tri deriváty mali in vitro podobné aktivity zachytávajúce radikály a antityrozinázu, zatiaľ čo iba kyselina 5-kafeoylchínová mala inhibičný účinok na melanogenézu indukovanú -MSH. Inhibičný účinok kyseliny 5-kafeoylchínovej bol overený stanovením obsahu melanínu a tyrozinázovej aktivity v melanóme po ošetrení buniek komerčnou zlúčeninou. Ďalej sme odhalili, že kyselina 5-kafeoylchínová inhibovala melanogenézu chelátovaním katiónu medi z komplexu meď-tyrozináza. Takže 5-kyselina kafeoylchinová alebo butanol izolovaný z L. thunbergianus môžu byť užitočné v kozmetike ako činidlo na bielenie pokožky.

Cistanche tubulosa: činidlo na bielenie pokožky.

ÚVOD

Melanín, skupina prírodných pigmentov, ktoré sa nachádzajú vo väčšine organizmov, hrá dôležitú úlohu pri hnednutí ovocia, húb a zeleniny a pigmentácii v ľudskej pokožke.1 Melanín sa vyrába z aminokyseliny tyrozínu viacstupňovým procesom, ktorý zahŕňa enzymatickú oxidáciu a polymerizáciu. 2 U ľudí je melanínový pigment syntetizovaný špecializovanými dendritickými bunkovými melanocytmi umiestnenými na spojení medzi epidermou a dermis, v ktorých je syntéza iniciovaná vystavením ultrafialovým (UV) lúčom.3 Melanínový pigment je transportovaný do keratinocytov, aby chránil pokožku pred UV žiarením a voľnými radikálmi; teda farba kože je určená vzorom distribúcie melanínového pigmentu.2 Dysregulácia syntézy melanínu vedie k mnohým formám hyperpigmentácie, ako je melazma, pehy, starecké škvrny, solárne lentigo, pozápalová hyperpigmentácia a iné hyperpigmentačné syndrómy.4 Viac ako sto proteínov súvisí so syntézou tomelanínu a medzi nimi je tyrozináza enzýmom obmedzujúcim rýchlosť, ktorý je považovaný za zodpovedný za syntézu formylanínu.5 Väčšina výskumných prác na prevenciu hyperpigmentácie sa teda zameriava na identifikáciu, izoláciu, syntézu a charakterizáciu nových účinných látok. inhibítory tyrozinázy na prevenciu melanogenézy.1,6 Množstvo inhibítorov tyrozinázy, ako je kyselina kojová, arbutín, hydrochinón, kyselina azelaová, kyselina ellagová a kyselina tranexámová, sa v kozmetickom priemysle bežne používajú ako antimelanogenézne činidlá; avšak kvôli obmedzeniam chemických liečiv, medzi ktoré patrí cytotoxicita a vedľajšie účinky, stále existuje dopyt po nových materiáloch so zlepšenou bezpečnosťou, stabilitou a účinnosťou.

Prírodné produkty vrátane rastlín, baktérií a húb sa stali alternatívnymi zdrojmi pre objavenie účinných zložiek na bielenie pokožky vďaka ich nižšej toxicite a lepšej biologickej kompatibilite a biologickej dostupnosti.1,8 Lepisorus thunbergianusis papraď patriaca do čeľade Polypodiaceae, ktorá rastie na starých skalách alebo kôry stromov a je distribuovaný v miernych oblastiach východnej Ázie, ako je Kórea, Japonsko, Čína, Filipíny a Indočína. L. thunbergianus sa používa ako adiuretikum, hemostatické činidlo a je antitusikum v kórejských ľudových liekoch. Predchádzajúce štúdie uvádzali, že extrakt z L. thunbergianuse má lokálnu antilipidovú peroxidačnú aktivitu v lokálnej a antioxidačnej aktivite.9 Okrem toho extrakt z L. thunbergianus vykazoval významnú inhibíciu rastu v bunkách rakoviny ústnej dutiny a hrubého čreva závislú od koncentrácie.10 Extrakt L. thunbergianus môže mať potenciálne aplikácie v kozmetickom priemysle, pretože táto rastlina obsahuje rôzne flavonoidové zlúčeniny a početné bioaktívne molekuly, medzi ktoré patrí kvercetín 3-metyléter-glukozid, vitexín, orientálny, periodický glukozid, izovitexín, orientín, korentín a kyselina kafeoylchinová.9a Účinky Syntéza extraktu z L. thunbergianus onmelanínu v melanocytoch musí byť ešte objasnená.

