Charakteristika inhibičného potenciálu enzýmu CYP3A4 vybraných flavonoidov, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.3. Pseudo-ireverzibilná inhibičná skúška

V teste pseudoireverzibilnej inhibície boli vzorky inkubované s flavonoidmi a ošetrené oxidačným činidlom, potom boli podrobené dialýze. V prípade pseudoireverzibilnej inhibície sa má aktivita enzýmu obnoviť. Pri inkubáciách so všetkými testovanými flavonoidmi došlo k významnej inhibícii aktivity enzýmu po dialýze s a bez ošetrenia oxidantom (obrázok 4). Vo všetkých prípadoch bol rozdiel v zvyškovej enzýmovej aktivite medzi vzorkou flavonoidov a vzorkou hexakyanoželezitanu draselného štatisticky nevýznamný (p<>

Rovnako ako v predchádzajúcich experimentoch, najvyššie zníženie aktivity enzýmu bolo pozorované, keď bol ako inhibítor použitý chryzín. Zvyšková aktivita enzýmu po inkubácii a dialýze s chryzínom bola 0,57 percenta a po inkubácii a dialýze s predchádzajúcim ošetrením hexakyanoželezitanom draselným bola 1,31 percenta (obrázok 4).

Cistanche môže zlepšiť imunitu

V prípade priamej (reverzibilnej) inhibície by tento typ experimentu ukázal obnovenie aktivity enzýmu po dialýze. V prípade pseudoireverzibilnej inhibície by sa aktivita enzýmu obnovila po ošetrení oxidantom a dialýze. Keďže to nebol prípad žiadneho z analyzovaných flavonoidov, možno konštatovať, že všetky flavonoidy vykazujú ireverzibilnú inhibíciu cytochrómu P450 3A4.

3. Diskusia

Ukázalo sa, že niektoré flavonoidy môžu inhibovať aktivitu enzýmov cytochrómu P450. Saric-Mustapic a kol. [28] a Kondza a kol. [29] ukázali, že akacetín, apigenín, chryzín a pinocembrín inhibujú enzým CYP3A4 v teste s testosterónom ako markerovým substrátom. Keďže enzým CYP3A4 má veľké aktívne miesto, ktoré sa môže prispôsobiť rôznym substrátom, odporúča sa vykonať testy aktivity s iným markerovým substrátom, ako je nifedipín a midazolam [30]. Následne sme použili oxidáciu nifedipínu ako markerovú reakciu aktivity CYP3A4 a určili sme kinetické parametre inaktivácie. Hodnoty inhibičnej účinnosti získané s použitím nifedipínu ako markerového substrátu sú rovnakého rádu v porovnaní s testosterónovým testom pre apigenín, acecetín a pinocembrín. Iba chryzín vykazoval štvornásobne vyššiu hodnotu testosterónu [29] v porovnaní s testom nifedipínu, tj 0,108 min-1 uM-1 oproti 0,029 min-IμM-1. Pozorované podobnosti v kinetike inaktivácie sú v súlade s údajmi z literatúry, ktoré potvrdzujú, že nifedipín a testosterón majú rôzne väzbové miesta, ktoré sa prekrývajú [31]. Cytochróm P4503A4 má jedno z najväčších aktívnych miest a môže súčasne ubytovať substrát a inhibítor, pričom jeden ovplyvňuje väzbu druhého, čo by mohlo vysvetliť pozorované rozdiely medzi testami nifedipínu a testosterónu.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Klinickým dôsledkom reverzibilných inhibítorov (tj interakcií medzi potravinami a liekmi) sa možno vyhnúť, ak sa inhibítor vysadí z liečby. Dôležitejšie interakcie sú tie, ktoré sú nezvratné, zatiaľ čo jednoduché prerušenie používania inhibítora nevyrieši problémy interakcie. V tejto štúdii chryzín vykazoval najvyšší inhibičný potenciál s najnižšími hodnotami IC50 a K; hodnoty. Štúdia molekulárneho dokovania flavonoidov viažucich sa na cytochróm P450 3A4 preukázala vyššiu väzbovú afinitu chryzínu vystavením kruhu B železu v aktívnom centre enzýmu [28]. Štúdia vzťahu medzi štruktúrou a inhibíciou to ukázalahydroxylskupiny na kruhu A prispievajú k inhibičnému účinku pravdepodobne v dôsledku interakcií ión-ión, zatiaľ čo kruh B môže byť nesubstituovaný (pinocembrín, chryzín) alebo monosubstituovaný (acacetín, apigenín), aby bol pozorovaný inhibičný účinok (obrázok 1). [28]. Nesubstituované flavonoidy (pinocembrín, chryzín) sú náchylnejšie na epoxidáciu a tvorbu reaktívnych medziproduktov, ktoré inaktivujú CYP3A4. Silnejší inhibičný účinok pozorovaný pri chryzíne je pravdepodobne spôsobený tuhosťou štruktúry a prítomnosťou dvojitej väzby C2=C3 v porovnaní s pinocembrínom.

