Charakterizácia predtransplantačného a posttransplantačného rizika odmietnutia obličky pomocou sekvenovania imunitného repertoáru B buniek

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Štúdium imunitného repertoáru v kontexte transplantácie orgánov poskytuje dôležité informácie o tom, ako môže adaptívna imunita prispieť a modulovať odmietnutie štepu. Tu charakterizujeme imunitný repertoár periférnej krvi jedincov pred a poobličkytransplantácii pomocou sekvenovania B bunkových receptorov v longitudinálnej klinickej štúdii. Jedinci, u ktorých sa po transplantácii vyvinula rejekcia, majú pred transplantáciou rôznorodejší imunitný repertoár, čo naznačuje predispozíciu na riziko odmietnutia po transplantácii. Okrem toho počas 2 rokov sledovania pacienti, u ktorých došlo k odmietnutiu, demonštrujú špecifický súbor expandovaných klonov, ktoré pretrvávajú po odmietnutí. Aj keď došlo k celkovému zníženiu diverzity periférnych B buniek, pravdepodobne v dôsledku zvýšenej všeobecnej imunosupresívnej expozície v tejto kohorte, detekcia použitia špecifického génu IGHV u všetkých odmietajúcich pacientov podporuje, že spoločný súbor imunogénnych antigénov môže viesť k odmietnutiu po transplantácii. Naše zistenia môžu mať klinické dôsledky na predikciu a klinické riadenie odmietnutia transplantátu obličky.

Obličkytransplantácia je preferovanou liečbou konečného štádia renálneho ochorenia (ESRD) a chronickýchobličkychoroba. Aj keď došlo k významným zlepšeniam v technológiách a porovnávaní tkanív na základe testovania histokompatibility pre ľudské leukocytové antigény darcu/príjemcu (HLA)1, predpovedanie výsledku štepu je stále nevyriešeným problémom. Nameraný nesúlad tkaniva na iných menších, non-HLA lokusoch23 môže tiež viesť k aloimunitnému poškodeniu s akútnym a chronickým odmietnutím, čo vedie k zlým dlhodobým výsledkom štepu4. Navyše okolo 50 percentobličkyaloštepy bez väčších nezhôd HLA sa stále strácajú do 10 rokov od transplantácie². Predtým sme predpokladali, že non-HLA lokusy môžu ovplyvniť imunitnú odpoveď príjemcu proti jehoobličkydonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 rôznych protilátok0, čo im umožňuje rozpoznať veľké množstvo cudzích antigénov. Ľudské BCR alebo Ig pozostávajú z dvoch identických ťažkých reťazcov (I) tvorených piatimi izotypmi: IgM, IgD, IgA, IgE a IgG a dvoma ľahkými reťazcami. Intaktná protilátka obsahuje variabilnú a konštantnú doménu. Väzba antigénu sa vyskytuje vo variabilnej doméne, ktorá je generovaná rekombináciou súboru variabilných (V), diverzných (D) a spájajúcich (J) génových segmentov tvoriacich imunitný repertoár B-buniek a jej diverzita sa koncentruje hlavne v komplementárnu určujúcu oblasť 3 (CDR3). Počas procesu dozrievania afinity dochádza vo variabilnej oblasti k somatickej hypermutácii (SHM). Silná adaptívna imunitná odpoveď závisí od expanzie klonov B-buniek a procesu nazývaného afinitná maturácia, počas ktorej sa do preskupení Ig génu zavedú somatické mutácie a vyberú sa B bunky s vyššou afinitou pre daný antigén.

Štúdium imunitného repertoáru pri transplantácii orgánov je kľúčové na pochopenie toho, čo spúšťa a udržiava proces odmietnutia a ako môže nakoniec urýchliť cestu k zlyhaniu štepu. S pokrokom v sekvenovaní novej generácie a robustnými výpočtovými prístupmi môžeme študovať oblasť VDJ do jemných detailov,12. K dnešnému dňu analýza imunitného repertoáru T-buniek vobličkytransplantácia bola vykonaná u veľmi obmedzeného počtu pacientov3-15, a hoci sa BCRSeq aplikoval aj na iné ochorenia a ľudské imunitné odpovede, ako je skleróza multiplex6, očkovanie proti chrípke7 alebo poruchy imunitnej nedostatočnosti8, chýbajú štúdie o transplantácii odmietnutie. Vobličkytransplantácia, BCRSeq bola vykonaná len v kontexte tolerancie, HLA senzibilizovanáobličkykandidáti na transplantáciu podstupujúci desenzibilizačnú terapiu20 a infiltráciu B-buniek porovnávajúcu klonálnu expanziu v krvi a štepe2l. Ďalšia aplikácia na BCRSeq pri transplantácii bola predtým publikovaná v malej kohorte 12 príjemcov transplantátu srdca.

Uvedomujúc si dôležitosť humorálneho ramena imunitnej odpovede pri neskorom odmietnutí transplantátu a chronickom zlyhaní aloštepu, charakterizujeme imunitný repertoár periférnej krvi pomocou BCRSeq v prospektívnej dlhodobej štúdii. Zistili sme, že diverzita imunitného repertoáru pred transplantáciou je vyššia u tých jedincov, ktorí odmietajúobličkyukazuje tiež expanziu určitých klonov a génov IGHV počas 24 mesiacov sledovania. Tieto výsledky môžu pomôcť predpovedať riziko odmietnutia pred prihojením a môžu mať klinické dôsledky pri detekcii konkrétnych antigénov, ktoré spôsobujú odmietnutie.

Cistanche je dobrý pre funkciu obličiek

Výsledky

Študijné predmety. Uskutočnili sme BCRSeq v 83 vzorkách periférnej krvi od 27 jedinečných pacientov a vykonali sme analytický postup znázornený na obr. V tejto štúdii boli brané do úvahy tri klinické fenotypové skupiny definované zaslepenými hodnotami centrálnej patológie zo sériových biopsií aloštepu hodnotených podľa Banffových kritérií23,24 a skóre indexu chronického poškodenia aloštepu (CADI): Non-progressors (NP; n{6}}) mali nízke neinkrementálne skóre CADI bez akútneho odmietnutia, progresori bez odmietnutia (PNR;n=10) ​​mali inkrementálne skóre CADI počas 2 rokov bez odmietnutia a progresori s odmietnutím (PR; n=7) mali prírastkové vysoké skóre CADI počas 2 rokov s epizódami odmietnutia. Demografia, príčinyobličkyzlyhanie a použitie imunosupresie je uvedené v tabuľke 1. Je dôležité zdôrazniť niektoré charakteristiky týchto pacientov. Rodičovská štúdia, z ktorej boli títo pacienti zaradení, mala celkovo nízku mieru (17 percent) akútneho odmietnutia potvrdeného biopsiou (priemerný{min, max}=12 {6,24}mesačný čas odmietnutia). Všetci títo pacienti mali nízke imunologické riziko odmietnutia (stav senzibilizácie reaktívnymi protilátkami na vrcholovom paneli<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Sekvenovanie imunitného repertoáru B-buniek. BCRSeq sa urobil na vzorkách genómovej DNA (gDNA) extrahovaných z krvných zrazenín na 81 vzorkách z 27obličkypríjemcovia transplantátu v troch časových intervaloch (0,6,24 mesiacov). Sekvenovaním sa získal celkový počet 327 703 čítaní (priemer 4045/vzorka) po kontrole kvality (pozri časť o metódach). Na overenie výsledkov a ďalšie vyhodnotenie každého izotypu sme dodatočne extrahovali RNA zo zodpovedajúcich PBMC, ktoré boli k dispozícii pre 55 vzoriek, odobrali sa v rovnakom čase ako krvná zrazenina a vykonali sme komplementárne sekvenovanie DNA (cDNA) vo väčšej hĺbke, čím sme získali 1 773 330 čítaní. pre IgD (priemer 31 667/vzorka), 1 708 227 čítaní pre IgM (priemer 30 504/vzorka), 973 444 čítaní pre IgA (priemer 17 383/vzorka), 139 7345 čítaní pre IgG, 953{27 a priemer 24 }} uvádza IgE (priemer 5178/vzorku) (doplnkový obrázok 1). Knižnice pre každý izotyp sa amplifikovali oddelene a potom sa spojili na sekvenovanie; preto porovnávacia krížová izotypová analýza nie je uskutočniteľná.