Obrázok 1. Analýza extraktu L. thunbergianus na (A) vychytávanie radikálov ABTS, (B) anti-tyrozinázu a (C) intracelulárne vychytávanie ROS

V tejto štúdii sme pripravili extrakt L. thunbergianus a jeho rozpúšťadlové frakcie sériovou frakcionáciou a skúmali sme inhibičné účinky rozpúšťadlových frakcií na biosyntézu melanínu v bunkách melanómu B16F10. Identifikovali sme butanolovú (n-BuOH) frakciu ako hlavnú časť obsahujúcu prírodný inhibítor a ďalej sme charakterizovali účinky derivátov kyseliny kafeoylchínovej izolovaných z extraktov L. thunbergianus na inhibíciu biosyntézy melanínu.

cistanche recenzia: anti-oxidácia

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Etanolový extrakt z L. thunbergianus zachytáva radikály kyseliny 2,2'-azinobis(3-etyl-benzotiazolín-6-}sulfónovej (ABTS) a inhibuje aktivitu tyrozinázy.

Extrakcia L. thunbergianus so 70 percentami etanolu (EtOH), aby sa posúdila potenciálna inhibičná aktivita prírodných zlúčenín v rastline. Aktivita zachytávania radikálov extraktu L.thunbergianus bola stanovená v koncentračnom rozsahu 2–200 ug/ml. Etanolový extrakt vykazoval od koncentrácie závislú aktivitu zachytávania radikálov s maximálnym účinkom pri 50 ug/ml, pričom výsledok bol konzistentný s výsledkom arbutínu použitého ako pozitívna kontrola (obrázok 1A).

Hodnotili sme aj inhibičný účinok extraktu na aktivitu tyrozinázy húb meraním rýchlosti syntézy dopacrómu katalyzovanej tyrozinázou. Etanolový extrakt inhiboval 87 percent tyrozinázovej aktivity pri 500 ug/ml, zatiaľ čo arbutín inhiboval len 38 percent tyrozinázovej aktivity pri rovnakej koncentrácii (obrázok 1B). Potom sme vyhodnotili vychytávaciu aktivitu extraktu na intracelulárne ROS zvýšené o 100 μM peroxidu vodíka. Ošetrenie peroxidom vodíka vyvolalo približne 2,{7}}násobné zvýšenie intracelulárnej hladiny ROS buniek B16F10 (obrázok 1C). Zistili sme, že zvýšenie intracelulárneho ROS sprostredkované peroxidom vodíka bolo vychytávané extraktom spôsobom závislým od dávky: maximálna vychytávacia aktivita pri 100 ug/ml bola 78 percent (obrázok 1C). Tieto výsledky naznačujú, že etanolový extrakt L. thunbergianus obsahuje bioaktívne zložky, ktoré inhibujú aktivitu tyrozinázy, ako aj zachytávanie ABTS radikálov a intracelulárnych ROS.

extrakt z cistanche deserticola: inhibuje aktivitu tyrozinázy.

Inhibičný potenciál frakcií L. thunbergianus proti melanogenéze.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, čo je v súlade s predchádzajúcou správou.10bOkrem toho sa inhibičné účinky rôznych frakcií rozpúšťadla na aktivitu tyrozinázy zvýšili spôsobom závislým od koncentrácie: maximálne inhibičné aktivity n-Hex a CH2Cl2 frakcií boli nižšie ako 65 percent, ale aktivity EtOAc a Frakcie n-BuOH boli nad 70 percent (obrázok 2B). Inhibičná aktivita bola v poradí n-BuOH > EtOAc > CH2CI2 > n-Hex. Tieto výsledky naznačujú, že hydrofilnejšie frakcie, vrátane frakcií n-BuOH a EtOAc, vykazovali vyššiu aktivitu zachytávania radikálov a lepšiu inhibičnú aktivitu ako lipofilné frakcie n-Hex a CH2CI2 .

