Abstraktné
Pozadie:Čínske spracovanie materia medica je význačná a jedinečná farmaceutická technika v tradičnej čínskej medicíne (TCM) používaná na zníženie vedľajších účinkov a zvýšenie alebo dokonca zmenu terapeutickej účinnosti surových bylín. Za zvýšenú účinnosť liečivých rastlín sú primárne zodpovedné zmeny základných zložiek vyvolané optimalizovaným postupom spracovania. Ledvinovo-jangový povzbudzujúci účinok Cistancha deserticola (C. deserticola) dusenej na ryžovom víne bol silnejší ako surový C. deserticola (CD).
Metódy:Na zistenie vplyvu spracovania bola vykonaná porovnávacia analýza pomocou UPLC-Q-TOF-MSE s informatickou platformou UNIFI. Uskutočnili sa štúdie in vitro na charakterizáciu zložiek, ako aj metabolitov in vivo. Chemické zložky boli stanovené v CD a jeho spracovaných produktoch. Na vyhodnotenie variácií medzi nimi sa uskutočnili viacrozmerné štatistické analýzy, zatiaľ čo OPLS-DA sa použil na párové porovnanie.
Výsledky:Výsledky tejto štúdie odhalili značné rozdiely vo fenyletanoidových glykozidoch (PhG) a iridoidoch po spracovaní. Celkovo bolo v extraktoch CD a jeho spracovanom produkte zistených 97 zlúčenín. PhG, ktoré majú 4'-O-kafeoylovú skupinu v 8-O- -d-glukopyranozylovej časti, ako je akteozid, cistanozid C, kamneozid II, osmanthuzid, sa po spracovaní znížili, zatiaľ čo PhG s 6'- O-kafeoylová skupina v 8-O- -d-glukopyranozylovej časti, ako je izoacetozid, izocistanozid C, izokampneozid I, izomartynozid, zvýšená, najmä v skupine CD-NP. Zvýšila sa aj intenzita echinakozidu a cistanozidu B, ktorých štruktúra má 6'-0- -d-glukopyranozylovú skupinu. V štúdii in vivo sa v plazme, výkaloch a moči potkanov zistilo 10 prototypových zložiek a 44 metabolitov. Získané výsledky odhalili, že spracovanie vedie k značným zmenám v chemických zložkách CD a ovplyvňuje dispozíciu zlúčenín in vivo a metabolické procesy fázy II sú kľúčovými kaskádami každej zlúčeniny a väčšina metabolitov je spojená s echinakozidom alebo acetonidom.
Ďalšie informácie:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Závery:Toto je prvý globálny porovnávací výskum surových a spracovaných CD. Tieto zistenia prispievajú k nášmu chápaniu vplyvu spracovania CD a poskytujú dôležité údaje pre budúce skúmanie účinnosti.
Kľúčové slová:Cistanche deserticola, Spracovanie, UPLC-Q-TOF-MSE, Chemické profily, Metabolity in vivo
Úvod
Spracovanie čínskej materia medica (CMM) preukázalo významnú použiteľnosť v klinickej praxi tradičnej čínskej medicíny (TCM) a už niekoľko storočí sa považuje za životaschopnú liečbu. Ide o unikátnu farmaceutickú technológiu, ktorá bola odvodená z teórie TCM. Nasledujúce spracovanie, významné rozdiely vo vzhľade, chemických zložkách, charakteristikách a medicínskom význame všetkých typov TCM boli identifikované, čo vedie k predpokladu, že spracovanie by mohlo zlepšiť účinnosť alebo znížiť toxické účinky TCM.
Už stovky rokov sa Cistanche deserticola (Roucongrong v čínštine, CD) bežne používa v klinickej praxi TCM na doplnenie funkcií obličiek. Pomáha tiež pri zvlhčovaní čreva, čo vedie k uvoľneniu čreva [1]. Cistanche bol prvýkrát zaznamenaný v ShenNongBencaoJing. Bežne sa vyskytuje v suchých a polosuchých biotopoch v celej Eurázii a severnej Afrike vrátane Iránu, Číny, Indie a Mongolska [2]. Spracovanie CD sa uskutočnilo parením s ryžovým vínom za normálneho tlaku, čo je spôsob prípravy zdokumentovaný v čínskom liekopise (čínsky Jiucongrong, ďalej len "CD-NP"). A parenie CD s ryžovým vínom pod vysokým tlakom je efektívnejšia metóda prípravy (ďalej len „CD-HP“) [3, 4]. Niekoľko štúdií odhalilo, že farmakologické účinky CD sú odlišné od jeho spracovaných produktov [5]. CD môže tonizovať jang obličiek a uvoľniť črevá, zatiaľ čo po naparení s ryžovým vínom by sa posilnil efekt doplnenia jangu obličiek. V našej skoršej štúdii sa zistilo, že CD-NP by mohol zvýšiť sonifikáciu obličiek a podporiť jang a zmierniť účinky zvlhčovania čriev a defekácie [6–8]. V klinickej praxi sú spracované produkty najčastejšie používanou formou.