Ako je znázornené na obr. 1b, definovali sme klon ako skupinu buniek pochádzajúcich zo spoločnej molekuly predkov, ktorá má rovnaký segment IGHV a IGHJ, rovnakú dĺžku CDR3 a 90 percentnú nukleotidovú identitu medzi CDR3, ako bolo predtým definované v štúdiách adaptívneho B -bunkové odpovede'8. Táto definícia umožňuje študovať diverzitu, zdieľané alebo spoločné čapíky a klonálnu expanziu v kontexte aloimunity vobličkytransplantácie. Počet jedinečných kužeľov na jednotlivca v každom časovom bode je zobrazený ako barplot v doplnkovom materiáli (doplnkový obrázok 1). Kvôli prísnosti analýzy údajov sme vzorky zlacnili<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">obličkytransplantácia, charakterizovaná proliferáciou Epsteina Barra

Obr. 1 Celkový sled štúdie.a Schematické znázornenie štruktúry protilátok a proces VDJ rekombinácie zodpovedný za diverzitu produkovanú v imunitnom repertoári.b B-bunkový klon definovaný ako bunky od spoločného predka a c analytický reťazec štúdie: B-bunka sekvenovanie pre gDNA a cDNA, analýza diverzity s ohľadom na počet klonov (bohatosť) a frekvenciu každého klonu (Shannonova entropia), sieťová analýza a klonálna a IGHV génová analýza

B bunky infikované vírusom (EBV). U tohto pacienta sme pozorovali zvýšený počet klonov v čase 6, predtým s nižšou klonálnou diverzitouobličkytransplantácii a 24 mesiacov po transplantácii obličky. Pretože knižnice boli amplifikované z invariantného množstva templátu, vyššia frakcia B buniek v krvi mohla viesť k väčšiemu počtu klonotypov zastúpených v sekvenovaných produktoch. Kvôli odlišnému a jedinečnému patologickému procesu u tohto pacienta bola táto vzorka vylúčená z budúcej analýzy.

Predtransplantačná diverzita B-buniek je spojená s odmietnutím. Ako je znázornené na obr. 1c, skúmali sme diverzitu imunitného repertoáru B-buniek s ohľadom na druhovú bohatosť (počet jedinečných klonov) a Shannonovu entropiu (rovnica (1) z metód) naprieč časovými bodmi a klinickými výsledkami pomocou lineárneho regresného modelu s ohľadom na počet klonov alebo entropie ako závislej premennej a klinického výsledku alebo SHM ako nezávislej faktorovej premennej. Repertoár predtýmobličkyTransplantácia v PR bola podstatne rôznorodejšia ako v NP (bohatosť: P-hodnota=0,005, entropia: P-hodnota=0,01) s rovnakým trendom pretrvávajúcim 6 mesiacov poobličkytransplantácia (bohatosť: P-hodnota=0.{25}}2, entropia: P-hodnota=0,02) a bez rozlíšiteľných rozdielov medzi skupinami 2 roky po transplantácii (obr. 2a a doplnkový obrázok 2). Údaje o sekvenovaní cDNA po transplantácii ukázali rovnaký trend vo väčšej rozmanitosti repertoáru 6 mesiacov po transplantácii, predovšetkým pre izotypy IgD (bohatosť: P-hodnota=0.02, entropia: P-hodnota=0. 03) (obr. 2b a doplnkový obr. 2). Nezistil sa žiadny mätúci účinok na údaje z rôznych demografických a klinických premenných, ako je vek príjemcu, pohlavie, rasa, zdroj darcu, typ imunosupresie, nesúlad HLA a príčina zlyhania obličiek. Keďže reakcia B-buniek u 1-ročného (minimálny vek v údajoch) a 19-rokov (maximálny vek v údajoch) sa môže veľmi líšiť, vykonali sme citlivosť analýza vylúčila týchto dvoch pacientov a výsledky zostali významné (NP vs. PR v čase 0: bohatosť: P-hodnota=0 0,01, entropia: P-hodnota=00,03). V ďalšom meradle diverzity imunitného repertoáru sme vyhodnotili SHM, definovaný ako frekvencia mutácií v každom segmente V génu, a našli sme trend pre vyšší počet SHM pre PR pred transplantáciou a trend pre vyšší SHM v izotype IgD. v PR 6 mesiacov po transplantácii (P-hodnota=0.06).

Diverzita B-buniek sa v priebehu času mení podľa klinického výsledku. Aby sme zistili, či sa diverzita imunitného repertoáru mení v priebehu času podľa klinického výsledku, modelovali sme longitudinálne údaje pomocou modelov lineárnych zmiešaných účinkov s ohľadom na interakciu medzi klinickým výsledkom a časom. Zistili sme, že NP a PR sa správali odlišne v priebehu času po transplantácii, čo ukazuje zvýšenie diverzity v NP a zníženie diverzity v PR, zatiaľ čo v prípade PNR zostala diverzita v priebehu času nemenná. Toto bolo pozorované pre gDNA (bohatosť: P-hodnota=0.007, entropia: P-hodnota=0.001, obr. 3a) a všetky izotypy pre cDNA, pričom najvýraznejšie rozdiely v entropii boli pre izotypy IgM a IgD (IgA: P-hodnota=0,07, IgD: P-hodnota=0,02, IgG: P-hodnota=0,05, IgM: P-hodnota=0.04, Obr. 3b). Grafy pre bohatosť so zodpovedajúcimi hodnotami P sú znázornené na doplnkovom obrázku 3. Ako je pozorované na grafoch, jeden jedinec má ďalšiu vzorku v čase 32 mesiacov, čo by mohlo skresliť výsledky, preto sa vykonala analýza citlivosti s vylúčením tejto vzorky z analýza a pozorovanie podobných výsledkov s výnimkou izotypov IgG a IgM, kde sa význam stráca (entropia gDNA: P-hodnota=0.004. cDNA-entropia: IgA: P-hodnota=0.1 , IgD: P-hodnota=0,05, IgG: P-hodnota=0,08, IgM: P-hodnota=0,1).

Opatrenia týkajúce sa diverzity môžu byť ovplyvnené biologickým a technickým odberom vzoriek. Diverzita vzorky sa môže výrazne líšiť od celkovej diverzity v repertoári, pretože je zastúpený len zlomok miliárd buniek, čo je známe ako problém chýbajúcich druhov. Technické vzorkovanie môže existovať, pretože každá vzorka sa môže líšiť v hĺbke sekvenovania a v určitom stupni experimentálnych chýb. Na riešenie problému chýbajúcich druhov sme použili nástroj Recon (rekonštrukcia odhadovaných klonov z pozorovaných počtov)29, ktorý odhaduje celkovú distribúciu veľkosti klonov. Recon prináša presné a robustné odhady súboru opatrení diverzity, vrátane bohatosti a entropie, čo umožňuje robustné porovnávanie diverzity medzi jednotlivcami. Aby sme sa vyrovnali s hĺbkou sekvenovania a určitým stupňom experimentálnych chýb, vykonali sme stratégiu downsamplingu; veľmi dobre používaná stratégia v analýze imunitného repertoáru11,17,30. V analýze Recon (doplnkový obrázok S4: A – E) sa pre údaje gDNA replikovala bohatosť aj rozmanitosť. V údajoch cDNA izotyp IgD v čase 6 ukazuje trend, ale nedosiahol významnosť, hoci dlhodobé výsledky pre izotypy IgA, IgD a IgG boli replikované. V analýze odberu vzoriek (doplnkový obrázok S4: F–J) sa všetko replikuje, ale čas je 0 pre údaje gDNA. Môže to byť dôsledok obmedzenia prevzorkovania

Obr. 2 Husľové grafy ukazujúce počet klonov (bohatosť) v troch klinických výsledkoch. určitý počet klonov v časoch 0, 6 a 24 zo vzoriek gDNA. b Počet klonov v čase 6 pre izotyp IgD zo vzoriek cDNA. P-hodnoty sa získajú z úpravy lineárneho regresného modelu s ohľadom na počet klonov ako závislú premennú a klinický výsledok ako nezávislú faktorovú premennú (n=27 vzoriek). Husľové grafy predstavujú hustotu pravdepodobnosti údajov pri každej hodnote. Bodová značka predstavuje strednú hodnotu s medzikvartilovým rozsahom. Zdrojové údaje sa poskytujú ako súbor zdrojových údajov

Obr. 3 Pozdĺžne údaje vynesené s preloženou čiarou pre každý klinický výsledok. a Diverzita meraná Shannonovou entropiou reprezentovaná v rôznych časových bodoch tromi klinickými výsledkami (NP, PNR, PR) v gDNA. b Diverzita meraná Shannonovou entropiou reprezentovaná v jednotlivých časových bodoch tromi klinickými výsledkami (NP, PNR, PR) podľa izotypov v cDNA. P-hodnoty zodpovedajú interakčnému termínu definovanému časom × klinickým výsledkom upravujúcim lineárny model zmiešaného účinku (n=27 vzoriek). Každá bodka predstavuje entropiu na vzorku v čase s jej preloženou čiarou a intervalom spoľahlivosti. Zdrojové údaje sa poskytujú ako súbor zdrojových údajov

stratégie implikované, najmä na dátach gDNA, kde je počet sekvencií oveľa nižší ako pri dátach cDNA. V gDNA sme analýzu obmedzili na jedincov s aspoň 1000 klonmi, aby sme zachovali dostatok sekvencií. Odber vzoriek bol vykonaný na minimálne 1062 klonoch v porovnaní so 62 173 klonmi v cDNA. Napriek tomuto obmedzeniu sme pozorovali trend pre čas 0, zachovali sme význam pre longitudinálnu analýzu v gDNA a replikovali sme všetky asociácie v cDNA. V oboch analýzach (recon a downsampling) sme replikovali výsledky napriek niektorým obmedzeniam, ktoré sú tu zdôraznené, čo ukazuje platnosť predtým oznámených výsledkov.

Siete B-buniek vykazujú rozdiely v klonálnej expanzii. Repertoár B-buniek môže byť prirodzene reprezentovaný ako sieť založená na sekvenčnej diverzite31. V našich údajoch sme vyvinuli vizuálnu sieť pre každú vzorku (obr. 4 a doplnkové obrázky 5–7), kde každý vrchol predstavoval jedinečný BCR a počet identických BCR na základe ich nukleotidových sekvencií definoval veľkosť vrcholu. Hrana existuje medzi vrcholmi, keď patria k rovnakému klonu, takže zhluky B buniek môžu byť zobrazené ako skupiny vzájomne prepojených vrcholov tvoriacich klon. Na kvantifikáciu siete sme použili Giniho index, čo je miera nerovnomernosti, ktorá bola aplikovaná na distribúcie vrcholov a klastrov. Pri aplikácii na veľkosť vrcholu, Gini(V), je reprezentovaná celková klonálna povaha. Ak je Gini(V) bližšie k 1, vrcholy sú nerovnaké a zobrazujú expanziu niektorých z nich a inak sú bližšie k 0. Keď sa aplikuje na veľkosť klastra, Gini(C), predstavuje sa klonálna dominancia. Ak je bližšie k 1, zhluky sú nerovnaké, a preto predstavujú dominantné klony, ak sú bližšie k 0, všetky zhluky majú rovnakú veľkosť.

Na obr. 4 ukazujeme príklad výrazných vizuálnych a kvantitatívnych rozdielov medzi reprezentatívnymi repertoármi B-buniek z každej z troch skupín klinických výsledkov v troch rôznych časových bodoch (pred transplantáciou a po transplantácii 6 a 24 mesiacov). . V repertoári PR existuje množstvo sekvencií B-buniek, ktoré tvoria viac a väčších zhlukov klonov v porovnaní s NP, zatiaľ čo PNR sa nachádza medzi nimi. V priebehu času skupina PR vykazuje pokles počtu BCR a jedinečných klonov v porovnaní s NP. Podrobné siete B-buniek každého jednotlivca v štúdii sú uvedené na doplnkových obrázkoch. 5–7. Je zaujímavé pozorovať veľmi rôznorodý vzor siete B-buniek u jednotlivca, u ktorého sa vyvinula PTLD v skupine NP (doplnkový obrázok 5), bez expanzie B-buniek pred transplantáciou, po ktorej nasledoval nárast B-buniek po 6. mesiacov a jasná klonálna expanzia sprevádzaná znížením diverzity 24 mesiacov po transplantácii.

Pri ďalšom hodnotení miery Giniho indexu (obr. 5) skupina PR konzistentne vykazovala výrazne vyššie miery pre vrchol aj klaster nad skupinou NP, čo naznačuje, že pacienti v skupine PR mali vyššiu klonálnu expanziu na začiatku,

Obr. 4 Repertoárové siete B-buniek od troch jedincov predstavujúce tri klinické výsledky v rôznych časových bodoch. Každý vrchol predstavuje jedinečný BCR, pričom veľkosť vrcholu je definovaná počtom identických BCR vzhľadom na nukleotidové sekvencie. Hrana existuje medzi vrcholmi, keď patria k rovnakému klonu, ako bolo definované vyššie, takže zhluky sú skupiny vzájomne prepojených vrcholov tvoriacich klon. Každá vzorka ukazuje gini index získaný pre veľkosť vrcholu (Gini(V)) a veľkosť klastra (Gini(C)). BCR odráža celkový počet B-bunkových receptorov pre túto špecifickú vzorku a klony odrážajú celkový počet jedinečných klonov. Zdrojové údaje sa poskytujú ako súbor zdrojových údajov

a ďalšia potransplantačná expanzia podskupiny dominantných klonov (P-hodnota [lineárna regresia] < 0.05,="" obr.="" 5).="" skupina="" pnr="" spadá="" medzi="" np="" a="" pr,="" ako="" bolo="" uvedené="" vyššie,="" hoci="" tento="" čas="" je="" výrazne="" odlišný="" od="" skupiny="" np="" v="" čase="" 24="" (p-hodnota="" [lineárna="" regresia]="">< 0,05).="" hoci="" údaje="" pre="" obrázok="" 5="" boli="" vytvorené="" z="" údajov="" gdna,="" izotyp="" igm="" pre="" cdna="" vykazoval="" rovnaké="" rozdiely="" (p-hodnota="" [lineárna="" regresia]="0.05)" (doplnkový="" obrázok="">

Niektoré klony a gény IGHV sa podieľajú na odmietnutí.

Hoci naším primárnym zameraním bolo charakterizovať repertoár B-buniek podľa skupín s klinickými výsledkami, čím sme poskytli globálny obraz o imunitnej odpovedi pred a po transplantácii, naše údaje nám tiež umožnili vykonať analýzu špecifickú pre Ig sekvenciu na klone a IGHV. génovej úrovni.

Pre klonálnu analýzu sme hodnotili asociáciu prítomnosti alebo neprítomnosti každého konkrétneho klonu (celkom 118 223 klonov) s klinickým výsledkom (PR, PNR, NR) v každom časovom bode. Aplikovaním Fisherovho presného testu sme našli 8, 4 a 21 klonov nominálne spojených s klinickými výsledkami v každom z 0, 6 a 24 mesiacov (doplnková tabuľka 1). Zatiaľ čo žiadny neprešiel viacnásobnou testovacou korekciou, hlavne kvôli nedostatku sily, keďže máme obmedzenú veľkosť vzorky v analýze s tisíckami parametrov (klony), mohli sme pozorovať, že tých niekoľko klonov, ktoré sa priblížili k významnosti (P-hodnota < {{="" 11}}.05)="" boli="" zdieľané="" medzi="" pacientmi="" iba="" v="" skupine="" pr="" a="" obohatené="" 24="" mesiacov="" po="">

Zvažovali sme tiež, či niektoré klony pretrvávali počas odberu vzoriek, viac ako iné, v rámci každého klinického výsledku (doplnkový obrázok 9). Zohľadňujeme dve rôzne miery: (1) počet pretrvávajúcich klonov a (2) klonálnu expanziu. Pozorovali sme, že klony, ktoré boli perzistentné v PR, boli podstatne viac expandované (P-hodnota [lineárna regresia]=0.01, PR vs. NP) a vykazovali trend vyššieho počtu perzistentných klonov (P- hodnota [lineárna regresia]=0.09). Ďalej sme skúmali, či tieto perzistentné klony boli zdieľané aj medzi rôznymi jednotlivcami v rámci každého klinického výsledku. Z 263 zistených perzistentných klonov bolo 23 zdieľaných medzi jednotlivcami. Päť bolo zdieľaných v rámci rovnakej PNR a šesť v rámci skupiny PR a medzi skupinou NP neboli zdieľané žiadne klony. Celkovo bolo 12 zdieľaných klonov spoločných v oboch skupinách pacientov s progresívnym chronickým transplantačným poškodením a fibrózou v priebehu času (PR a PNR). Zoznam klonov zdieľaných medzi jednotlivcami je uvedený v doplnkovom materiáli (doplnková tabuľka 2).

Ďalej sme vykonali analýzu génu IGHV, pričom sme sa zamerali na využitie génu IGHV na vzorku, definovanú ako počet, koľkokrát bol každý gén IGHV použitý, normalizovanú počtom klonov (aby sa predišlo skresleniu vzoriek určitých génov IGHV), odfiltrovaním s nízkou expresiou

Obr. 5 Vertex Gini Index vynesený oproti Cluster Gini Indexu. Bodový graf predstavuje každú vzorku v časoch 0, 6 a 24. Boxplochy ukazujú rozdiely Gini(V) a Gini(C) v čase 24. P-hodnoty sa získajú z úpravy lineárneho regresného modelu berúc do úvahy Gini(V) a Gini(C) ako závislú premennú a klinický výsledok ako nezávislú faktorovú premennú pre každý časový bod (n=27 vzoriek). V rámčeku je zobrazený iba čas 24, ale čas 0 a 6, kde sú tiež významné pre NP vs. PR: čas 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; čas 6 P (Gini(V))=0,02, P (Gini(C))=0,01; čas 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Pás vo vnútri rámčeka predstavuje strednú hodnotu, rámček definuje medzikvartilový rozsah (IQR) a fúzy definujú prvý a tretí kvartil ± 1,5 × IQR. Zdrojové údaje sa poskytujú ako súbor zdrojových údajov

gény (použitie génu IGHV > {{0}}.05 v najmenej 10 percentách vzoriek) a použitím lineárneho regresného modelu na nájdenie tých génov, ktoré boli spojené s každým klinickým výsledkom, v každom časovom bode. Z 27 génov IGHV, ktoré prešli filtrom s nízkou expresiou, sme našli významné gény medzi skupinou PR a NP (hodnota P < 0.05)="" s="" tromi="" génmi="" v="" čase="" 0,="" 7="" v="" čase="" 6="" a="" 16="" v="" čase="" čas="" 24="" (obr.="" 6a–c).="" z="" týchto="" génov="" 1="" (ighv3-11)="" v="" čase="" 0,="" 5="" génov="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" v="" čase="" 6="" a="" 16="" génov="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" v="" čase="" 24="" prešlo="" niekoľkonásobnou="" korekciou="" miery="" falošného="" zisťovania="" (fdr).="" je="" zaujímavé,="" že="" sme="" zistili,="" že="" ighv3-23="" bol="" najvýznamnejším="" a="" najrozšírenejším="" génom="" vo="" všetkých="" troch="" časových="" bodoch="" v="" porovnaní="" np="" vs.="" pr="" (čas="" 0:="" p-hodnota="0,04," čas="" 6:="" p-="" hodnota="0.003," čas="" 24:="" p-hodnota="0.02)" (obr.="" 6d).="" okrem="" toho="" sme="" hodnotili,="" či="" ighv3-23="" sekvencie="" boli="" nadmerne="" zastúpené="" medzi="" zdieľanými="" sekvenciami="" z="" predchádzajúcej="" klonálnej="" analýzy.="" pomocou="" analýzy="" obohatenia="" pomocou="" fisherovho="" presného="" testu="" sme="" zistili,="" že="" sekvencie="" ighv3-23="" boli="" výrazne="" nadmerne="" zastúpené="" v="" oboch,="" perzistentných="" klonoch="" zdieľaných="" medzi="" jednotlivcami="" (doplnková="" tabuľka="" 2)="" (hodnota="" p="">< 2,2="" ×="" 10="" -="" 16="" )="" a="" klony="" spojené="" s="" klinickým="" výsledkom="" v="" čase="" 24="" (doplnková="" tabuľka="" 1)="" (p-hodnota="">< 2,2="" ×="" 10-16).="" pozorovali="" sme,="" že="" jednotlivci="" 9="" v="" skupine="" nr,="" u="" ktorých="" sa="" zistilo,="" že="" zdieľajú="" niektoré="" perzistentné="" klony="" s="" progresormi="" v="" predchádzajúcich="" analýzach,="" boli="" klasifikovaní="" so="" skupinou="" pr="" vo="" všetkých="" časových="" bodoch.="" nezistil="" sa="" žiadny="" mätúci="" účinok="" na="" údaje="" z="" rôznych="" demografických="" a="" klinických="" premenných,="" ako="" je="" vek="" príjemcu,="" pohlavie,="" rasa,="" zdroj="" darcu,="" typ="" imunosupresie,="" nesúlad="" hla="" a="" príčina="" zlyhania="" obličiek.="" okrem="" toho="" sa="" zistilo,="" že="" tento="" gén="" je="" tiež="" významný="" v="" izotypoch="" igm="" (p-hodnota="" [lineárna="" regresia]="0.008)" a="" igd="" (p-hodnota="" [lineárna="" regresia]="0.05)" na="" základe="" cdna="" 24="" mesiacov="" po="" transplantácii,="" v="" súlade="" s="" predchádzajúcimi="" výsledkami,="" ktoré="" ukazujú="" zhodu="" s="" týmito="" dvoma="" izotypmi,="" ktoré="" sú="" najviac="" obohatené="" v="" skupine="" pr.="" len="" tri="" ďalšie="" gény="" sa="" našli="" ako="" významné="" v="" analýze="" cdna="" a="" všetky="" boli="" 24="" mesiacov="" po="" transplantácii="" v="" izotypoch="" igd="" a="" igm="" (ighv3-15="" a="" ighv4-="" 61="" v="" igd="" a="" ighv4-39="" v="">

Diskusia

Rozmanitosť je základnou charakteristikou imunitného systému a u zdravých ľudí je rozhodujúca proti patogénom pri zvládaní chorôb. Pri transplantácii orgánov sa klinicky zavádza zámerná terapeutická manipulácia, aby sa umožnilo aktívne ignorovanie cudzieho orgánu alebo akceptovanie vlastným imunitným systémom pacienta, aby sa nevyvolala aloimunitná odpoveď, ktorá by viedla k odmietnutiu. B bunky sú dôležitou súčasťou tohto procesu a naša skupina a iní ukázali, že sú kľúčové pri prezentácii antigénu32,33 a produkcii aloprotilátok34,35. V tejto práci sme použili vysoko výkonné sekvenovanie B-buniek, aby sme lepšie pochopili diverzitu a klonalitu B-buniek vobličkyobehu príjemcu transplantátu pred prihojením a po 24 mesiacoch sledovania s dlhodobým hodnotením imunitného repertoáru B-buniek. Celkovo naša analýza ukazuje vyššiu diverzitu B-buniek pred prihojením, rozdiely v pozdĺžnom smere so znížením diverzity sprevádzaným klonálnou expanziou a zvýšeným použitím určitých génov IGHV medzi tými, ktorí odmietnu štepy.

Kľúčovou nesplnenou klinickou potrebou transplantácie orgánu je nedostatok neinvazívnej, citlivej a presnej predpovede poškodenia transplantátu a zlých výsledkov. Táto úloha je komplikovaná skutočnosťou, že existujú rôzne faktory, ktoré ovplyvňujú prežitie štepu36. V tejto štúdii sme zistili, že stabilní jedinci mali pred transplantáciou zníženú diverzitu imunitného repertoáru B-buniek v porovnaní s tými, ktorí orgán odmietli. Ďalším krokom by malo byť preukázanie prediktívnej hodnoty rozmanitosti repertoáru B-buniek, poskytnutie potenciálnych lepších biomarkerov na predikciu odmietnutia pred prihojením a možnosť implementácie do klinickej starostlivosti a voľby imunosupresie pred a poobličkytransplantácia. Ak je táto vlastnosť výsledkom akéhokoľvek faktora, ktorý prispieva k zníženiu diverzity u stabilných jedincov, ako sú environmentálne alebo genetické faktory, mohli by sme odmietnutie nielen predvídať, ale aj mu zabrániť. Najnovšie zistenia skutočne ukázali, že zmeny v imunitnom systéme sú poháňané environmentálnymi a genetickými faktormi37,38. V našej štúdii sme nedokázali nájsť žiadnu súvislosť so žiadnymi demografickými a inými klinickými charakteristikami pacienta (vek, pohlavie, rasa, imunosupresia, zdroj orgánov, nezhody HLA a ESRD). V tomto ohľade potrebujeme novú analýzu, ktorá by potvrdila, či špecifické faktory ovplyvňujú rozmanitosť repertoáru B-buniek a výsledky transplantácií.

Ďalšie zaujímavé zistenie v našej štúdii ukazuje, že imunitný repertoár sa v priebehu času chová odlišne v závislosti od skupiny klinických výsledkov. U tých, ktorí vykazujú posttransplantačné odmietnutie orgánu, je diverzita B-buniek spočiatku vyššia a potom sa časom znižuje, zatiaľ čo opačný trend diverzity sa pozoruje u pacientov, u ktorých sa nevyvinie odmietnutie alebo chronické poškodenie štepu. Aj keď všetci jedinci dostali rovnakú imunosupresívnu záťaž po transplantácii, určité možné vysvetlenie zníženej diverzity u pacientov, u ktorých došlo k odmietnutiu, môže súvisieť so skutočnosťou, že títo pacienti dostávajú dočasne výrazne zvýšenú imunosupresívnu záťaž na liečbu odmietnutia a potom sa držia na vyššej základnej čiare. Aj keď by to mohlo vysvetliť zníženie diverzity B-buniek v priebehu času a vysvetliť rozdiel 24 mesiacov po transplantácii, je nepravdepodobné, že by to bola príčina, pretože znížená diverzita v skupine PR je

Obr. 6 Teplotná mapa a box graf pre analýzu využitia IGHV génov. Teplotná mapa zobrazujúca gény IGHV vybrané ako nominálne významné (P-hodnota < 0.05)="" v="" čase="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" a="" 24="" (c)="" pre="" np="" vs.="" pr.="" červená="" farebná="" škála="" predstavuje="" expresiu="" každého="" génu="" vo="" vzorkách.="" pásy="" v="" hornej="" časti="" ukazujú="" klinický="" výsledok="" a="" príčinu="" esrd.="" boxplot="" zobrazujúci="" ighv3-23="" výraz="" v="" časových="" bodoch="" pre="" np="" vs.="" pr="" (čas="" 0:="" p-hodnota="0,04," čas="" 6:="" p-hodnota="0,003," čas="" 24:="" p="" -hodnota="0.02)" (d).="" pás="" vo="" vnútri="" rámčeka="" predstavuje="" strednú="" hodnotu,="" rámček="" definuje="" medzikvartilový="" rozsah="" (iqr)="" a="" fúzy="" definujú="" prvý="" a="" tretí="" kvartil="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" p-hodnoty="" sa="" získajú="" z="" úpravy="" lineárneho="" regresného="" modelu,="" pričom="" v="" gény="" sa="" považujú="" za="" závislú="" premennú="" a="" klinický="" výsledok="" ako="" nezávislá="" premenná.="" (n="12" vzoriek).="" zdrojové="" údaje="" sa="" poskytujú="" ako="" súbor="" zdrojových="">

pozorované aj 6 mesiacov po transplantácii, v čase, keď sa u pacientov ešte nerozvinulo odmietnutie, čo naznačuje, že sú pravdepodobne zahrnuté ďalšie aktívne procesy. Pozorovanie selektívnej klonálnej expanzie s dominantnejšími klonmi len u pacientov, u ktorých sa vyvinula rejekcia a/alebo progresívna chronickáobličkypoškodenie transplantátu, naznačuje biologicky relevantný, aloantigénom riadený výber, pretrvávanie a expanziu určitých klonov v priebehu času, čo zodpovedá za celkové zníženie časovej diverzity. Aj keď môžeme predpokladať, že expanzia týchto klonov je pravdepodobne spojená s aloimunitným poškodením štepu, priamy dôkaz, že expanzia týchto klonov je aloimunitná, vyžaduje ďalšie štúdie in vitro a štúdie na zvieratách.

Akútne odmietnutie zostáva najsilnejším negatívnym faktorom pre dlhodobé prežitie štepu napriek rýchlemu zlepšeniu imunosupresívnej terapie39,40. Táto štúdia tiež nachádza súvislosť medzi používaním niektorých génov IGHV s odmietnutím, hoci príčinná súvislosť by sa mala preskúmať v budúcich štúdiách. IGHV3-23 je najzaujímavejší gén v analýze gDNA, pretože sa výrazne častejšie používa u pacientov, u ktorých sa vyvinula rejekcia vo všetkých meraných časových bodoch, a je nadmerne zastúpený v perzistentných klonoch zdieľaných medzi jednotlivcami a klonoch obohatených medzi odmietnutých pacientov 24 mesiacov po transplantácii. Tento gén je tiež validovaný 24 mesiacov po transplantácii v oboch izotypoch IgD a IgM v analýze cDNA. IGHV3-23 sa vo veľkej miere spája so zlou prognózou pri chronickej lymfocytovej leukémii41 a ukázalo sa, že prevažná väčšina sekvencií IGHV3-23 si zachovala schopnosť sprostredkovať interakcie superantigénov42. B-bunkové superantigény sú produkované vírusmi a baktériami, o ktorých je známe, že sa viažu na imunoglobulíny mimo konvenčných miest viažucich antigén43. Ukázalo sa, že stretnutia B buniek so superantigénom indukujú proliferáciu, aktiváciu, migráciu a deléciu44. V transplantovanýchobličkyexistuje možnosť kontinuálnej expozície vírusovým a bakteriálnym antigénom, ktorá súvisí buď s etiológiou primárneho vezikoureterického refluxu ako príčiny ESRD alebo sekundárneho močového refluxu po reimplantácii transplantovaného močovodu, alebo s rizikom refluxu po infekcii močových ciest. ktorý sa zvyšuje pri vystavení chronickej imunosupresii po transplantácii. Výsledky analýz sme okrem iných klinických a demografických faktorov upravili o príčinu zlyhania obličiek; vyššie diskutované výsledky zostávajú významné, aj keď sme si uvedomili, že NP nesprávne klasifikovaný pacient v analýze (obr. 6) mal refluxnú chorobu. Cheng a kol. už skôr zistili, že klony v bioptickom tkanive príjemcov transplantátu obličky infiltrované B bunkami mali medzi inými prevahu génu IGHV3-2345. Grover et al.46 preukázali, že protilátky pre tento konkrétny gén nerozoznávali darcovské HLA antigény, ale boli špecifické pre E. coli a Modena et al.47 ukázali, že záťaž v dôsledku počtu baktérií v moči bola oveľa vyššia u pacientov s intersticiálnej fibrózy a tubulárnej atrofie ako u štepov, ktoré fungovali dobre. Rozšírili sme tieto zistenia, ktoré dokazujú, že použitie génu IGHV3-23 je výrazne vyššie u pacientov s viacnásobným odmietnutím v periférnej krvi a môže spôsobiť odmietnutie určitých bežných antigénov. V budúcnosti by sa expresia IGHV3-23 mohla potenciálne použiť na monitorovanie imunitnej odpovede voči transplantovanýmobličky.

Rozšírením našej štúdie pomocou sekvenovania cDNA by sme mohli replikovať väčšinu našich výsledkov v dvoch izotypoch (IgM a IgD), ktoré ukazujú nižšiu diverzitu pred transplantáciou v NP, čo sú dva najvýznamnejšie v longitudinálnej analýze s väčšou expanziou a dominantnou klonov v sieťovej analýze a tiež pri replikácii génu IGHV3-23. Prvé protilátky, ktoré sa vytvoria pri humorálnej imunitnej odpovedi, sú vždy IgM a rýchlo postupujú k produkcii všetkých rôznych izotypov, IgD, IgA, IgG a IgE, ale osobitný záujem vyžaduje izotyp IgD48. IgD je koexprimovaný s IgM a secernovaný IgD existuje a má funkciu v krvi, slizničných sekrétoch a na povrchu vrodených imunitných efektorových buniek, ako sú bazofily49. Bazofily sú biele krvinky, ktoré bojujú s vírusmi, baktériami, parazitmi a hubami a podieľajú sa na ochoreniach obličiek a odmietnutí transplantátu50. Ide teda o ďalší dôkaz, ktorý dáva do súvislosti reakcie B-buniek s procesom odmietnutia vírusmi a baktériami.

Budúce štúdie sú potrebné na preukázanie, že táto aktivácia je spôsobená rozdielmi v mikrobióme príjemcu s dôsledkami v diagnostike a terapii.

Táto štúdia nám umožnila identifikovať relevantnosť niektorých z týchto klonov BCR, identifikovať klony BCR klinického významu s odmietnutím aloštepu a ukázať, že existuje pravdepodobná relevantnosť týchto klonov s heterológnou imunitou vzhľadom na obohatenie týchto klonov u pacientov s kolonizované močové cesty pred transplantáciou a ich biologický význam pre reakcie patogénov. Lepšie pochopenie správania imunitného repertoáru vobličkytransplantácie by neboli možné bez aplikácie BCRSeq v kombinácii s robustnou implementáciou výpočtových a štatistických potrubí. Napriek tomu existuje niekoľko obmedzení nášho prístupu, ktoré by sme si mali uvedomiť: Po prvé, veľkosť našej vzorky je vysoko vybraná a relatívne malá v súbore pediatrických pacientov, a aj keď sme v našej analýze dosiahli štatistickú významnosť a overili sme ju v dvoch rôznych zdrojoch údajov, na potvrdenie našich výsledkov bude potrebná ďalšia analýza. Po druhé, naše výsledky nie sú vyňaté z vplyvu, ktorý môže mať biologický a technický odber vzoriek na našu analýzu. Miery diverzity závisia od niekoľkých problémov: skutočnosť, že vo vzorke je zastúpená iba zlomok miliárd buniek v repertoári, rozdiely v hĺbke sekvenovania a možné experimentálne chyby. Všetky tieto problémy sme dôkladne kontrolovali, po prvé v laboratóriu, s použitím rovnakého množstva krvi pre každú vzorku v rovnakej dávke a po druhé, výpočtovo a štatisticky, aplikovaním rekonštrukčného nástroja na odhadnutie celkového repertoáru a vykonávaním downsamplingu na kontrolu hĺbky sekvenovania. a experimentálne chyby. Po tretie, vykonali sme BCRSeq s použitím dvoch rôznych zdrojov, gDNA a cDNA. Sekvenovanie gDNA uľahčuje odhad klonality danej Ig sekvencie, pretože počet čítaní sekvencie bude úmerný počtu gDNA molekúl. Sekvenovanie cDNA poskytuje odhad relatívnej úrovne expresie rôznych Ig sekvencií v repertoári. Ukázalo sa, že pre receptory T-buniek nie je charakterizácia klonotypu vykonaná na cDNA taká dobrá ako v prípade gDNA, čo ukazuje, že relatívny podiel jednotlivých klonov sa značne líši15 alebo že sledovanie klonov špecifických pre HIV je úspešné iba s gDNA, ale nie mRNA51. Po štvrté, vplyv imunosupresie môže byť pri tomto type analýzy mätúcim faktorom. V tejto štúdii všetky vzorky pochádzajú z klinickej štúdie, kde rovnakú imunosupresívnu záťaž dostali všetci pacienti po transplantácii. Napriek tomu sme kontrolovali dva typy steroidov na báze a bez steroidov, aby sme sa uistili, že to nie je problém, pričom sme nepozorovali žiadne rozdiely vo výsledkoch. Nakoniec, kohorta, ktorú tu uvádzame, je kohorta detských transplantácií. Väčšina klinických aspektov transplantovaných je podobná u detí a dospelých. Imunosupresia a použité režimy sú podobné, kreatinín je hlavným sérovým biomarkerom, akútna rejekcia sa určuje predovšetkým biopsiou s použitím Banffových kritérií a rejekčné mechanizmyobličkyštep sú vo všeobecnosti podobné52, preto sa väčšina výskumov vykonaných u dospelých alebo detí môže vzťahovať na obe. Iné aspekty, ako je nedodržiavanie/nedodržiavanie imunosupresie, imunologické aspekty, primárne ochorenia obličiek, ktoré vedú k zlyhaniu obličiek, často spojenému s urologickými problémami, a imunizácie, ktoré sú potrebné pred transplantáciou, sa však môžu líšiť, preto je potrebné ďalej analyzovať na zovšeobecnenie týchto zistení bude potrebná dospelá populácia.

Napriek týmto obmedzeniam naše údaje odhaľujú, že vyššia diverzita pred transplantáciou je pozorovaná u jedincov, ktorí pokračujú v odmietnutí orgánu, čo naznačuje predispozíciu odmietnutia, čo môže mať budúce dôsledky na predpovedanie rizika odmietnutia pred prihojením, imunosupresívnymi voľbami a klinickou starostlivosťou. praktík. Po 24 mesiacoch sledovania sa v rejekčnej skupine pozoruje celkové zníženie diverzity v priebehu času sprevádzané pretrvávaním a expanziou určitých klonov a vyšším využívaním niekoľkých génov IGHV, čo môže viesť k odmietnutiu určitých bežných antigénov. Osobitný záujem sa pozoruje v súvislosti so zvýšeným používaním génu IGHV3-23 medzi pacientmi s rejekciou, pretože bol predtým spájaný sobličkytransplantácia a mohla by byť kľúčovou súčasťou procesu odmietnutia. Táto práca predstavuje longitudinálnu analýzu imunitného repertoáru B-buniek pri transplantáciách orgánov a podporuje viac štúdií na potvrdenie týchto zistení, pretože môžu mať klinické dôsledky pri predpovedaní, kontrole, monitorovaní a liečbe.obličkyodmietnutie.

Metódy

Študovať dizajn. Študovali sme 81 vzoriek pre gDNA a 56 zhodných vzoriek pre cDNA pozdĺžne v časoch 0, 6 a 24 mesiacov od celkového počtu 27 pediatrických príjemcov, ktorí dostali primárnuobličkytransplantácia. Subjekty v tejto štúdii pochádzajú z klinickej štúdie (multicentrická štúdia SNSO1), kde boli jedinci randomizovaní (1:1) do tradičného imunosupresívneho režimu na báze nízkych dávok steroidov (steroidy, štandardná indukcia daklizumabu do druhého mesiaca po transplantácii, a udržiavacia imunosupresia takrolimom (Prograf, Astellas Pharma) a MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) alebo imunosupresívnym režimom bez steroidov (predĺžená indukcia daklizumabu až do šiesteho mesiaca po transplantácii, takrolimus a MMF). zaradení po schválení IRB a mali informovaný súhlas. V tejto štúdii dostávalo 14 pacientov režim vyhýbania sa steroidom, zatiaľ čo 13 dostávalo imunosupresívny režim na báze steroidov53 a žiadny z týchto pacientov nedostal imunosupresiu pred transplantáciou, pretože to bolo jedno vylučovacie kritérium. Liečba odmietnutia pozostávala z troch pulzov intravenózneho kortikosteroidu (10 mg/kg) a základnej imunosupresívnej intenzifikácie.

Všetky vzorky použité v štúdii mali pridruženú sériovú biopsiu aloštepu, ktorú odčítal centrálny patológ s použitím semikvantitatívnych histologických skóre. Klinické akútne odmietnutie bolo definované ako epizóda akútneho odmietnutia spojená s dysfunkciou štepu na základe viac ako 10-percentného zvýšenia sérového kreatinínu oproti východiskovým hodnotám a potvrdená centrálnym patologickým odčítaním biopsií podľa aktualizovanej Banffovej klasifikácie23,24. Chronické poškodenie aloštepu bolo definované pomocou skóre indexu chronického poškodenia aloštepu (CADI). Pacienti boli klasifikovaní podľa troch klinických výsledkov definovaných skóre CADI a epizódami rejekcie Neprogresívni pacienti (NP) mali nízke neinkrementálne skóre CADI v troch sériových biopsiách počas 2 rokov, bez akútnej rejekcie, progresívni bez odmietnutia (PNR) mali vyšší CADI skóre na ich sériových biopsiách počas 2 rokov a prírastkové v priebehu časových bodov bez odmietnutia a progresori s odmietnutím (PR) mali prírastkové vysoké skóre CADI na svojich sériových biopsiách počas 2 rokov s epizódami odmietnutia. Títo pacienti boli veľmi starostlivo vybraní z väčšej kohorty 120 pacientov, ktorí sa zhodovali s demografickými premennými a pre všetky NP a PNR, aby nemali žiadny dôkaz zápalu pri biopsii alebo subklinickom poškodení, ako bolo merané chýbajúcimi protilátkami špecifickými pre darcu. Žiadny nemal HLA alebo haploidentický štep, pretože to bolo vylučovacie kritérium pre zaradenie54. Všetky vzorky boli odobraté z 12 rôznych amerických detských transplantačných programov v rokoch 2004 až 2006 podľa protokolov schválených IRB. Štúdiu schválili aj programy ochrany ľudského výskumu (HRPP) Kalifornskej univerzity v San Franciscu a Stanfordskej univerzity, aby umožnili analýzu vzoriek biobanky. Všetci pacienti/opatrovníci poskytli informovaný súhlas s účasťou na výskume v plnom súlade s Helsinskou deklaráciou. Uvedené klinické a výskumné aktivity sú v súlade s princípmi Istanbulskej deklarácie, ako je uvedené v Istanbulskej deklarácii o obchodovaní s orgánmi a transplantačnej turistike.

Izolácia gDNA a RNA. Vzorky krvi (4,5 ml) sa odobrali do 5 ml skúmavky s červeným vrchom a inkubovali sa pri teplote miestnosti 30 minút, kým sa nevytvorila zrazenina. Vzorka sa potom centrifugovala pri 2000 x g počas 5 minút pomocou výkyvného rotora. Horná vrstva séra sa potom preniesla do inej kryoskúmavky a zrazenina sa až do použitia skladovala v tej istej skúmavke pri -80 stupňoch. Genomická DNA z celokrvných zrazenín bola extrahovaná pomocou Clotspin Baskets a Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Na extrakciu RNA zobličkybiopsia ihlou (Qiagen, Valencia, CA) a skladované pri -80 stupňoch; celková RNA sa extrahovala s použitím základnej zmesi 790 ul TRIzolu a 10 ul glykogénu. Vzorky tkaniva sa homogenizovali, inkubovali pri 15 až 25 stupňoch počas 5 minút a pridalo sa 160 ul chloroformu na oddelenie fáz. Zmes sa znova inkubovala pri 25 stupňoch počas 2 minút, nasledovala centrifugácia pri 4 stupňoch a použila sa na extrakciu RNA s použitím súpravy RNeasy Micro Kit (Qiagen Catalogue no. 4004). Množstvo a integrita RNA sa stanovili pomocou spektrofotometra Thermo Scientific NanoDrop ND{11}} UV–Vis a bioanalyzátora Agilent.

Sekvenovanie B-buniek. Pripravili sa templátové PCR reakcie s genómovou DNA

z 100 ng alikvót gDNA na vytvorenie šiestich nezávislých knižníc s čiarovým kódom na vzorku. Použili sa multiplexované priméry k IgH J alebo FR1 alebo FR2 rámcovým oblastiam podľa návrhu BIOMED-255. Desaťnukleotidové „sekvencie čiarového kódu“ v priméroch sa použili na označenie identity vzorky a identity replikovanej knižnice pre každú reakciu PCR. PCR sa uskutočnila s AmpliTaq Gold (Roche) polymerázou s nasledujúcim programom: 94 stupňov počas 5 minút; 35 cyklov (94 stupňov počas 30 s, 60 stupňov počas 45 s, 72 stupňov počas 90 s); a konečné predĺženie pri 72 stupňoch počas 10 min. Uskutočnila sa druhá PCR reakcia, aby sa zabezpečilo, že knižnice neboli amplifikované do nasýtenia pred čistením gélu a sekvenovaním. Celkovo 0,4 ul každého prvého produktu PCR templátovalo druhú PCR reakciu s použitím externých primerov špecifických pre 454 linkerových sekvencií; amplifikácia sa uskutočnila s programom: 94 stupňov počas 15 minút, 12 cyklov (94 stupňov počas 30 s, 60 stupňov počas 45 s, 72 stupňov počas 90 s) a konečné predĺženie pri 72 stupňov počas 10 minút. Chybovosť AmpliTaq Gold by mala mať minimálny vplyv na identifikáciu klonálne príbuzných sekvencií alebo odhad miery somatických mutácií v sekvenciách, ako je uvedené niekde inde56. cDNA bola syntetizovaná z celkom 300 ng RNA s primárnou aktiváciou náhodnými hexamérmi. Šablóny sa amplifikovali pomocou PCR s použitím primérov Biomed IGHV v rámci 1 (FR1) a izotypovo špecifických primérov umiestnených v prvom exóne konštantných oblastí. Tieto priméry18, 57 tiež kódovali približne polovicu Illumina linkerových sekvencií potrebných na vytvorenie klastra a sekvenovanie na prístroji MiSeq. Identita vzorky bola kódovaná osemnukleotidovými multiplexnými identifikačnými čiarovými kódmi v každom priméri. Na rozpoznávanie klastrov Illumina boli štyri randomizované nukleotidy kódované v priméroch bezprostredne za sekvenciou linkera Illumina v priméroch konštantnej oblasti. Každý izotyp protilátky pre každú vzorku bol amplifikovaný v samostatnej PCR reakcii, aby sa zabránilo tvorbe skrížených izotypových chimérických produktov PCR. PCR sa uskutočnila s AmpliTaq Gold (Roche) podľa pokynov výrobcu a použila sa program 94 stupňov počas 7 minút, 35 cyklov (94 stupňov počas 30 s, 58 stupňov počas 45 s, 72 stupňov počas 120 s) a konečný predĺženie pri 72 stupňoch na 10 min. Druhý krok PCR sa použil na pridanie zvyšnej časti Illumina linkerov k amplikónom a uskutočnil sa pomocou súpravy Qiagen Multiplex PCR kit (Qiagen) podľa pokynov výrobcu s použitím 0,4 mikrolitrov prvého produktu PCR ako templátu v Reakcia 30 mikrolitrov. Program PCR pre druhý krok PCR bol 94 stupňov počas 15 minút, 12 cyklov (94 stupňov počas 30 s, 60 stupňov počas 45 s, 72 stupňov počas 90 s) a konečné predĺženie pri 72 stupňoch počas 10 minút. Produkty každej PCR reakcie boli spojené v odhadovaných ekvimolárnych množstvách, elektroforézované na agarózových géloch a gél extrahovaný pomocou súprav QIAquick (Qiagen). Vysokovýkonné sekvenovanie templátových knižníc genómovej DNA sa uskutočnilo na platforme 454 (Roche) s použitím titánovej chémie. Sekvenovanie knižnice cDNA sa uskutočnilo na prístroji Illumina MiSeq s použitím 600-cyklových sekvenčných súprav. Úplný zoznam primérov používaných s MiSeq (M154 a M155) a 454 Titanium (T7) je zahrnutý v doplnkových údajoch 1.

Sekvenčné čítania boli spracované nasledovne: čítania párových koncov sa zlúčili s použitím FLASH58, kde potom boli sekvencie demultiplexované a orezané o čiarové kódy a sekvencie primérov IGHV. Oblasti V, D a J a spoje V–D (N1), D–J (N2) boli identifikované pomocou programu na porovnanie IgBLAST59. Sekvencie boli filtrované, aby sa odstránili non-IGH artefakty, sekvencie s inzerciou alebo deléciou V génu, chimérické sekvencie a nefunkčné sekvencie. Na úrovni vzorky sme vylúčili tie s<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Analýza diverzity. Diverzita sa meria podľa druhovej bohatosti vzhľadom na počet klonov na vzorku. Toto meranie nezohľadňuje frekvenciu každého druhu, preto sme na meranie diverzity použili aj Shannonovu entropiu (H).

informácie o veľkostnom rozložení druhov v populácii. H je definované ako:

kde N je počet jedinečných klonov a pi je frekvencia klonu i. H sa pohybuje od 0 (vzorka iba s jedným klonom) do Hmax ¼ log2N (vzorka s rovnomernou distribúciou klonov).

Potom sme použili všeobecný lineárny model, aby sme našli súvislosť medzi bohatstvom a entropiou s klinickým výsledkom v rôznych časových bodoch. Tento model sme upravili podľa všetkých dostupných klinických premenných uvedených v tabuľke 1, aby sme si boli istí, že ktorákoľvek z charakteristík pacienta bola mätúcim faktorom

Na modelovanie pozdĺžnej zložky údajov sme použili model lineárneho zmiešaného účinku zvažujúci model podmieneného rastu, ako je znázornené na doplnkovom obrázku 10. Na aplikáciu tohto modelu sme použili balík lme4 v R vzhľadom na interakciu medzi klinickým výsledkom a časom do nájsť spojenie s bohatstvom a rozmanitosťou, pričom čas je náhodný efekt.

Aby sme sa vyrovnali so skutočnosťou, že opatrenia týkajúce sa diverzity môžu byť ovplyvnené problémom chýbajúcich druhov (v repertoári je zastúpený iba zlomok miliárd buniek) a sekvenčnými a experimentálnymi chybami, okrem úplnej analýzy údajov sme vykonali dve stratégie. Najprv sme použili nástroj Recon (rekonštrukcia odhadovaných klonov z pozorovaných počtov)29 na riešenie problému chýbajúcich druhov. Recon je modifikovaná metóda maximálnej pravdepodobnosti, ktorá poskytuje celkovú rozmanitosť repertoáru z meraní na vzorke. Recon prináša presné a robustné odhady súboru opatrení diverzity, vrátane bohatosti a entropie, čo umožňuje robustné porovnávanie diverzity medzi jednotlivcami. Po druhé, vykonali sme stratégiu downsamplingu s náhodnou podskupinou odčítaní pre každú vzorku rovnajúcu sa najmenšej veľkosti sekvenovania, po čom nasledovalo prepočítanie klonov B-buniek, aby sa upravila hĺbka sekvenovania a riešili sa možné experimentálne chyby. Pre gDNA existujú vzorky s veľmi nízkymi hodnotami (< 1000),="" a="" aby="" sme="" sa="" vyhli="" strate="" mnohých="" sekvencií="" a="" reálnosti="" údajov,="" vylúčili="" sme="" celkovo="" deväť="" vzoriek,="" ktoré=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Sieťová analýza. Algoritmus generovania siete je veľmi podobný tomu, ktorý bol definovaný vyššie31. V stručnosti, každý vrchol predstavuje sekvenciu B-buniek, kde veľkosť je definovaná všetkými identickými sekvenciami. Hrany sa vypočítajú s použitím klonovej definície (rovnaké V a J segmenty, rovnaká dĺžka CDR3 a 90 percent nukleotidovej identity medzi CDR3) a zhluky predstavujú každý klon v repertoári. Analýza bola vykonaná pomocou balíka grafov v jazyku R pomocou rozloženia_s_voľbou grafu na vygenerovanie grafu.

Na kvantifikáciu siete sme vypočítali Gini index pre veľkosť vrcholu a veľkosť klastra. Gini Index je miera nerovnomernosti, ktorá sa vo veľkej miere používa na meranie distribúcie bohatstva. Meria nerovnosť medzi hodnotami rozdelenia frekvencií. Použili sme funkciu Gini z jedného balíka v R na výpočet Giniho koeficientu pre veľkosť vrcholu a distribúciu veľkosti klastra. Giniho koeficient nula vyjadruje dokonalú rovnosť a Giniho koeficient 1 vyjadruje maximálnu nerovnosť.

Klonálna analýza. Na štúdium špecifických klonov spojených s klinickými výsledkami sme vytvorili matricu so všetkými klonmi, ktoré sú prítomné vo viac ako jednej vzorke (celkový počet=118, 223) vo všetkých vzorkách v každom časovom bode. Potom sme študovali súvislosť s klinickým výsledkom každého konkrétneho klonu, pričom sme definovali jednu premennú na klon ako prítomnú/žiadnu. Nakoniec sme použili Fisherov presný test, aby sme zohľadnili významnosť v tabuľkách 2 × 3 pre každý klon v každom časovom bode. Tiež sme študovali perzistentné klony definované tými klonmi, ktoré sú vo viac ako jednom časovom bode u každého jednotlivca. Potom, aby sme zohľadnili rozdiely podľa klinického výsledku, použili sme lineárny model definujúci ako závislú premennú počet klonov (na meranie rozdielov v perzistencii) a počet počtov každého klonu (na meranie klonálnej expanzie) a klinický výsledok ako nezávislý prediktor.

Analýza využitia génov IGHV. Na štúdium génov IGHV sme hodnotili využitie génu IGHV na vzorku ako počet použití každého génu normalizovaný počtom klonov, aby sa predišlo nadmernému zastúpeniu určitých génov IGHV. Pre štatistickú analýzu sme odfiltrovali tie gény s veľmi nízkou expresiou (použitie IGHV/klony < {{0}}.05)="" v="" najmenej="" 10="" percentách="" vzoriek.="" celkovo="" sme="" analyzovali="" 27="" ighv="" génov="" zodpovedajúcich="" 63="" vzorkám.="" potom="" sme="" použili="" lineárny="" model,="" aby="" sme="" našli="" tie="" gény,="" ktoré="" boli="" spojené="" s="" klinickým="" výsledkom="" v="" každom="" časovom="" bode,="" a="" tieto="" výsledky="" sme="" opravili="" viacnásobným="" testovaním="" pomocou="" benjaminiho="" a="" hochberga="" fdr="">< 0,05.="" tento="" model="" sme="" upravili="" podľa="" všetkých="" dostupných="" klinických="" premenných="" uvedených="" v="" tabuľke="" 1,="" aby="" sme="" si="" boli="" istí,="" že="" ktorákoľvek="" z="" charakteristík="" pacienta="" bola="" mätúcim="">

Súhrn prehľadov. Ďalšie informácie o dizajne výskumu sú k dispozícii v súhrne správ o výskume prírody, ktorý je prepojený s týmto článkom.

Referencie

1.Cai,J.& Terasaki,PI Posttransplantačné monitorovanie protilátok a HLA 1.(identifikácia epitopu protilátky. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TKet al. Non-HLA protilátky proti imunogénnym epitopom predpovedajú vývoj chronického poškodenia renálneho aloštepu. J. Am. Soc. Nephrol.23,750-763 (2012).

3. Li, L. a kol. Kompartmentová lokalizácia a klinický význam protilátok MICA po transplantácii obličky. Transplantation 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U. Dlhodobé prežívanie renálneho aloštepu v Spojených štátoch amerických: kritické prehodnotenie. Am.J. Transplantácia. 11, 450-462(2011).

5. Vedecký register príjemcov transplantátov. Dostupné na: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Prístup:24. mája 2018)Pineda, S. et al. Nové nehistokompatibilné antigénne nezhodné varianty

6. Zlepšiť schopnosť predpovedať riziko odmietnutia sprostredkovaného protilátkami pri transplantáciách obličiek. Predné. Immunol. 8,1687 (2017).

7. Valuiskikh, A. Baldwin, WM& Fairchild, RL Nedávny pokrok a nové perspektívy v štúdiu reakcií T buniek na aloštepy. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM Jin a jang B buniek pri odmietnutí a tolerancii štepu. Transplantácia. Rev.24,67-78(2010).

9. Georgiou, G. et al. Prísľub a výzva vysokovýkonného sekvenovania repertoáru plusových protilátok. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Podobnosť a divergencia vo vývoji a expresii myšacích a ľudských protilátkových repertoárov. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Praktické pokyny pre analýzu sekvenovania repertoáru B-buniek. Genome Med. 7, 121 (2015).

12. Shugay, M. a kol. VDJtools: Zjednotenie postanalýzy repertoárov receptorov T buniek. Výpočet PLOS. Biol. 11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et al. Kvantitatívna charakterizácia repertoáru T-buniek a biomarkerov pri odmietnutí obličkového transplantátu. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. a kol. Sledovanie darcovo-reaktívnych T buniek: Dôkaz klonálnej delécie u tolerantných pacientov s transplantáciou obličky. Sci. Prekl. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M. et al. Analýza repertoáru TCR pomocou sekvenovania novej generácie umožňuje komplexnú diferenciálnu diagnostiku patológie súvisiacej s T bunkami. Am. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A. et al. Imunoglobulínové B bunky s prepínanou triedou tvoria aktívnu imunitnú os medzi CNS a perifériou pri roztrúsenej skleróze. Sci. Prekl. Med. 6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB & Hernandez, RDSŠtatistická inferencia konvergentnej odpovede protilátkového repertoáru na vakcínu proti chrípke. Genome Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM a kol. IgH sekvencie pri bežnej variabilnej imunitnej nedostatočnosti odhaľujú zmenený vývoj a selekciu B buniek. Sci. Prekl. Med. 7,302ra135 (2015).

19.Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M.& Abramowicz,D.Operačná tolerancia pri transplantácii obličky a súvisiace biomarkery. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Beausang, JFet al. Repertoáre B buniek u kandidátov na transplantáciu obličky senzibilizovaných HLA, ktorí podstupujú desenzibilizačnú terapiu. J. Prekl. Med. 15, 9 (2017).

21. Ferdman, J. a kol. Expanzia a somatická hypermutácia klonov B-buniek v odmietnutých ľudských obličkových štepoch. Transplantácia 98, 766-772 (2014).

22. Vollmers, C. a kol. Monitorovanie farmakologicky indukovanej imunosupresie pomocou sekvenovania imunitného repertoáru na zistenie akútneho odmietnutia aloštepu u pacientov po transplantácii srdca: Štúdia presnosti diagnostiky Proof-of-Concept. PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al. Banff'05 Meeting Report: Diferenciálna diagnostika chronického poškodenia aloštepu a eliminácia chronickej aloštepovej nefropatie (CAN). Am. J. Transplant.7,518-526(2007). imunosupresia pri transplantácii obličky: je čas považovať ju za štandardnú liečbu? Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. a kol. Trojročné výsledky u pacientov po transplantácii obličky randomizovaných na imunosupresiu bez steroidov alebo vysadenie steroidov s enterosolventným mykofenolátom sodným a cyklosporínom: štúdia s nekonečnom. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Robustné odhady celkovej diverzity imunitného repertoáru z vysokovýkonných meraní na vzorkách. Nat. Commun.7, 11881(2016).

30. Stern, JNHet al. B bunky obývajúce mozog roztrúsenej sklerózy dozrievajú v drenážnych krčných lymfatických uzlinách. Sci. Prekl. Med. 6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet al. Sieťové vlastnosti odvodené z hlbokého sekvenovania repertoárov ľudských B-bunkových receptorov vymedzujú populácie B-buniek. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Molekulárna heterogenita pri akútnom odmietnutí obličkového aloštepu

identifikované profilovaním DNA microarray. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33. Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPfenotypické hodnotenie podskupín b-buniek po rituximabe na liečbu akútneho odmietnutia obličkového aloštepu u pediatrických príjemcov. Transplantácia 91, 1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR & Targeting, B. Bunky a protilátky pri transplantácii. Am. J. Transplant.11,1359-1367 (2011).

35. Dijke, EIet al.Bcells in transplantation.J. Transplantácia pľúc srdca. 35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ& Kuypers, DRDdiagnostika a prevencia chronickej straty aloštepu obličiek. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. Prirodzené variácie v parametroch vrodenej imunitnej bunky sú prednostne riadené genetickými faktormi. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Pôvod rozmanitosti v ľudskej imunite. Nat. Immunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Nedostatok zlepšenia v prežívaní obličkových aloimplantátov napriek výraznému zníženiu miery akútneho odmietnutia v poslednom období. Am.J. Transplant.4,378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G. & Nishio-Lucar, A. Funkcia štepu a strednodobé výsledky transplantácií obličiek sa v poslednom desaťročí zlepšili: Analýza databázy transplantátov obličiek v Spojených štátoch. Transplantácia. priamy 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. a kol. Expresia mutovaných génov IGHV3-23 pri chronickej lymfocytovej leukémii identifikuje podskupinu chorôb so zvláštnymi klinickými a biologickými znakmi. Clin. Cancer Res. 16,620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. Superantigény B-buniek: definícia a potenciálny vplyv na imunitnú odpoveď.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ& Goodyear, CSA model B-bunkový superantigén a imunobiológia B lymfocytov. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ& Goodyear, CS Confounding B-cell defense: lekcie zo stafylokokového superantigénu. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J. et al. Ektopické zhluky B-buniek, ktoré infiltrujú transplantované ľudské obličky, sú klonálne. Proc. Natl Acad. Sci. 108,5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet al. Kostimulačný imunogén LPS indukuje klony B-buniek, ktoré infiltrujú transplantované ľudské obličky. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 6036-6041(2012).

47,Modena,BDet al. Zmeny v populáciách mikrobiómov v moči korelujú pri transplantáciách obličiek s intersticiálnou fibrózou a tubulárnou atrofiou dokumentovanou v biopsiách včasného sledovania. Am. J. Transpl.17,712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. Nové poznatky o záhade imunoglobulínu D. Immunol. Rev. 237,160-179 (2010).

49. Chen, K. a kol. Imunoglobulín D zvyšuje imunitný dohľad aktiváciou antimikrobiálnych, prozápalových a B-bunkových stimulačných programov v bazofiloch. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Bazofily a žírne bunky pri poškodení obličiek. KidneyInt. 76, 1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Molekulárne sledovanie vírusu ľudskej imunodeficiencie

nef špecifický cytotoxický T-bunkový klon vykazuje perzistenciu klonovo špecifického T-bunkového receptora DNA, ale nie mRNA po včasnej kombinovanej antiretrovírusovej terapii.Immunol. Lett.66,219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina, P. & Harmon, WEKidneyho transplantácia u detí. N. Engl. J. Med. 371,549-558(2014).

53. Sarwal, MMet al. Úplné vyhýbanie sa steroidom je účinné a bezpečné u detí s transplantáciou obličiek: Multicentrická randomizovaná štúdia s trojročným sledovaním. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al. Banff 07 klasifikácia patológie renálneho aloštepu: aktualizácie a budúce smery. Am.J.Transplant.8,753-760 (2008).

54. Li, L a kol. imunosupresia bez steroidov od roku 1999: 129 pediatrických transplantácií obličiek s trvalým prínosom štepu a pacienta. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A. et al. Klinický vplyv humorálnej imunity pri transplantácii obličky u detí.J. Am. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).