Dôležitosť tejto opísanej kinetiky enzýmov možno pozorovať v kontexte interakcií jedlo-liečivo, kde podávanie chryzínu （20-100 μM） významne zvýšilo AUC a maximálnu sérovú koncentráciu (Cmax) nitrofurantoínu u potkanov [32] .cistanche deserticola ma,Napríklad erytromycín [33], založený na relatívne slabom mechanizme inhibítora enzýmu CYP3A4/5, spôsobuje u zdravých dobrovoľníkov miernu interakciu s cerivastatínom (21-percentné zvýšenie AUC cerivastatínu) [34]. Chrysin má tiež väčší inhibičný potenciál ako mibefradil, antihypertenzívum, ktoré bolo stiahnuté z dôvodu významných interakcií s inými liekmi. Výsledky tejto štúdie naznačujú, že chryzín môže byť silným inhibítorom a môže interagovať s inými používanými liekmi,cistanche deserticolazmeny AUC a Cmax týchto liekov. Chryzín je bohatý na propolis (28 g/l) a je to tretí hlavný flavonoid v mede 5,3 mg/kg [35]; preto strava bohatá na tieto potraviny má potenciál interagovať s liekmi, ktoré sú substrátmi CYP3A4.

Pinokembrín, preukázaný ireverzibilný inhibítor enzýmu CYP3A4, vykazoval najnižšie k; hodnotu mg 0.04 ± 0,01 min-1. Jeho inaktivačná účinnosť bola podobná ako účinnosť acacetínu a apigenínu (0,01 min-1 μM-1）). Pinocembrín sa väčšinou nachádza v potravinách, ako je med a nápoje (čaj a červené víno), ktoré predstavujú bohatý zdroj tohto flavonoidu [29]. Podľa týchto kinetických parametrov je potrebná opatrnosť pri konzumácii týchto zdrojov pinocembrínu spolu s liekmi, ktoré pôsobia ako substráty CYP3A4.

Acacetín vykazoval trikrát vyššiu hodnotu IC5{2}} ako chryzín a päťkrát vyššiu hodnotu K; pri zachovaní podobných hodnôt vplyvu ako ostatné flavonoidy, čo naznačuje nižšiu inhibičnú účinnosť. Acacetín možno nájsť hlavne v rastlinných druhoch ako Turnera diffusa, Robinia pseudoacacia a Betula pendula [36], ale zdrojom tohto flavonoidu sú aj niektoré potraviny. Napríklad šťava z kumquatu je bohatým zdrojom acacetínu a acetín možno nájsť v koncentráciách 0,1 mg/100 g čerstvej šťavy [37]. Materská zlúčenina acacetínu, apigenín, vykazovala najvyššiu hodnotu IC50 a najvyššiu K; hodnotu medzi štyrmi testovanými flavonoidmi. Inhibičný potenciál apigenínu bol potvrdený in vivo, keď kombinovaná liečba apigenínom a paklitaxelom viedla k zvýšeniu perorálnej biologickej dostupnosti paklitaxelu, čo sa pripisovalo najmä zvýšenej absorpcii v gastrointestinálnom trakte prostredníctvom inhibície P-glykoproteínu a zníženiu prvého prechodu metabolizmus paklitaxelu prostredníctvom inhibície podrodiny CYP3A v tenkom čreve a/alebo v pečeni apigenínom [38]. Apigenín je dominantný flavonoid v zeleri, petržlene a harmančeku. Uvádza sa, že sušená petržlenová vňať má maximálne množstvo apigenínu, 45 035 ug/g. Ďalšie zdroje apigenínu sa nachádzajú v bylinkách, ako je sušený kvet harmančeka, ktorý obsahuje 3000 až 5000 ug/g, a zelerové semená, ktoré obsahujú 786,5 ug/g [39].

Reverzibilná inhibícia cytochrómov P450 3A4 súvisí s prvým krokom katalytického cyklu cytochrómu P450 (obrázok 5). Najčastejšie sa pozoruje kompetícia medzi substrátom a inhibítorom vo väzbe na aktívne miesto (železité železo). V takom prípade sa odporúča vykonať väzbové experimenty (titrácie enzýmov) a otestovať ich s viac ako jedným substrátom, pretože CYP3A4 má veľké aktívne miesto, ktoré môže pojať viac ako jednu molekulu substrátu/inhibítora [26,30. V tejto štúdii sme použili nifedipín ako substrát a výsledky účinnosti inhibície boli porovnateľnej veľkosti s predtým publikovanými testami uskutočnenými s testosterónom ako markerovým substrátom (tabuľka 1).

Obrázok 5. Katalytický cyklus cytochrómu P450 pozostáva z deviatich krokov. Prvý krok predstavuje väzbu substrátu a bod interakcie s reverzibilnými inhibítormi. V druhom kroku sa hemové železo redukuje na železnatú formu, na ktorú sa viažu pseudoireverzibilné inhibítory.cistanche účinkyAk sa pozoruje ireverzibilná inhibícia, zvyčajne súvisí s radikálovou formou substrátu (vytvoreného v kroku 7) a/alebo produktu (vytvoreného v kroku 8). Reaktívne formy kyslíka vytvorené v márnom cykle cytochrómu P450 (kroky 3a a 5a) môžu spôsobiť deštrukciu enzýmu, čomu možno zabrániť pridaním SOD a CAT. Opis krokov, ktoré nesúvisia s inhibíciou, je vynechaný. Pripravené podľa odkazu [26].

Avšak, ako sme už predtým ukázali [28,29] a potvrdili tu v našich uskutočnených experimentoch, všetky študované flavonoidy vykazujú ireverzibilnú inhibíciu. Bez ohľadu na typ ireverzibilnej inhibície (pseudoireverzibilná alebo kovalentná väzba medziproduktu na hem alebo apoproteín), inhibícia bude najvýraznejšia, ak sa uskutoční predinkubácia pred pridaním markerového substrátu [26]. Pri predinkubácii sa katalytický cyklus aktivuje pridaním generujúceho systému na produkciu koenzýmu (NADPH) a poskytne sa dostatočný čas na pozorovanie inaktivácie enzýmu. Všetky ireverzibilné typy inhibície teda vyžadujú redukciu enzýmu na železnatú formu (obrázok 5).

Keďže cytochrómy P450 sú hemoproteíny, študovali sme väzbu flavonoidov na železnatú formu aktívneho miesta a väzbu možného reaktívneho medziproduktu na hém [26]. Na posúdenie možnej tvorby aduktu hemu sa uskutočnil hemochromopyridínový test. Všetky odskúšanéflavonoidyvýznamne znížila koncentráciu hemu v oboch testoch, o viac ako 50 percent. Chrysin bol opäť najsilnejším inhibítorom, ktorý zodpovedal kinetickým hodnotám inhibície pozorovaným v tejto štúdii. Koncentrácia hemu pri pinocembríne bola päťkrát vyššia a pri apigeníne takmer desaťkrát vyššia ako pri chryzíne (25,3±0,4 a 45,1±1,7 percenta). Toto zníženie koncentrácií hemu naznačuje, že ireverzibilnú inhibíciu CYP3A4 študovanými flavonoidmi možno pripísať kovalentnej väzbe reaktívneho medziproduktu na hem. Je potrebné poznamenať, že hemy môžu byť zničené reaktívnymi formami kyslíka, čím sa znížia výsledky testu hemochromopyridínu. Aby sa vylúčila táto možnosť, inkubácie sa uskutočňovali v prítomnosti SOD a CAT (tabuľka 2), čo potvrdilo vyššie uvedený záver.

Prvým krokom v katalytickom cykle enzýmu cytochrómu P450 je väzba substrátu na železitý ión. Ak inhibítor vykazuje kompetitívnu inhibíciu voči substrátu, aktivitu enzýmu možno získať dialýzou, pretože eliminácia inhibítora umožňuje úplné obnovenie aktivity enzýmu [26]. Ak sa však inhibítor viaže na dvojmocné železo, je potrebné použiť pred dialýzou oxidant, ako je PCF, aby sa obnovila aktivita enzýmu. Ak sa aktivita enzýmu obnoví, inhibícia je charakterizovaná ako pseudoireverzibilná [26]. Keďže aktivitu enzýmu nebolo možné obnoviť po dialýze s PCF alebo bez nej, žiadny z testovaných flavonoidov (v koncentrácii 25 uM) nepôsobí ako reverzibilné alebo pseudoireverzibilné inhibítory enzýmu CYP3A4. To tiež potvrdzuje, že pravdepodobnou príčinou inaktivácie enzýmu je ireverzibilná inhibícia kovalentnou väzbou buď na hem alebo apoproteín.

Je potrebné poznamenať, že chryzín spôsobil takmer úplnú redukciu hemu počas inkubácie: 97,1 percenta bez a 94,5 percenta s SOD a CAT (tabuľka 2); zatiaľ čo výsledky reziduálnej enzýmovej aktivity za podobných podmienok ukázali zníženie enzýmovej aktivity približne o 99 percent (obrázok 4). Hemochromopyridínový test registruje hemy zo všetkých zdrojov v inkubácii, tj cytochróm P450, ako aj cytochróm b;. Výsledky pre chryzín naznačujú, že reaktívny medziprodukt generovaný cytochrómom P450 reagoval s hémom z cytochrómu P450, ako aj cytochrómu b5.

Uskutočnila sa ďalšia LC-MS analýza, aby sa určili možné reaktívne flavonoidové medziprodukty buď vo forme aduktu hemu, alebo zachytené s použitím glutatiónu ako lapača radikálov (údaje nie sú uvedené). Nepodarilo sa nám však izolovať žiadny z predpovedaných aduktov pravdepodobne kvôli nestabilite reaktívneho flavonoidového medziproduktu a/alebo aduktu hemu/glutatiónu. Podobné správanie sa pozorovalo u mibefradilu, antihypertenzíva, stiahnutého z trhu v dôsledku interakcií liek/liečivo. Hoci mibefradil spôsobil redukciu hemu, reaktívny medziprodukt nebol vytvorený [40].

4. Materiály a metódy

4.1.Materiály

V tejto štúdii boli použité štyri flavonoidy (acacetín, apigenín, chryzín a pinocembrín) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Rekombinantné cytochrómy P450 3A4 koexprimované s nikotínamid-adenín-dinukleotid fosfát (NADPH) reduktázou a cytochróm bs v autozómoch boli zakúpené od Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

Na základe testu oxidu uhoľnatého cytochrómu P450 [41] bol výrobcom deklarovaný obsah enzýmu CYP3A4 1 μuM. Glukóza-6-fosfát (G6P), glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (G6PDH) a disodná soľ -nikotínamid-dinukleotidfosfátu (NADP plus) boli zakúpené od Sigma-Aldrich. Fosforečnan draselný (pa) a dichlórmetán (pa) boli zakúpené od spoločnosti Kemika dd (Záhreb, Chorvátsko), kyselina mravčia (85 percent, pa) od spoločnosti Semikem doo (Sarajevo, Bosna a Hercegovina) a metanol použitý na rozpúšťanie činidla a chromatografiu od spoločnosti Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). V inkubačných zmesiach a chromatografii sa použila ultračistá voda. Na prípravu pufra fosforečnanu draselného pH 7,85 sa použil dihydrogenfosforečnan draselný (Kemika dd); pH sa upravilo pomocou hydroxidu sodného zakúpeného od Semikem doo Nifedipín (Sigma-Aldrich) a oxidovaný nifedipín (Európske riaditeľstvo pre kvalitu liekov, liekopis, 10. vydanie, Štrasburg, Francúzsko) sa použili pri štúdiu zvyškovej enzýmovej aktivity, ako aj v kinetika inaktivácie. Testosterón (Sigma-Aldrich) a 6 -hydroxytestosterón (Cayman Europe, Tallinn, Estónsko) sa použili na testy pseudoireverzibilnej inhibície. Troleandomycín a diltiazem boli získané z Agentúry pre liečivá a zdravotnícke pomôcky (Záhreb, Chorvátsko). Pyridín (pa) (Semikem doo), hovädzí hemín (Sigma-Aldrich) a dimetylsulfoxid (Semikem doo) boli použité v hemochromopyridínovom teste. Hexakyanoželezitan draselný (Siegfried AG, Zofingen, Švajčiarsko) sa použil pri štúdiu reverzibilnej a pseudoreverzibilnej inhibície. Superoxiddismutáza (SOD) (Sigma-Aldrich), kataláza (CAT) (Sigma-Aldrich) a kyselina chlorovodíková (36 percent, pa) (Semikem doo) boli použité v teste väzbovej špecifickosti. Inkubácie enzýmov sa uskutočňovali vo vodnom kúpeli (Inkolab, Záhreb, Chorvátsko). Stanovenie aktivity zvyškového enzýmu a kinetiky inaktivácie flavonoidov sa uskutočnilo pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s UV-Vis detekciou (HPLC UV-Vis, Agi-lent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Výpočty zvyškovej aktivity a parametre kinetiky inhibície sa uskutočnili pomocou programu R (The R Project for Statistical Computing, Viedeň, Rakúsko) a Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

4.2. Metódy

4.2.1. Stanovenie kinetiky enzýmu a reziduálnej aktivity

Enzýmové inkubácie sa uskutočňovali trojmo, s mechanickým miešaním vo vodnom kúpeli pri 37 stupňoch. Alikvóty flavonoidov s konečnou koncentráciou 1 μM boli rozpustené v metanole, prenesené do sklenených skúmaviek a odparené do sucha, s výnimkou kontrolných vzoriek bez inhibítora (flavonoidu). Po odparení rozpúšťadla sa pripravila inkubačná zmes na objem 100 μl, pozostávajúca z 5 pmol enzýmu CYP3A4, 50 mM tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (pH 7,4). a ultračistú vodu. Systém generujúci NADPH zložený z 0,1 M G6P:10 mg/ml NADP plus :1000 IU/ml G6PDH=50:25:1(v/v/v) bol pripravený bezprostredne pred použitím. Tento generujúci systém obsahuje glukózo-6-fosfátdehydrogenázu, ktorá regeneruje NADP na NADPH, pričom počas inkubácie udržuje konštantnú koncentráciu koenzýmu cytochrómu P450 (NADPH). Pridanie generujúceho systému (15 percent objemu v konečnej inkubácii, obj./obj.) spustilo reakciu. Nifedipín sa použil na testovanie zvyškovej enzýmovej aktivity pri konečnej koncentrácii 200 uM. Reakcia bola zastavená použitím 1 ml ľadovo studeného 1% roztoku kyseliny mravčej v dichlórmetáne. Vzorky sa zmiešali a potom sa 10 minút odstreďovali pri 1900 g (Rotofix32, Westfalia, Nemecko). Po odstredení sa vytvorili dve vrstvy (vodná a organická vrstva). 850 μl organickej vrstvy sa prenieslo do kyviet a odparilo sa. Analyt sa potom rozpustil v 30 μl metanolu. Kolóna Agilent Zorbax SB C18 （4,6 × 250 mm, 3 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）na analýzu vzoriek pomocou HPLC. Mobilná fáza bola zložená z metanolu a vody v pomere 64:36. Analýza bola izokratická. Prietok bol nastavený na 1,0 ml min-. Objem nástreku bol nastavený na 10 μl. Ako markerový substrát bol použitý nifedipín. Pozorovanou reakciou bola oxidácia nifedipínu. Chromatogramy boli zaznamenávané pri 254 nm. Trvanie analýzy bolo nastavené na 25 minút. čas nifedipínu je 7,1 min a čas oxidovaného nifedipínu je 10,8 min [42]. V oboch prípadoch bolo množstvo získaného produktu pozorované ako veľkosť plochy pod krivkou (AUC) vzhľadom na kontrolnú vzorku. Pre všetky flavonoidy , polovičná maximálna inhibičná koncentrácia (ICs0), konštanta of bola stanovená inhibícia (K;), konštanta rýchlosti inaktivácie (Kinect) a účinnosť inaktivácie (impact /K;). Troleandomycín sa použil ako pozitívna kontrola--ireverzibilný inhibítor cytochrómu P450 3A4,25 uM koncentrácia troleandomycínu znížila aktivitu enzýmu na 35±5 percent.

4.2.2. Hemochromopyridínový test

Hemochromopyridínový test sa použil na posúdenie možnej deštrukcie hemu reaktívnou intermediárnou formou v cykle cytochrómu P450 a uskutočnil sa podľa metódy, ktorú opísali Flink a Watson [43] a Paul et al.[44] niektoré úpravy. Kalibračná krivka bola zostavená s použitím hemínu rozpusteného v dimetylsulfoxide (0,6 až 0,1 μM）. Spektrá boli zaznamenané pri vlnovej dĺžke 50}0 až 600 nm. Inkubačné zmesi s Pripravilo sa 25 uM inhibítorov (flavonoidov) na objem 200 μl. Reakcia sa začala pridaním systému generujúceho NADPH (zloženie pozri v časti 4.2.1) a inkubácie trvali 30 minút. Reakcia sa zastavila po pol hodiny pridaním pyridínu (konečná koncentrácia 0,83 M) a hydroxidu sodného (konečná koncentrácia 0,06 M). Vzorky boli zaznamenané na spektrofotometri (UV-1280, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonsko) do 1 minúty od pridanie alkalického roztoku, kvôli nestabilite pyridínového hemochromogénu v zásaditých podmienkach [44] Koncentrácia hemu vo vzorkách bola vypočítaná na základe pripravenej kalibračnej krivky. Tento test bol vykonaný v troch vyhotoveniach. Inkubácie boli opakované s použitím katalázy a superoxidu dismutáza (5 IU každá) v inkubačná zmes, aby sa zabránilo tvorbe peroxidu vodíka cez zbytočný katalytický cyklus.

4.2.3. Pseudo-ireverzibilná inhibičná skúška

Cieľom tejto eseje je otestovať tvorbu kovalentných komplexov so železnatým železom (Fe-) hodnotením obnovenia aktivity enzýmu po dialýze s alebo bez pridania oxidantu. Pre každý flavonoid boli uskutočnené tri typy experimentov: inkubačná zmes bez flavonoidov (kontrola), inkubačná zmes s flavonoidom a inkubačná zmes s flavonoidom, do ktorej sa po inkubácii pridal oxidant. Každá inkubácia s inhibítorom sa uskutočňovala 30 minút s použitím rovnakých experimentálnych nastavení, ako je opísané vyššie (časť 4.2.1). Po inkubácii sa vzorky preniesli do dialyzačných kaziet. Aa oxidant – 20 mM roztok hexakyanoželezitanu draselného sa pridal do jednej z inkubácií pred dialýzou [45]. Kazety (Slide-A-Lvzer Dialysis Cassettes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) boli ponorené do 50 mM tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (pH 7,4) na 30 minút (dialyzačný roztok bol trikrát vymenený). Po dialýze boli vzorky prenesené z kazety späť do sklenenej skúmavky a zvyšková enzýmová aktivita bola hodnotená s použitím testosterónu ako markerového substrátu (200 uM konečná koncentrácia). Pretože systém generujúci NADPH bol tiež dialyzovaný, bol opäť pridaný k inkubáciám, aby sa iniciovali enzýmové reakcie. Vzorky sa inkubovali 30 minút s rovnakými nastaveniami (popísané v časti 4.2.1). Reakcia sa ukončila pridaním ľadovo studeného roztoku kyseliny mravčej v dichlórmetáne. Vzorky sa analyzovali pomocou HPLC. Diltiazem, známy pseudoireverzibilný inhibítor cytochrómu P450 3A4, sa použil ako pozitívna kontrola na vyhodnotenie oxidácie na železitú formu (pozorovalo sa úplné obnovenie aktivity enzýmu).

4.2.4.Spracovanie výsledkov

Na posúdenie štatistickej významnosti rozdielov medzi vzorkami a kontrolami na základe meraní reziduálnej aktivity by sa použil jednostranný t-test. Na výpočet hodnoty IC50 sa použila nelineárna rovnica. Na stanovenie inaktivačnej konštanty a rýchlosti inaktivácie inhibítora sa použila rovnica Michaelis-Menten. Štatistické spracovanie a prípravy grafov sa uskutočnili pomocou programu R (Projekt R pre štatistické výpočty, Viedeň, Rakúsko) a Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

5. Závery

Acacetín, apigenín, chryzín a pinocembrín inhibujú aktivitu enzýmu CYP3A4 in vitro. Chrysin je najsilnejší inhibítor enzýmu s najnižšou hodnotou IC50, K; Hodnoty Kinect a najvyššia inaktivačná účinnosť. Všetky flavonoidy znížili koncentráciu hemu enzýmu, čo potvrdilo, že ide o ireverzibilnú inhibíciu reaktívnym medziproduktom, ktorej nemožno zabrániť pridaním SOD a CAT. Žiadny z testovaných flavonoidov nepôsobí ako reverzibilné alebo pseudoireverzibilné inhibítory enzýmu CYP3A4 v koncentrácii 25 μM, pretože aktivitu enzýmu nebolo možné obnoviť dialýzou s pridaním hexakyanoželezitanu draselného a bez neho. Keďže tieto flavonoidy sa môžu hojne nachádzať v rôznych potravinách, ako je ovocie, zelenina, korenie, čaje a červené víno, existuje možnosť, že môžu interferovať s rôznymi xenobiotikami, ktoré sú substrátmi CYP3A4. Na úplné preskúmanie možností takýchto interakcií medzi potravinami a liečivami, ako aj možného príspevku iných enzýmov a transportérov k interakciám, sú potrebné ďalšie štúdie in vivo.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 3018