Ďalej sa skúmali účinky rozpúšťadlových frakcií L. thunbergianus na proliferáciu buniek melanómu ošetrením buniek B16F10 200 ug/ml každej z rôznych frakcií alebo 2 mg/ml arbutínu v prítomnosť -melanocyty stimulujúceho hormónu (-MSH), o ktorom je dobre známe, že podporuje melanogenézu prostredníctvom indukcie transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF).11 Výsledky ukázali, že žiadna z frakcií nemala žiadny významný vplyv na proliferáciu melanómových buniek (obrázok 2C). Potom sme skúmali inhibičný účinok frakcií rozpúšťadla na melanogenézu stimulovanú -MSH v bunkách melanómu. Liečba -MSH vyvolala približne 2,{13}}násobné zvýšenie intracelulárneho obsahu melanínu v bunkách B16F10 (obrázok 2D). Zistili sme, že melanogenéza sprostredkovaná -MSH bola úplne inhibovaná frakciou n-BuOH (p < 0,01)="" a="" čiastočne="" inhibovaná="" frakciou="" etoac="" (40="" percent,="" p="">< 0,01),="" zatiaľ="" čo="" melanogenéza="" sprostredkovaná="" -msh="" nebola="" významne="" zmenená="" pomocou="" n-hex="" a="" ch2ci2="" frakcie="" (obrázok="" 2d).="" ďalej="" boli="" stanovené="" inhibičné="" účinky="" frakcií="" rozpúšťadla="" na="" aktiváciu="" tyrozinázy="" sprostredkovanú="" -msh,="" pretože="" tyrozináza="" hrá="" kľúčovú="" úlohu="" v="" melanogenéze.="" frakcie="" n-buoh="" (95="" percent,="" p="">< 0,001)="" a="" etoac="" (66="" percent,="" p="">< 0,001)="" zvrátili="" sprostredkovanú="" aktiváciu="" tyrozinázy="" pomocou="" -msh,="" zatiaľ="" čo="" frakcie="" n-hex="" a="" ch2ci2="" nie,="" ako="" je="" znázornené="" na="" obrázku="" 2e.="" okrem="" toho="" bol="" peroxidom="" vodíka="" stimulovaný="" čistiaci="" účinok="" rôznych="" frakcií="" rozpúšťadla="" na="" zvýšenie="" intracelulárneho="" ros.="" všetky="" frakcie="" rozpúšťadla="" zvrátili="" intracelulárne="" zvýšenie="" ros="" sprostredkované="" peroxidom="" vodíka,="" ako="" je="" znázornené="" na="" obrázku="" 2f.="" tieto="" výsledky="" ukazujú,="" že="" buoh="" frakcia="" l.="" thunbergianus="" inhibovala="" -msh-indukovanú="" melaninsyntézu="" inhibíciou="" intracelulárnej="" tyrozinázovej="" aktivity="" v="" b16f10="" bunkách.="" okrem="" toho="" tieto="" výsledky="" naznačujú,="" že="" bioaktívne="" zložky="" inhibujúce="" syntézu="" melanínu="" boli="" hydrofilné="" a="" nachádzali="" sa="" hlavne="" vo="" frakcii="">

Obrázok 2. Účinky frakcií rozpúšťadla na vychytávanie radikálov ABTS, anti-tyrozinázové a antimelanogenetické aktivity.

Identifikácia a charakterizácia bioaktívnych zlúčenín extraktu L. thunbergianus.

Na identifikáciu a charakterizáciu zložiek inhibujúcich melanogenézu sa vykonala analýza vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) pre všetky frakcie rozpúšťadiel. HPLC analýza frakcií rozpúšťadiel odhalila, že všetky frakcie obsahujú tri hlavné zlúčeniny v retenčných časoch 21, 28 a 29 minút pre zlúčeniny 1, 2 a 3 (obrázok 3A-D). Tieto tri hlavné zlúčeniny sa ďalej izolovali preparatívnou HPLC. Množstvá troch hlavných zlúčenín vo frakcii n-BuOH boli stanovené s použitím komerčných derivátov kyseliny kofeoylchínovej ako interných štandardných molekúl, podľa predchádzajúcej správy.12

