Cirkulujúce miRNA u diabetikov typu 2 s albuminúriou a bez nej v Malajzii

AbstraktnéÚvod: Diabetické ochorenie obličiek(DKD) zostáva hlavnou príčinou chronického ochorenia obličiek. Bola hlásená dysregulácia cirkulujúcich miRNA, čo naznačuje ich patologické úlohy v DKD. Cieľom tejto štúdie bolo skúmať rozdielne exprimované miRNA v sére pacientov s diabetes mellitus 2. typu (T2DM) s albuminúriou a bez nej vo vybranej malajzijskej populácii.metóda:Štyridsaťjeden pacientov s T2DM pri sledovaní na komunitnej klinike bolo rozdelených do skupín s normálnou (NA), mikro-(MIC) a makroalbuminúriou (MAC). Diferenciálne hladiny miRNA v 12 vzorkách sa určili pomocou poľa miScript miRNA qPCR so zameraním na dráhu (ľudská fibróza) a validovali sa v 33 vzorkách pomocou vlastného poľa miScript qPCR (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko).Výsledky:Trendy upregulácie 3 miRNA v sére, konkrétne miR-874-3p, miR-101-3p a miR-145-5p pacientov s T2DM s MAC v porovnaní s pacientmi s NA. Štatisticky významné zvýšenie miR- 874-3p (p= 0.04) a miR-101-3p (p= 0.01) bola zistená vo validačnej kohorte. Významné negatívne korelácie medzi odhadovanou rýchlosťou glomerulárnej filtrácie (eGFR) a miR-874-3p (p= 0.05), miR-101-3p (p= 0.03) a miR-145-5p (p= 0.05), ako aj pozitívnu koreláciu medzi miR-874-3p a vekom (p= 0.03) boli zobrazené pomocou Pearsonovej analýzy korelačných koeficientov.Záver:V tejto štúdii sa zistila zvýšená regulácia predtým známej miRNA, konkrétne miR{0}}p, a možno aj nových, konkrétne miR-874-3p a miR-101-3p v sére pacientov s T2DM . Medzi eGFR a týmito miRNA bola významná korelácia. Zistenia tejto štúdie poskytli povzbudivé dôkazy na ďalšie skúmanie domnelých úloh týchto rozdielne exprimovaných miRNA vDKD.

Click to cistanche herba pre ochorenie obličiek

Úvod

Diabetické ochorenie obličiek (DKD) predstavuje 39 % výskytu terminálneho štádia ochorenia obličiek v USA [1]. Podobne DKD je aj naďalej hlavnou príčinou chronického ochorenia obličiek (CKD) v Malajzii a v roku 2018 prispieva k 69 % nových dialyzovaných pacientov [2]. Predpokladá sa, že patológia DKD je spôsobená najmä hyperglykémiou, ktorá vedie k aktivácii intracelulárnych signálnych dráh a nakoniec k renálnej fibróze [3]. Napriek pokrokom v manažmente súčasné biomarkery a terapie nedokážu zabrániť jej progresii do konečného štádia renálneho ochorenia [3]. Preto je naliehavo potrebné lepšie pochopenie mediátorov a mechanizmov DKD.

Mikroribonukleová kyselina (miRNA) je rodina malých nekódujúcich RNA, ktorá sa ukázala ako dôležité post-transkripčné regulátory génovej expresie [4]. Pozorovala sa abnormálna expresia miRNA a ich zapojenie do bunkového mechanizmu DKD [3]. Cieľom tejto štúdie bolo identifikovať vzor expresie vybraných miRNA v sére pacientov s diabetes mellitus 2. typu (T2DM) s albuminúriou a bez nej. Na celom svete sa podobné štúdie uskutočnili v rôznych populáciách, ako už bolo uvedené [5–7]. Zamerali sme sa na skúmanie vzoru diferenciálnej expresie výberu miRNA, ktoré sú spojené s fibrotickými dráhami u pacientov s T2DM, z ktorých niektoré boli predtým študované v DKD. Predchádzajúce štúdie naznačili etnické rozdiely v expresii miRNA [8, 9]. Okrem toho, že táto štúdia dokáže potvrdiť predchádzajúce zistenia, môže potenciálne odhaliť nové miRNA, možno jedinečne vyjadrené v malajzijskej populácii.