Doteraz niekoľko štúdií analyzovalo chemické zložky CD, po ktorých nasledovala izolácia a identifikácia viac ako 100 zlúčenín [9–11], ako sú fenyletanoidové glykozidy (PhG), iridoidy, lignany a oligosacharidy ako jeho hlavné chemické zložky. . Tiež sa uvádza, že existuje mnoho farmakologických aktivít PhG vrátane imunomodulačných, neuroprotektívnych, hepatoprotektívnych, protizápalových, antioxidačných atď.[12–14]. Iridoidy majú protizápalové účinky [15, 16]. Skoršie štúdie tiež odhalili, že niektoré chemické zložky vykazovali zmeny počas spracovania [17–20]. Na základe týchto správ možno predpokladať, že zmeny v chemickom zložení po spracovaní vedú k rôznym farmakologickým účinkom, ktoré je potrebné ďalej skúmať.
V súčasnej štúdii sa na porovnávaciu analýzu vykonala citlivá a účinná metóda, tj ultra vysokoúčinná kvapalinová chromatografia spojená s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) a na kvalitatívnu analýzu extraktov sa vykonali štúdie in vitro. CD, CD-NP a CD-HP na objasnenie ich chemických profilov. Vo všeobecnosti sa exogénne chemikálie s vysokou expozíciou v cieľových orgánoch považovali za účinné zložky. Preto sa u potkanov CD a jeho spracované produkty podávali orálne, po čom nasledovala ich charakterizácia. Existujúca štúdia po prvýkrát odhaľuje porovnávaciu štúdiu (in vitro aj in vivo) surového a spracovaného CD. Získané výsledky by rozšírili naše chápanie efektu spracovania CD, čo by mohlo byť užitočné pre ďalšie štúdie.
Materiály a metódy
Materiály
Štandardné zlúčeniny ajugolu (180120) a 2'-acetylacetozidu (M0601AS) poskytla spoločnosť Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Čína). Cistanozid F (MUST-17022620), echinakozid (D1105AS), cistanozid A (M0906AS) a izoakteozid (M0106AS) poskytla spoločnosť Must (Sichuan China); akteozid (O0618AS), salidrozid (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozid (A0407AS) a kyselina geniposidová (MB6001-S) boli získané od Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Čína). Kyselina 8-epideoxylogánová (B31123) bola získaná od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Čína. Metanol a acetonitril boli MS kvality a boli získané od Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko. Kyselina metanová (CH202) v čistote pre HPLC bola poskytnutá spoločnosťou Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). Voda použitá v existujúcej štúdii bola spracovaná systémom Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Ryžové víno poskytla spoločnosť Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Čína).
Cistanche deserticola bola odobratá od Neimenggu wangyedi cistanche Co. Ltd. Vzorky boli identifikované prof. Yanjunom Zhaiom (farmaceutická škola, Liaoning University of TCM). Vzorky boli predložené Univerzite tradičnej čínskej medicíny v Liaoningu.
Zvieratá
Samce potkanov Sprague-Dawley (stupeň SPF) s celkovou telesnou hmotnosťou 180–220 g boli poskytnuté spoločnosťou Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource
Centrum provincie Liaoning, licenčné číslo: SCXK- 2015–0001). Tieto potkany boli umiestnené v chovnej miestnosti s dobre udržiavanou teplotou a vlhkosťou, tj 20-26 stupňov, 50-70 percent počas jedného týždňa. Potkany boli pred experimentom kŕmené obvyklým laboratórnym jedlom a vodou. Zvieratá hladovali cez noc, avšak pred experimentom bola poskytnutá voda ad libitum. Potkany boli popravené 10 percentným anestetikom chloralhydrátu. Inštitucionálny výbor pre etiku zvierat v provincii Liaoningskej nemocnice čínskej medicíny schválil všetky experimentálne protokoly (25. 3. 2019, 2019015).