Izolované zlúčeniny sa potom identifikovali porovnaním ich 1H a 13C NMR údajov s literatúrou a zistilo sa, že sú v súlade s navrhovanými štruktúrami (obrázok 4).13 Obrázok 3E ukazuje molekulárnu štruktúru troch zlúčenín. Zlúčenina 1 (výťažok 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH frakcia) sa získala ako svetložltý prášok. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,66 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,49 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1 H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1H, d, J=15,9 Hz), 5,20 ( 1H, m), 5,08 (1 H, brs), 4,89 (1 H, brs) 4,13 (1 H, m), 3,84 (1 H, m), 3,56 (1 H, s), 3,35 (1 H, s), 1,99 (1 H, m), 1,92 (1 H, m), 1,89 (1 H, m), 1,79 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5 (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 115,75, 11214725, 21,71, 115,75, 11214725, 21,71,83 Zlúčenina 1 bola NMR analýzou a porovnaním s predchádzajúcou literatúrou identifikovaná ako 3-kafeoylchinová kyselina.13b

Zlúčenina 2 (výťažok 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH frakcia) sa získala ako svetložltý prášok. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,64 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,52 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1 H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1 H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1 H, brs), 3,95 (1 H, m), 1,97 (2 H, m), 1,88 (1 H, m), 1,83 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 4214,63 4,0,86, 42,63, 4214,67 NMR analýzou a porovnaním s predchádzajúcou literatúrou bola zlúčenina 2 identifikovaná ako kyselina 5-kafeoylchínová.13c

Zlúčenina 3 (výťažok 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH frakcia) sa získala ako svetložltý prášok. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,64 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,52 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1 H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1 H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1 H, brs), 3,95 (1 H, m), 1,97 (2 H, m), 1,88 (1 H, m), 1,83 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 4214,63 4,0,86, 42,63, 4214,67 NMR analýzou a porovnaním s predchádzajúcou literatúrou bola zlúčenina 3 identifikovaná ako kyselina 4-kafeoylchínová.13a

Obrázok 3. HPLC chromatogramy (A) n-Hex, (B) CH2CI2, (C) EtOAc a (D) n-BuOH frakcií L. thunbergianus a (E) štruktúry troch hlavných zlúčenín.

Inhibičný potenciál derivátov kyseliny caffeoylchínovej izolovaných z L. thunbergianus proti melanogenéze.

Ďalej, aby sme identifikovali biologicky aktívnu zložku, ktorá je základom silnej anti-melanogenézy, určili sme inhibičnú aktivitu troch derivátov kyseliny kofeoylchínovej izolovanej z L. thunbergianus proti bunkám melanómu pri syntéze melanínu. Najprv sa skúmali účinky troch derivátov na zachytávanie radikálov ABTS. Výsledky ukázali, že tieto tri deriváty mali podobné aktivity zachytávania radikálov ABTS (obrázok 5A). Potom sme skúmali inhibičný účinok troch derivátov izolovaných z aktivity ontyrozinázy L. thunbergianus. Tieto tri deriváty vykazovali inhibíciu tyrozinázovej aktivity závislú od koncentrácie s maximálnou inhibíciou pri koncentrácii 200 uM (obrázok 5B). Ďalej sme skúmali inhibičný účinok týchto troch derivátov na syntézu melanínu indukovanú -MSH v bunkách B16F10. Liečba -MSH vyvolala približne 2,{11}}násobné zvýšenie intracelulárneho obsahu melanínu v bunkách B16F10 (obrázok 5C). Je zaujímavé, že zlúčeniny 1 (3-kafeoylchinová kyselina) a 3 (4-kafeoylchinová kyselina) významne zvýšili syntézu melanínu o 25 a 23 percent (obrázok 5C, s.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Obrázok 4. 1H NMR spektrá (A) 3-kafeoylchínovej kyseliny, (B) 4-kafeoylchínovej kyseliny a (C) 5-kafeoylchínovej kyseliny a13C NMR spektrá (D) {{ 6}}kyselina kafeoylchinová, (E) 4-kyselina kafeoylchinová a (F) 5-kyselina kafeoylchinová

Overenie antimelanogenéznej účinnosti kyseliny 5-kafeoylchínovej.

Aby sme overili inhibičný účinok kyseliny {{0}}kafeoylchínovej proti melanogenéze, určili sme inhibičný účinok komerčnej syntézy kyseliny 5-kafeoylchínovej na melanín sprostredkovanej -MSH. Liečba nižšími koncentráciami 0,1 a 0,2 mM 5-kofeoylchinónovej kyseliny mierne zvýšila syntézu melanínu a aktivitu intracelulárnej tyrozinázy, zatiaľ čo vyššie koncentrácie zlúčeniny 0,5 a 1 mm zvrátili melanogenézu sprostredkovanú MSH a intracelulárnu tyrozinázovú aktivitu (obrázok 6A, B), pričom výsledky sú v súlade s predchádzajúcou správou.14

Kyselina kafeoylchinová je fenolová zlúčenina vytvorená esterovou väzbou medzi kyselinou kávovou a kyselinou L-chinovou. Je známe, že deriváty kyseliny kofeoylchínovej majú antimelanogenézu a antityrozinázovú aktivitu, ako aj aktivitu zachytávajúcu ROS. Tyrozináza je multifunkčný metaloenzým obsahujúci meď s dvojmocnými katiónmi medi.1 Deriváty kyseliny kofeoylchínovej môžu inhibovať aktivitu tyrozinázy chelátovaním katiónu medi zodpovedného za udržanie aktívneho stavu tyrozinázy. Na predpovedanie interakcie medzi 5-kafeoylchinovou kyselinou a tyrozinázou sa uskutočnila výpočtová molekulárna dokovacia štúdia pomocou Maestroprogramu. Najlepšia poloha zlúčeniny, dokovanej totyrozinázy, je znázornená na obrázku 6C, D. Štúdia molekulového dokovania odhalila, že kyselina 5-kafeoylchínová interaguje s iónom medi vo vzdialenosti 2,43 Á a vytvára sériu π−πstohovania s His 259, Asn 260, His 85 a His 263 zvyšky a H-väzba s Arg 268. Okrem toho väzbová energia medzi tyrozinázou a kyselinou 5-kafeoylchinovou bola -4,425 kJ/mol. Tieto výsledky naznačujú, že kyselina 5-kafeoylchínová môže inhibovať aktivitu tyrozinázy chelátovaním medi. Aby sme overili inhibičný mechanizmus melanogenézy kyselinou 5-kafeoylchinínovou, určili sme schopnosť kyseliny 5-kafeoylchínovej chelatovať meď. Schopnosť kyseliny 5-kafeoylchínovej chelatovať meď sa zvýšila spôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 6E). Tento výsledok naznačuje, že kyselina 5-kafeoylchinová inhibuje syntézu melanínu prostredníctvom chelatácie katiónu medi interagujúceho s tyrozinázou.

Obrázok 5. Účinky troch derivátov kyseliny kofeoylchínovej na vychytávanie radikálov, in vitro anti-tyrozinázovú a anti-melanogenéznu aktivitu v bunkách B16F10.

MATERIÁLY A METÓDY

Materiály

L. thunbergianus bol zakúpený na online trhu www.jirisangol.com (Kórea) a pred použitím v tejto štúdii vysušený pri okolitých podmienkach. Činidlá, ako je kyselina 2,2′-zinokbis(3-etyl-benzotiazolín-6-sulfónová (ABTS) a 3-(4,5-dimetyltiazol-2- yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid (MTT), hormón stimulujúci melanocyty (-MSH) a enzýmy, ako je hubová tyrozináza, boli získané od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).Persíran draselný (K2S208), pyrokatecholová fialová a 3,4-dihydroxy-L-fenylalanín (L-DOPA) boli zakúpené od Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

Extrakcia a frakcionácia L. thunbergianus.

Sušená L. thunbergianus (80 g) bola rozdrvená na prášok pomocou drviča (HBL-3500S, Samyang Electronics, Kórea) a extrahovaná 70 percentným EtOH trikrát (vždy 800 ml) ) pri 70 stupňoch počas 3 dní. Výsledný extrakt sa vákuovo prefiltroval s použitím papiera Advantecfilter č. 1 a 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokio, Japonsko) a zahustením pomocou rotačného odparovača Hei-Vap Advantage (Heidolph, Nemecko) sa získalo 17,2 g surového extraktu EtOH. Tento surový extrakt sa suspendoval v dH20 (180 ml) a postupne frakcionoval s Hex, CH2CI2, EtOAc a n-BuOH, čím sa získal Hex (1,51 g, 8,8 percent), CH2CI2 (0,88 g, 5,1 percenta), EtOAc (3,95 g, 23,0 %) percent) a n-BuOH (3,02 g, 17,6 percent), ako bolo opísané vyššie.15 Výsledné extrakty a frakcie sa pred použitím vysušili mrazom a skladovali pri -80 stupňoch.

Stanovenie aktivity zachytávania voľných radikálov ABTS.

Na vyhodnotenie antioxidačnej aktivity extraktov L.thunbergianus a jeho rozpúšťadlových frakcií sa určila aktivita zachytávania radikálov ABTS, ako už bolo opísané.16 Na vytvorenie radikálu ABTS sa 10 ml 7 mMABTS zmiešalo so 176 μl 140 mM peroxydisíranom draselným v dH20 a pred použitím sa inkubovali v tme pri izbovej teplote (RT) počas 16 hodín. Roztok ABTS radikálov sa zriedil absolútnym metanolom, aby sa získala anabsorbancia takmer 0,7 pri 734 nm. Alikvóty 100 ul každého extraktu alebo frakcií v uvedenom koncentračnom rozsahu 2-200 ug/ml sa pridali do 100 ul zriedeného roztoku ABTS radikálov a inkubovali sa 10 minút v tme pri teplote miestnosti. Potom sa merala absorbancia pri 732 nm s použitím multimódovej čítačky mikrodoštičiek SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Aktivita zachytávania radikálov ABTS bola vypočítaná nasledovne

Aktivita ABTS odstraňovania radikálov ( percent ) =1−(Vzor/kontrola)×100 (1)

In vitro inhibícia tyrozinázy.

Inhibičný účinok extraktov L.thunbergianus a jeho rozpúšťadlových frakcií na tyrozinázovú aktivitu sa hodnotil podľa množstva dopachrómu syntetizovaného z katalytickej reakcie tyrozinázy. U/ml hubovej tyrozinázy v 50 mM fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS; 8,1 mM Na2HP04, 1,2 mM KH2P04, pH 6,8, 2,7 mMCI a 138 mM NaCl) v 96-jamkovej doštičke a inkubované 30 minút pri teplote miestnosti Potom sa do každej jamky pridalo 100 ul 1 mM L-DOPA a nasledovala inkubácia počas ďalších 10 minút pri 37 stupňoch. Absorbancia výsledného roztoku sa merala pri 475 nm s použitím multimódovej čítačky mikrodoštičiek SpectraMax M5.

Bunková kultúra.

Bunky myšacieho melanómu B16F10 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) doplnenom 10 percentami tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (Gibco), 100 jednotiek/ml penicilínu a 100 ug/ml streptom 7y (Gibco) pod zvlhčeným 5 percentným CO2.

Životaschopnosť buniek.

Životaschopnosť buniek B16F10 sa určila pomocou testu MTT, ako už bolo opísané.18 Stručne, bunky B16F10 sa naočkovali na 24-jamkové platne v hustote 1 x 104 buniek na jamku. Po 24 hodinách sa bunky ošetrili uvedenými koncentráciami extraktov alebo frakcií L. thunbergianus počas 48 hodín. Bunky sa potom inkubovali s roztokom MTT počas 4 hodín a redukované kryštály formazanu sa rozpustili v DMSO. Výsledný roztok sa preniesol na 96-jamkové doštičky a absorbancia sa merala pri 540 nm pomocou SpectraMax M5 multimode čítačky mikrodoštičiek.

Stanovenie intracelulárnych reaktívnych druhov kyslíka (ROS).

Intracelulárna hladina ROS sa merala pomocou súpravy na testovanie bunkového ROS DCF/H2DCFDA (ab113851, Abcam) podľa pokynov výrobcu. V stručnosti, B16F10 bunky boli nasadené na 48-jamkové platne v hustote 2 x 104 buniek na jamku. Po 24 hodinách kultivácie boli bunky ošetrené počas 1 hodiny s uvedenými koncentráciami extraktov L. thunbergianus alebo frakcií rozpúšťadla v kultivačnom médiu obsahujúcom 0,1 percenta bovinného sérového albumínu (BSA) bez fenolovej červene. Bunky boli potom inkubované so 100 uM peroxidom vodíka počas 30 minút. Po premytí PBS boli bunky ošetrené 25 uMH2DCFDA v PBS počas 45 minút. Úroveň ROS sa analyzovala čítačkou mikrodoštičiek (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) vybavenou fluorescenčným filtrom pri 485/545 nm (excitačná/emisná vlnová dĺžka). Priemerná relatívna intenzita fluorescencie kontroly sa rovnala 100 percentám, pričom podmienky liečby boli vypočítané proporcionálne.

Stanovenie obsahu melanínu.

Obsah melanínu bol stanovený, ako už bolo opísané, s určitými modifikáciami.19 Bunky melanómu sa kultivovali na šesťjamkovej platni počas 24 hodín. Boli ošetrené uvedenými koncentráciami extraktu L. thunbergianus alebo jeho frakcií rozpúšťadla počas ďalších 48 hodín v prítomnosti 100 nM -MSH. Po dvojnásobnom premytí vychladeným Dulbeccovým fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom doplneným chloridom vápenatým a chloridom horečnatým (D-PBS, Gibco), výsledné bunky sa oddelili inkubáciou s roztokom trypsínu-EDTA. Po centrifugácii pri 1000 ot./min počas 3 minút sa bunková peleta rozpustila v 150 ul 1 M NaOH obsahujúcom 10 percent DMSO počas 1 hodiny pri 60 stupňoch počas 1 hodiny. Obsah melanínu sa stanovil pomocou absorbancie pri 405 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek.

Extrakt z cistanche inhibuje melanín.

Stanovenie aktivity bunkovej tyrozinázy v bunkách melanómu.

Aktivita tyrozinázy v bunkách B16F10 sa skúmala na základe množstva dopachrómu produkovaného katalytickou reakciou intracelulárnej tyrozinázy.20 Stručne, bunky melanómu sa kultivovali v šesťjamkovej platni počas 24 hodín, po čom nasledovalo ošetrenie rôznymi koncentráciami extraktu L.thunbergianus alebo jeho rozpúšťadla. frakcie počas ďalších 48 hodín v prítomnosti 100 nM -MSH. Po dvojnásobnom premytí ľadovo studeným D-PBS boli bunky lyzované v 200 ul tlmivého roztoku pre rádioimunoprecipitačný test (RIPA) (Sigma-Aldrich) obsahujúceho inhibítory proteázy a fosfatázy. Po odstredení bunkového lyzátu zozbieraného z každej jamky pri 15,{13}} g počas 15 minút sa 100 μl supernatantu zmiešalo so 100 μl 1 mM L-DOPA v PBS (pH 6,8) a následne sa inkubovalo 30 minút pri 37 stupňoch . Absorbancia dopacrómu sa merala pri 475 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Údaje sa normalizovali s koncentráciou proteínu stanovenou testom s kyselinou bicinchonínovou.

Izolácia a charakterizácia bioaktívnych zlúčenín pomocou HPLC.

HPLC sa uskutočnila na YL{{0}} (Young Lin Instrument, Kórea), vybavenom kolónou TC-C18 (4,6 mm, 250 mm a 5 μm, Agilent, USA), inkonjunkcia s gradientovým systémom zloženým z rozpúšťadla A (0,2 % kyseliny mravčej) a rozpúšťadla B (MeOH). Pomer strmosti rozpúšťadiel bol nastavený na 0-5 min, 15 percent B; 5-10 min, 15-20 percent B; 10-15 min, 20-30 percent B; 15-30 min, 30-40 percent B; 30-37 min, 40-60 percent B; 37-40 min, 60-100 percent B; 40-45 min, 100 percent B; 45-50 minút, 100-15 percent B; a 50-55 min, 15 percent B. Na identifikáciu zložiek vo frakciách rozpúšťadla bola mobilná fáza dodávaná s prietokovou rýchlosťou 1 ml/min a detekcia elúcie bola uskutočnená pri 330 nm. Na zber bioaktívnych zložiek insolventných frakcií bola mobilná fáza dodávaná s prietokovou rýchlosťou 15,0 ml/min a detekcia elúcie bola uskutočňovaná pri 330 nm pomocou prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Kórea ), vybavený prep-C18 kolónou (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA), v spojení s gradientovým systémom zloženým z rozpúšťadla A (0,2 % kyselina mravčia) a rozpúšťadla B (MeOH). Pomer sklonu rozpúšťadiel bol nastavený na 0-10 min, 10 percent B; 10-20 min, 10-15 percent B; 20-40 min, 15 percent B; 40-60 min, 15-20 percent B; a 60-70 minút, 30 percent B.

Molekulárne modelovanie.

Kryštálovou štruktúrou hubovej tyrozinázy na molekulárne modelovanie bola agaricustyrozináza (PDB robí: 2Y9X) získaná z Protein DataBank (PDB). Enzým bol pripravený pomocou pracovného postupu prípravy proteinwizard zabudovaného do Maestroprogramu (Maestro, verzia 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). Voda a všetky ostatné molekuly prítomné v súboroch PDB boli odstránené. Molekulárne dokovanie sa uskutočnilo pomocou protokolu indukovaného dokovania (IFD) (protokol Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking), ako už bolo uvedené.21

Schopnosť chelatácie medi.

Chelatačná schopnosť zlúčenín izolovaných z L. thunbergianus s meďou bola stanovená podľa predchádzajúcej správy.22 Každý derivát kyseliny kofeoylchínovej (10 μl) v uvedenej koncentrácii sa zmiešal s 280 μl 50 mM pufra octanu sodného (pH 6,0), 6 μl 4 mM pyrokatecholového fialového roztoku pripraveného v rovnakom pufri a 10 μl 1 ug/μl CuSO4·5H2O. Vymiznutie modrej farby sa pozorovalo meraním absorbancie pri 632 nm pomocou multimódovej čítačky mikrodoštičiek SpectraMax M5. Ako kontrola sa namiesto vzorky použila voda. Percento chelatačnej aktivity medi sa vypočítalo z absorbancie pri 632 nm, čo je nasledovné

chelatačná schopnosť medi ( percentá )=1− (Vzorka/kontrola)×100 (2)

Štatistická analýza.

Všetky údaje v tejto štúdii boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) z troch nezávislých experimentov. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism 8.{1}} (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Rozdiely medzi priemernými hodnotami kontrolnej skupiny a exponovanej skupiny sa analyzovali pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Dunnettov post hoctest. Prah štatistickej významnosti pre všetky analýzy bol p < 0,05="">

ZÁVERY

V tejto štúdii sme demonštrovali, že extrakty L. thunbergianus zachytávajú ABTS radikály a vykazujú silný inhibičný účinok na biosyntézu melanínu bez významnej cytotoxicity. Abioaktívna zložka, ktorá sa nachádza v L. thunbergianus a inhibuje melanogenézu, bola izolovaná vo frakcii n-BuOH. Okrem toho sme zistili, že tri deriváty kyseliny kafeoylchínovej sú hlavnými zlúčeninami, ktoré existujú vo frakcii n-BuOH, a že kyselina 5-kafeoylchínová je dôležitou zložkou pre potlačenie melanogenézy v bunkách melanómu inhibíciou aktivity bunkovej tyrozinázy. Tu sme izolovali prírodnú zlúčeninu inhibítora 5-kafeoylchínovú kyselinu z extraktu L.thunbergianus, aby sme zabránili hyperpigmentácii a odhalili jej inhibičný mechanizmus, ktorý je základom melanogenézy. Naše zistenia teda naznačujú, že kyselina 5-kafeoylchínová a frakcia n-BuOH izolovaná z L. thunbergianus môžu byť užitočné v kozmetike ako činidlá na bielenie pokožky.

cistanche plátky