Materiály a metódy

Študijná populácia

Táto prierezová štúdia zahŕňala 41 existujúcich pacientov s T2DM, ktorí boli sledovaní na komunitnej klinike od januára do apríla 2019. Táto štúdia zahŕňala 2-krokový postup: (1) miRNA v sére 12 pacientov (skríningová kohorta ) boli profilované a (2) najrelevantnejšie miRNA boli validované so sérami od 33 pacientov (označovaných ako validačná kohorta). To zahŕňalo 4 pacientov zo skríningovej kohorty. Od jednotlivých pacientov sa získal písomný súhlas. Etický súhlas pre túto štúdiu získal Výbor pre lekársky výskum a etiku (MREC), Ministerstvo zdravotníctva Malajzie. Kritériá zaradenia boli pacienti s T2DM a dostupné klinické a laboratórne informácie. Pacienti s DM 1. typu; iné ako DKD; komorbidity, ako je rakovina, akútne horúčkovité ochorenie alebo nedávne infekcie; tehotenstvo; a popôrodné boli vylúčené.

Zo zdravotných záznamov pacienta sa získali nasledujúce informácie: (1) demografické údaje vrátane veku a pohlavia; (2) klinické údaje, ako je krvný tlak, hmotnosť, trvanie T2DM, liečba a iné diabetické komplikácie; (3) laboratórne údaje vrátane plazmatickej glukózy nalačno, glykovaného hemoglobínu A1c (HbA1c), pomeru albumínu ku kreatinínu a sérového kreatinínu. Pacienti boli rozdelení do 3 skupín podľa úrovne albuminúrie, normoalbuminúrie (NA), mikroalbuminúrie (MIC) a makroalbuminúrie (MAC).

Definícia

V tejto štúdii,

NA, MIC a MAC boli definované ako pomer albumínu ku kreatinínu<30, between 30 and 300 and >300 mg/g kreatinínu v najmenej 2 z 3 bodových odberov moču [10]. Odhadovaná rýchlosť glomerulárnej filtrácie (eGFR) bola vypočítaná na základe kreatinínovej rovnice chronického ochorenia obličiek-epidemiológie.

Príprava séra

Vacutainer Odobraté vzorky plnej krvi nalačno (menej alebo rovné 8 h) v 10-ml skúmavkách BD ®SSTTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) sa nechali pri izbovej teplote 30-min. zrážanie pred 10- min centrifugáciou pri 1,90}0 g. Horná fáza sa zozbierala, prefiltrovala s 0,0{7}}μm Minisart®PES filtrom (Sartorius, Gottingen, Nemecko) a alikvotne sa rozdelila do mikrocentrifugačných skúmaviek na uskladnenie pri -80 stupňoch až do analýzy.

Celková miRNA

Izolácia Celková miRNA sa izolovala pomocou súpravy miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen GmbH) podľa protokolu výrobcu. Stručne povedané, činidlo Qiazol Lysis Reagent sa pridalo do alikvotnej časti 200 μl séra na denaturáciu, po čom nasledovala kontrola miRNeasy séra/plazmy s spike-In C. elegans miR-39 miRNA mimic (Qiagen GmbH) na monitorovanie obnovy RNA a zvrátenie účinnosť transkripcie. Na oddelenie fáz sa pridal chloroform a potom sa do hornej vodnej fázy pridal 100 % etanol. Kroky preplachovania sa dosiahli pomocou pufra RWT, pufra RPE a 80 % etanolu. RNA sa eluovala pridaním 14 ul vody bez RNázy na membránu rotačnej kolóny RNeasy MinElute. Množstvo a kvalita RNA boli stanovené spektrofotometrom NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA) pred skladovaním pri -80 stupňoch až do použitia. Reverzná transkripcia (RT) miRNA na cDNA a predamplifikácia sa uskutočnili pomocou súpravy miScript RTII (Qiagen GmbH) a súpravy miScript PreAMP PCR (Qiagen GmbH), v tomto poradí, podľa protokolu výrobcu s použitím 6 μl templátovej RNA a 5 μl zriedenej cDNA, resp