Príprava CD, CD-NP a CD-HP extraktu
CD-NP a CD-HP boli spracované z rovnakej šarže Cistanch deserticola. Na prípravu CD-NP sa suché kúsky CD (hrúbka 5 mm, 100 g) zvlhčili ryžovým vínom (30 ml) a dusili sa v pare pri 100 stupňoch počas 16 hodín, po čom nasledovalo sušenie pri 55 stupňoch v sušiarni. Zatiaľ čo CD-HP sa pripravil infiltráciou suchých kúskov CD (hrúbka 5 mm, 100 g) s ryžovým vínom (30 ml), nasledovalo naparovanie pri 1,25 atmosférickom tlaku počas 4 hodín. a potom sa suší v sušiarni pri 55 stupňoch.
V 100 ml odmernej banke sa jeden gram prášku preosial cez sito č. 4, potom sa pridalo 50 percent metanolu (50 ml) a potom sa tesne prikryl a premiešal. Táto zmes sa odvážila a nasledovala polhodina. macerácia. Po macerácii sa zmes podrobila ultrazvuku (výkon 250 W, frekvencia 35 kHz) počas 40 minút, nasledovalo ochladenie a opätovné váženie. Strata hmotnosti bola doplnená 50 % metanolom, riadne premiešaná a ponechaná stáť, nasledovala filtrácia supernatantu a potom použitie získaného filtrátu ako testovacieho roztoku.
MSE analýza aktívnych zložiek
Príprava štandardných látok: tableside-A (3.02 mg), echinakozid (3.00 mg), 2'-acetylakteozid (2,34 mg), acetonid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg),cistanozid-F (2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalóg (2,39 mg), kyselina tenipozidová (2,56 mg) a kyselina 8-epideoxylogánová (2,34 mg) sa pridali do 10 ml odmernej banky, pridal sa konštantný objem metanolu podľa mierky, konfigurovaný do zodpovedajúceho koncentračného referenčného roztoku. Každý zo 100 ul bol konfigurovaný do zmiešaného referenčného roztoku.
Podmienky MS analýzy: Hodnota te mass bola pred experimentom korigovaná a bol použitý negatívny iónový mód. Rozsah hmotnosti bol 50–1200 Da a vzorka bola vstreknutá cez niekoľko vstrekovacích čerpadiel. Rýchlosť kužeľa bola 100 l/h, prietok rozpúšťadla bol nastavený na 800 l/h. Napätie kapiláry a kužeľa bolo podľa toho pevne nastavené na 2500 a 40 V. Teplota zdroja iónov a rozpúšťacieho plynu bola 100 stupňov a 400 stupňov a frekvencia získavania signálu bola 0,5 S-1.
UPLC-Q-TOF-MSE analýza CD extraktu
Chromatografické vyhodnotenie sa uskutočnilo v systéme Waters ACQUITY I-CLASS UPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Vrátane kolóny ACQUITY UPLC® BEH C18 (50×2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilná fáza pozostávala z vody s 0,1 percenta kyseliny mravčej (A) a acetonitrilu s obsahom 0,1 percenta kyseliny mravčej (B), elučné podmienky boli nasledovné: 97 percent až 85 percent A (0–5 minút), 85 percent až 75 percent A (5–15 minút), 75 percent až 65 percent A (15–16 minút), 65 percent až 55 percent A (16–18 minút) . Prietok bol 0,3 ml min-1, zatiaľ čo teplota miestnosti autosamplera a kolóny bola 30 stupňov a 8 stupňov oddelene. Objem injekcie bol 1,0 ul.
Vyhodnotenie hmotnostnej spektrometrie sa uskutočnilo pomocou Waters XEVO G{{0}}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), ktorý obsahuje zdroj ESI. Prietok plynného dusíka bol pevne stanovený na 800 l·h-1 s teplotou 400 stupňov, teplota zdroja bola pevne stanovená na 100 stupňov a kužeľový plyn bol nastavený na 50 l h-1. Napätie kužeľa a kapiláry bolo podľa toho upravené na 40 a 2000 V. Energia kolízie rampy sa použila v rozsahu 20–30 V. Údaje s centroidom všetkých vzoriek sa získali od 50 do 1200 Da, s 5-časom skenovania 0,5 s počas doby analýzy 10 minút . LockSpray TM sa použil na overenie presnosti hmotnosti. [M–H]− ión leucín enkefalínu (prietok infúzie 200 pg·μL−1 10 μL min−1) pri m/z 554,2615 sa použil ako záchytná hmota. Na presnú hmotnosť, zloženie prekurzorových iónov a výpočet fragmentových iónov sa použil softvér MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA).
Analýza údajov na platforme Masslynx
Okrem toho bola na základe literatúry vytvorená interná knižnica obsahujúca názov zlúčeniny, jej štruktúru a molekulový vzorec (v mol.). Všetky zlúčeniny boli zaznamenané v špeciálnej šablóne, vyrobenej v Exceli. Okrem toho boli na lokálnom počítači uložené aj súbory mol (ChemDraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) a súbory Excel všetkých jednotlivých štruktúr zlúčenín. Vytvorili ste hárok programu Excel s dôležitými údajmi priamo importovanými do vedeckej knižnice v UNIFI.
UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Veľká Británia bola použitá na vyhodnotenie štrukturálnych charakteristík, najmä pre charakteristické fragmenty a MS fragmentáciu. Pre detekciu 2D vrcholu bola nastavená minimálna oblasť píku 500. Počas odhaľovania 3D vrcholov bola zvolená nízka energetická vrcholová intenzita viac ako 300 impulzov a zvýšená energetická vrcholová intenzita viac ako 80 impulzov. Zistilo sa, že chyba hmotnosti je až ± 10 ppm pre známe zlúčeniny a tolerancia retenčného času bola nastavená v rozsahu ± 0,1 min. Vybrali sme negatívne adukty obsahujúce –H plus HCOOH. Spracovanie nespracovaných údajov získaných z MS sa uskutočňovalo pomocou efektívneho softvéru UNIFI, aby sa rýchlo určili chemické zložky, ktoré spĺňali štandardy, pomocou vlastnej databázy a vlastnej knižnice tradičnej medicíny.
Ďalej, aby sa overila chemická štruktúra každej cieľovej zlúčeniny, izoméry sa rozlíšili podľa ich charakteristických MS fragmentačných vzorov, ktoré boli odhalené v uvedených štúdiách, a porovnaním retenčných časov referenčných štandardov.
Metabolomická analýza založená na viacrozmernej štatistickej analýze
Pred spracovaním nespracovaných údajov sa nastavili parametre, ako napríklad hmotnosť v rozsahu od 150 do 1200 Da, rozsah retenčného času (0 až 20 minút), prahová intenzita ( 2000 impulzov), tolerancia hmotnosti, tj 5 mDa, pričom hmotnostné a retenčné časové okno bolo 0,20 min a 0,05 Da, v danom poradí. V nasledujúcom zozname databázy boli identifikátorom iónov páry RT-m/z týkajúce sa ich elučných časov. Rovnaké hodnoty pre RT a m/z v rôznych dávkach vzoriek sa považovali za rovnakú zlúčeninu.
Multivariate statistical analysis was conducted to evaluate effective biomarkers that considerably contributed to variations among different groups. During the analysis, principal component analysis (PCA) was employed to indicate the maximum differences and pattern recognition for obtaining an overview and classification. The OPLS-DA is a modeling tool that provides visualization of the OPLS-DA predictive component loading to assist model evaluation. Variable importance for the projection (VIP) was used for assessing the evaluation of various components, and the metabolites with VIP values>1.{1}} a P-hodnota<0.05 were regarded as effective markers. Furthermore, a permutation test was conducted for providing reference distributions for the R2/Q2 values that could show statistical significance.
Pokusy na zvieratách
Potkany boli náhodne rozdelené do štyroch skupín (n{0}} pre každú skupinu), po ktorých nasledovalo orálne podávanie rôznych extraktov: (1) Slepá kontrolná skupina: potkanom sa podával normálny fyziologický roztok (2 ml/100 g); (2) CD skupina: potkanom bol podaný CD extrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP skupina: potkanom bol podaný CD-NP extrakt (2 ml/100 g); (4) Skupina CD-HP: potkanom sa podal extrakt CD-HP (2 ml/100 g). Ďalšia kategorizácia všetkých skupín sa uskutočnila do troch podskupín pre plazmu, moč a výkaly. O dve hodiny neskôr sa každému potkanovi orálne podalo rovnaké a rovnaké množstvo extraktov.
Po podaní sa odber vzoriek krvi uskutočnil o 1.0 h, 2.0 h a 4.0 h do heparinizovaných 1,5 ml polyetylénových skúmaviek (z orbitálnych žíl) nasledovala centrifugácia (pri 4500 ot./min.) všetkých vzoriek počas 15 minút.
Pre vzorky moču a výkalov sa potkany držali v metabolických klietkach a potom sa 24 hodín po podaní uskutočňoval odber vzoriek moču a výkalov. Odstreďovanie vzoriek moču sa uskutočňovalo pri 45 00 otáčkach za minútu počas 15 minút, zatiaľ čo vzorky výkalov sa sušili v tieni a rozomleli na prášok, potom sa odobralo 0,2 g a pridalo sa do 0,5 ml soľným roztokom, ultrazvukom počas 5 minút a centrifugáciou pri 12,000 otáčkach za minútu počas 15 minút. Všetky biologické vzorky sa až do analýzy udržiavali pri -80 stupňoch.
Príprava biologických vzoriek
Pridanie vzoriek plazmy, moču a výkalov sa uskutočnilo s 3 objemami metanolu, po čom nasledovalo vírenie počas 3 minút. Potom sa uskutočnila centrifugácia (pri 12, 000 rpm) zmesí počas 10 minút, nasledovalo prenesenie supernatantu do EP skúmavky a potom sušenie dusíkom pri 37 stupňoch. Ďalej sa uskutočnilo pridanie 200 ul roztoku HCN-H2O (50 percent). Potom sa vír použil na miešanie (1 min.), po čom nasledovalo odstreďovanie (pri 12, 000 otáčkach za minútu) počas 5 min. Supernatant (5 ul) ošetrených vzoriek sa vstrekol do systému UPLC-Q-TOF-MSE.
Podmienky kvapalinovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie
Analýza metabolitov sa tiež uskutočnila pomocou prístroja Waters UPLC cez rozhranie ESI. Separácie sa uskutočnili pomocou kolóny Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), mobilná fáza bola 0,1 % kyselina mravčia (A): Acetonitril (B), podmienky gradientovej elúcie boli 0–3 minúty (99,8 percent →98 percent A), 3–5 minút (98 percent →95 percent A), 5–8 minút (95 percent →90 percent A), 8 –12 minút (90 percent →85 percent A), 12–17 minút (85 percent →70 percent A), 17–22 minút (70 percent →60 percent A), 22–23 minút (60 percent →58 percent A) , 23–25 minút (58 percent A), 25–32 minút (58 percent →45 percent A) a 32–37 minút (45 percent →35 percent A), prietok 0,4 ml min−1. Teplota kolóny a vzorkovacej miestnosti bola nastavená na 40 stupňov a 8 stupňov. Boli použité vyššie uvedené podmienky hmotnostnej spektrometrie.
Stratégia systematickej analýzy metabolitov v biologických vzorkách
Na spracovanie údajov bol použitý softvér UNIFI (1.8.2). Na identifikáciu účinných metabolitov bola použitá funkcia Binary Compare. Vyhodnotené metabolity neexistovali v ekvivalentnej kontrolnej vzorke alebo existovali s nízkou intenzitou iónov. Prah relatívnej intenzity bol nastavený na 3 alebo 5 a mohli sa vyhodnotiť metabolity, ktoré spĺňali podčiarknuté kritériá. Bežné a predvídateľné metabolity sa potom určili pomocou EIC. Na vyhľadávanie dvojfázových metabolitov bola použitá funkcia NLF. Napríklad v softvéri UNIFI je možné nastaviť parametre na 176,0321 na vyhľadávanie možných konjugátov kyseliny glukurónovej. Po spracovaní môže byť v metóde nastavená alebo identifikovaná neutrálna strata. MassFragment sa použil na určenie alebo charakterizáciu štruktúr detegovaných metabolitov, spektrálna interpretačná funkcia UNIFI je hlavnou funkciou používanou na analýzu sekundárnej fragmentácie rodičovských komponentov. Táto funkcia môže byť použitá na rýchle overenie cesty fragmentácie primerane.
Viac informácií: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