Kvantitatívna analýza polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase

Cirkulujúce miRNA v sére skríningovej kohorty boli identifikované pomocou poľa miScript miRNA qPCR (Qiagen GmbH) zameraného na dráhu (Qiagen GmbH) a vybrané miRNA boli neskôr validované vo validačnej kohorte pomocou vlastného poľa miScript miRNA qPCR (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) podľa pokynov výrobcu. Každá reakcia zahŕňala templát cDNA, 2x Master Mix QuantiTect SYBR Green PCR, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay a vodu bez RNázy a zriedenú templátovú cDNA na celkový objem 25 μl. Kvantitatívna PCR v reálnom čase sa uskutočnila na Eppendorf Mastercycler ep realplex 4, ktorý bol naprogramovaný nasledovne: 15 minút pri 95 stupňoch, 15 s pri 94 stupňoch, 30 s pri 55 stupňoch a 30 s pri 70 stupňoch so 40 cyklami.

Relatívna kvantifikácia miRNA

Analýza dát PCR v reálnom čase sa uskutočnila pomocou softvéru Qiagen Gene Globe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Relatívna expresia (RE) bola odvodená metódou 2−∆Ct, pričom expresia každej miRNA bola normalizovaná na expresiu housekeeping génu SNORD95 alebo globálneho Ct Mean. Zmena násobku sa vypočítala z normalizovanej expresie miRNA v každej skupine (MIC alebo MAC) vydelenej normalizovanou expresiou miRNA v kontrolnej skupine (NA). Hodnoty p boli vypočítané na základe nezávislého t-testu vzoriek opakovaných hodnôt RE (2−∆Ct) pre každý gén v kontrolnej skupine a testovaných skupinách. Ďalšie overenie analýzy údajov qPCR sa uskutočnilo manuálne pomocou programu Microsoft Excel a IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp, Ar monk, NY, USA) vydanie 25 pre softvér Microsoft Windows.

Výber miRNA v skríningovej kohorte na validáciu

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 bola považovaná za negatívnu expresiu, ako to odporúča centrum Qiagen GeneGlobe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Online doplnková tabuľka 1 (všetok online doplnkový materiál nájdete na www.karger.com/doi/10.1159/000518866) ukazuje RE 84 miRNA v skríningovej kohorte normalizované na globálny priemer Ct. MiRNA s významnými ±2{7}}násobnými zmenami a dobrej kvality boli vybrané na validáciu, ako je definované softvérom. Okrem toho boli vybrané ďalšie miRNA na základe poradia ich hodnôt p a ich zapojenia do predchádzajúcich štúdií v dráhach súvisiacich s DKD a DKD, pričom boli vybrané miRNA s najvyšším počtom predpokladaných cieľov messengerovej RNA. Online doplnková tabuľka 2 ukazuje ďalšie kritériá použité na výber miRNA na validáciu. Vo validačnej analýze sa expresia miRNA normalizovala na SNORD95, pretože metóda globálneho priemeru Ct nebola vhodná a Ct > 35 sa považovala za negatívnu expresiu. Na štandardizáciu sme znovu analyzovali RE vybranej miRNA v skríningovej kohorte na základe normalizácie SNORD95 a to sa použilo na následnú analýzu v porovnaní s validačnou kohortou.

Štatistická analýza

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >2 nezávislé skupiny sa uskutočnili použitím nezávislého vzorky Kruskal-Wallisovho testu (tabuľka 1). Porovnanie kategoriálnych premenných bolo vykonané buď pomocou χ2 testu kontingencií alebo Fisherovho exaktného testu (tabuľka 1). Korelácia medzi vybranými miRNA RE a spojitými premennými (demografickými a klinickými údajmi) bola vykonaná pomocou Pearsonovho korelačného koeficientu. Na analýzu lineárneho vzťahu medzi vybranou miRNA RE a jej významnými prediktormi bol použitý viacnásobný regresný test. Štatistické výpočty sa robili pomocou IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp) release 25 pre Microsoft Windows a štatistického softvérového balíka Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, USA). Štatistická významnosť bola definovaná ako p < 0,05.

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK