Účinky Cistanche na apoptózu dopaminergných neurónov indukovaných neurotoxínom 1-metyl-4 -fenylpyridínium (MPP)
Mar 10, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Tian Jiyu, Chen Jianzong
(Centrum pre výskum tradičnej čínskej medicíny a čínskej Materia Medica v nemocnici Xijing, FMMU, Xi'an 710032)
Abstraktné
Cieľ: Na skúmanie účinkovCistanche na primárnej kultúre dopaminergných neurónov apoptóza buniek indukovaná 1-metyl-4-fenylpyridíniom (MPP plus ). Metóda: Na prípravu králičieho séra zloženého zCistanchevyužíva metódu sérovej farmakológie. Potom otestujte účinky Cistanche na apoptóznu bunku DA neurónov zMPP plusindukované modely pomocou morfologickej, prietokovej cytometrie, farbenia TUNEL.Výsledok: Ošetrenie 200 μmol/lMPP pluspočas 24 hodín alebo dlhšie indukovali apoptózu v DA neurónoch. PoMPP plusliečených, pomer apoptózy skupiny obsahujúcej ekvivalentnú dávku séra Cistanche je 6,3 percenta, skupinaMPP plusliečených samostatne je 30,2 percenta. Počet apoptóznych buniek v skupine B a C je výrazne nižší ako v skupine E (P<0.05).>Záver: Obsiahnuté sérumCistanchechránené apoptózové DA neuróny indukovanéMPP plus.
Kľúčové slová: Cistanche;1-metyl-4-fenylpyridínium(MPP plus); dopaminergné neuróny; apoptóza
V súčasnosti je hlavnou terapiou preParkinsonova chorobaje substitučná liečba prípravkami zloženej levodopy (L-dopa), ktorá nemôže kontrolovať vývoj ochorenia. S progresiou ochorenia sa zvyšuje dávkovanie a vo všeobecnosti v priebehu 3 až 5 rokov klesá liečebný účinok, kolísajú motorické symptómy a objavujú sa dyskinézy vyvolané liekmi. Nedávne štúdie zistili, že L-dopa má účinok na indukciu apoptózy na neurónoch kultivovaných in vitro[1, 2] a potom sa navrhlo, že neurotoxický účinok endogénneho dopamínu vedie k strate dopaminergných neurónov vParkinsonova choroba. Jeden z dôvodov [3]. V dlhodobej klinickej praxi sme čínsku medicínu využívali naprvyživuje pečeň a obličkyv kombinácii s levodopou na liečbu PD a dosiahli dobré výsledky [4-6]. Tento experiment skúmal ochranný účinok tradičnej čínskej medicíny na apoptózu dopaminergných neurónov a jej mechanizmus z molekulárnej a bunkovej úrovne.
1. Materiály a metódy
1.1 Materiály
médium DMEM,1-metyl-4-fenylpyridínium, MPP plusfetálne bovinné sérum zakúpené od spoločnosti Gibco.Cytarabín, poly-l-lyzín, PLLboli zakúpené od spoločnosti Sigma. 24-jamková kultivačná platňa, 25 cm2
Plastové kultivačné bankyboli zakúpené od spoločnosti NUNC.Čínska medicínasme boli použité bol zakúpený od Xi'an Decoction Piece Factory. Zvieratká, na ktoré sme boli zvyknutí, poskytuje školské zvieracie centrum.https://www.xjcistanche.com/products
1.2 Príprava a experimentálne zoskupenie liečivého séra
Cistanche sa pripravuje ako lyofilizovaný prášok na konzerváciu a pri použití sa zriedi destilovanou vodou. Zvieracie sérum bolo pripravené z novozélandského bieleho králikasérum, z ktorých všetci boli zdraví muži s hmotnosťou 2.{1}}.0 kg. Ekvivalentná dávka zvierat sa prepočíta podľa plochy povrchu tela a náhodne sa rozdelí na sérum slepej kontrolnej skupiny; 1/2 ekvivalentnej dávky skupinového séra (dávka surového liečivého materiálu Cistanche sondou 0,8 g/kg); skupina ekvivalentnej dávkysérum(dávka sondou je originálny liečivý materiál Cistanche cistanche 1,6 g/kg); 2-násobok ekvivalentnej dávkysérum(dávka sondou je originálny liečivý materiál Cistanche 3,2 g/kg). Vykonajte sondu dvakrát denne celkovo 3 dni, 1 hodinu po poslednej sonde, prekrvenie karotídy, cez noc pri 4 stupňoch, centrifugáciu pri 2500 ot./min. počas 25 minút, starostlivé oddelenie séra, inaktiváciu pri 56 stupňa počas 30 minút a odsatím cez 0,22 μm filtračnú membránu Odfiltrujte baktérie a uskladnite pri -20 stupňoch . Za rovnakých podmienok sa pripravilo slepé králičie kontrolné sérum žalúdočnou sondou s rovnakým objemom normálneho fyziologického roztoku. Experiment bol rozdelený do 5 skupín. Skupina A bola slepý králiksérumkontrolná skupina kultúry; Skupina B bola asérová kultúra plus MPPliečená skupina obsahujúca 2-násobok ekvivalentnej dávky; Skupina C bola asérová kultúra plus MPPliečená skupina obsahujúca ekvivalentnú dávku; Skupina D bola kontrolná skupina sérovej kultúry obsahujúca 1/2 ekvivalentnej dávky sérovej kultúry plus skupina ošetrená MPP; Skupina E je prázdna králičia sérová kultúra plus skupina liečená MPP.
Cistanche prospech
1.3 Kultivácia dopaminergných neurónov stredného mozgu
Vybrali sa tri SD potkany 14-dňovej gravidity a usmrtili sa priamou injekciou vzduchovej embólie do srdca; embryonálne potkany boli vybraté za aseptických podmienok a umiestnené do Petriho misky naplnenej ľadovým D-Hanksovým roztokom. Mozgové tkanivo potkanieho plodu bolo vypreparované a oddelené pod stereomikroskopom. Referenčná metóda [7] bola mierne vylepšená. Meningy a cievne tkanivo boli odlúpnuté a tkanivá v oblastiach A8, A9 a A10 ventrálneho stredného mozgu boli oddelené. Pridajte 1 ml 0,125 percentného pankreatínu a umiestnite ho do 37 stupňového inkubátora na približne 20 minút, pridajte vhodné množstvo kultivačného média obsahujúceho 10 percent fetálneho hovädzieho séra na ukončenie trávenia a použite odsávanie.
Skúmavku napipetujte do homogénnej bunkovej suspenzie, odstreďujte pri 1500r/min 5 minút pri izbovej teplote, opatrne odstráňte supernatant, prepipetujte 15-krát tenkou pipetou a nechajte 5 minút odstáť. Do 24-jamkovej kultivačnej platne lyzínu pridajte kultivačné médium do každej jamky, aby ste upravili hustotu buniek na 2 × 105 buniek/ml, pridajte kultivačné médium na 0,5 ml na jamku a po 3 dňoch kultivácie pridajte cytarabín ( konečná koncentrácia je 10 μmol/l), inhibujú rast iných ako neurónov.
1.4 Imunocytochemické farbenie tyrozínhydroxylázou (TH).
Pomocou metódy SABC obsahuje riedidlo protilátok hovädzí sérový albumín 1g/100ml (Boster Company, Wuhan), 0,3 percenta Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ 100 ml, zriedený PBS na 100 ml, pH sa upraví na 7,6. Kultivácia bola ukončená na 7. deň, 3-krát premytá D-PBS počas 5 minút, čerstvo pripravený 4 percentný paraformaldehyd bol fixovaný pri teplote miestnosti počas 30 minút a premytý D-PBS počas 5 minút 3-krát; s roztokom peroxidu vodíka, metanolu a PBS v pomere 1:1:8 Inkubujte 30 minút pri izbovej teplote, 5 minút opláchnite D-PBS, pridajte 5 % blokujúce kozie sérum na 30 minút pri izbovej teplote, 5 minút opláchnite D-PBS minút a pridajte koziu anti-myšiu TH protilátku zriedenú protilátkovým riedidlom (1:1000 riedenie, Calbiochem)), cez noc pri 4 stupňoch, opláchnite D-PBS 3 minúty 3-krát, pridajte biotinylovaný myší anti-potkaní IgG zriedený protilátkou riedidlo (riedené 1:200, Sigma USA), pôsobiť pri izbovej teplote 4 hodiny, 3-krát opláchnuť D-PBS 3 minúty, pridať HRP komplex zriedený protilátkovým riedidlom na 2 h pri izbovej teplote a opláchnuť D-PBS 3 krát na 3 minúty. Oplachujte DAB riedidlo po dobu 3 minút, pridajte DAB chromogénne činidlo (Wuhan Boster Company) pripravené na použitie do buniek a pozorujte farbu pod inverzným mikroskopom.https://www.xjcistanche.com/
1.5 Zaobchádzanie s drogami
Morfologické pozorovania kultivovaných neurónov sa uskutočňovali každý deň pod mikroskopom s fázovým kontrastom a zmeny sa zaznamenávali fotografiami. Po kultivácii počas 12 hodín sa bunky pozorovali pod inverzným mikroskopom a tesne pred konfluenciou sa pridali liečivá. Obsah séra v každej skupine bol 10 percent. Po kultivácii počas 3 dní sa pridal MPP plus do konečnej koncentrácie 200 μmol/l. Po inkubácii v 37 stupňovom inkubátore s 5 percentami CO2 počas 24 hodín vykonajte rôzne kontroly.
Cistanche
1.6 Detekcia prietokovou cytometriou
Medikamentózna liečba bola rovnaká ako predtým. Po ošetrení každej skupiny sa adherentné bunky PC12 štiepili 0,125 percentným trypsínom a bunky sa odobrali približne 1 x 106 PBS. Bunky sa dvakrát premyli a pridalo sa 490 ul väzbového pufra a bunky sa dôkladne premiešali a pridalo sa 5 ul anexínu V. FITC a 10 μl rozpusteného PI v bunkovej suspenzii, jemne premiešajte, umiestnite skúmavku na 4 stupne, inkubujte 10 minút v tme a otestujte na prietokovom cytometri COULTER EPICS (Beckman Coulter, USA).
1.7 In situ end labeling (TUNEL) na detekciu bunkovej apoptózy
DNA in situ koncové značenie kultivovaných neurónov používa Bosterovu súpravu na detekciu apoptózy (MK1022) a kroky sú nasledovné: Vezmite dopaminergné neurónové bunky každej skupiny po ošetrení MPP plus (sklíčko pred primárnou kultiváciou je predkultivovaný ošetrením polymérom lyzínom), fixovaný 4{{30}}}g/l paraformaldehydu počas 1 hodiny, čerstvou 3% kyselinou octovou (pH 2,5) pri izbovej teplote počas 10 minút, neutralizuje alkalickú fosfatázu, pridajte 0,1 mol/l TBS (pH 7,5) 1:200 čerstvo zriedenú proteinázu K štiepenie pri 37 stupňoch počas 20 s, pridajte 1 μl TdT a DIG-d-UTP na každé sklíčko a 18 μl tlmivého roztoku na 2 hodiny pri 37 stupňoch; pridajte 50 μl blokovacieho roztoku na každé sklíčko pri izbovej teplote počas 30 minút; Pridajte 50 μl biotinylovanej anti-digoxigenínovej protilátky zriedenej blokovacím roztokom; reagovať 30 minút vo vlhkom boxe pri 37 stupňoch; pridajte 50 μl SABC-AP zriedeného 0,1 mol/l TBS na každé sklíčko; Do vzorky sa pridal BCIP/NBT (0,1 mol pH 9,5/l TBS zriedený 1:20), aby sa vyvinula farba počas 30 minút; súčasne sa použila alternatívna kontrola (namiesto zmesi TdT/biotín-dUTP sa použil tlmivý roztok TdT) na mikrofotografiu a mikroskop s invertovanou fázou (200×) Pozorujte apoptotické bunky. Spočítajte pozitívne bunky pod mikroskopom s fázovým kontrastom, spočítajte 5 polí na jamku v každej skupine, celkovo 6 jamiek.
2. Experimentálne výsledky
2.1 Morfologické pozorovanie kultivovaných neurónov
Pozorované mikroskopom OlympusIX70 s fázovým kontrastom: 5 hodín po inokulácii väčšina buniek priľne k stene, bunky sú rozptýlené, telo bunky je okrúhle, jadro je neviditeľné a index lomu je silný. Po kultivácii počas 24 hodín bunkové protuberancie rástli a postupne sa predlžovali. Po 48 hodinách väčšina buniek vyčnievala s rozvetvenými filamentóznymi výbežkami. Bunková morfológia bola rôznorodá, ktorá bola bipolárna, tripolárna a multipolárna a postupne vytvárala riedku sieť. Telo bunky bolo zväčšené, okrúhle a eliptické. Po poranení MPP plus bunky najprv napučiavali, index lomu sa zvýšil, bunky boli v degeneratívnom stave a bunky sa nakoniec zmenšili a odpadli. Rôzne dávky zloženého séra obsahujúceho čínsku medicínu majú ochranné účinky na poranenie MPP plus. Potom, čo bola kultúra zafarbená TH imunitnými bunkami, bolo vidieť, že TH-pozitívne bunky boli hnedé s vyrastaním neuritov. Po pridaní ekvivalentnej dávky séra tradičnej čínskej medicíny je podiel TH pozitívnyneurónymôže dosiahnuť 55 percent -60 percent .
2.2 Analýza výsledkov testu prietokovej cytometrie (pozri obrázok 1)
Fosfatidylserín (PS) umiestnený vo vnútri bunkovej membrány v ranom štádiu apoptózy migruje na vonkajšiu stranu bunkovej membrány. Proteín viažuci fosfatidyl V (Annexin V) je proteín viažuci fosfolipidy závislý od vápnika, ktorý má vysokú afinitu k PS. Anexín V sa preto môže použiť ako sonda na detekciu PS vystaveného na povrchu bunkovej membrány. Zároveň v kombinácii s vylučovacou metódou PI pre dvojnásobokfarbenieapoptotických buniek možno apoptotické bunky detegovať prietokovou cytometriou. V pravom dolnom kvadrante na obr. 1 (FITC plus /PI-) sú zobrazené podrobnosti o apoptóze každej skupiny. Podiel buniek, miera apoptózy každej skupiny boli 4,1 percenta, 5,8 percenta, 6,3 percenta, 28,6 percenta, 30,2 percenta.
2.3 Analýza výsledkov farbenia TUNEL
Tie s modrofialovými časticami v jadre sú pozitívne bunky, čiže apoptotické bunky. Podiel apoptotických buniek v každej skupine bol spočítaný pod svetelným mikroskopom. Počet apoptotických buniek na zorné pole v každej skupine bol: Skupina A 2,13±0,34; Skupina B 4,92±0,67; skupina C 6,20 ± 1,47; skupina D 10,33 ± 1,51; Skupina E 12,74 ± 2,51. Pot-test analýza,skupiny B a C sa porovnávali so skupinou E (P<0.05). the="">výsledkysú v podstate v súlade svýsledky prietokovej cytometrie.
3. Diskusia
Parkinsonova chorobapatrí v čínskej medicíne do kategórie „tremor syndrómu“. Tradičná čínska medicína verí, že nástup PD je väčšinou sériou prejavov postupného vyčerpania pečene a obličiek u starších ľudí a straty výživy meridiánu mozgovej drene. Hlavnou liečbou jevyživujú pečeň a obličky, upokojiť pečeň a odstrániť vetry. Tradičná čínska medicína môže hrať účel „zníženie toxicity a zvýšenie účinnosti“ pri liečbeParkinsonovu chorobu, ale v súčasnosti nie je veľmi jasný mechanizmus jeho účinku. Veľké množstvo experimentálnych dôkazov v modernej medicíne naznačuje, že oxidačný stres je jedným z faktorov, ktoré spôsobujú smrť nervových buniek PD [3]. Štúdie zistili, že celkové glykozidy cistanche môžu účinne odstraňovať rôzne reaktívne kyslíkové voľné radikály a chrániť DNA pred oxidáciou spôsobenou OH[8]. Tubulozid B extraktu cistanche môže zmierniť cytotoxicitu vyvolanúMPP plus,oslabujú akumuláciu reaktívnych foriem kyslíka v bunke a majú antagonistický účinok na apoptózu a oxidačný stres vyvolanýMPP plus[9]. Tradičná čínska medicína dokáže aktivovať a posilniť vlastnú ochrannú signálnu dráhu, odolávať vonkajšiemu poškodeniu a obnoviť jej rovnováhu. To je jedným z cieľov modernizácie tradičnej čínskej medicíny. Po substitučnej liečbe dopamínom ľudia vo všeobecnosti oceňujú neuroprotektívnu terapiu, ktorá sa nazýva druhá revolúcia v liečbeParkinsonova choroba. V tomto experimente boli izolované dopaminergné nervové bunky stredného mozgu kultivované s čínskou medicínou obsahujúcou sérum a zistilo sa, že Cistanche má určitý neuroprotektívny účinok. V tomto experimente sa použili dve detekčné metódy prietokovej cytometrie a farbenia TUNEL, aby sa súčasne zistilo, že sérum s ekvivalentnou dávkou a sérum s dvojnásobkom ekvivalentnej dávky sérovej kultúry medikovanej Cistanche môže znížiť primárnu kultiváciu dopamínového nervu stredného mozgu spôsobenéhoMPP plusPočet apoptotických buniek má určitý ochranný účinok na apoptotické bunky. Tradičná čínska medicína dokáže ochrániť dopamínergné neuróny pred poškodením v ranom štádiu, čo je dôležitejšie opatrenie ako iné terapie. V tomto zmysle je holistická liečba čínskej medicíny liekom na hlavnú príčinu a možno ju považovať za jednu z neuroprotektívnych liečebných postupov, ktoré si ľudia v súčasnosti cenia.
Referencie
1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, a kol. Levodopa indukuje apoptózu v kultivovaných neurónových bunkách - možný akcelerátor nigrostriatálnej degenerácie pri Parkinsonovej chorobe? Mov Disord, 1997, 12 (1): 17
2. Jenner PG, Brin MF. Neurotoxicita levodopy: experimentálne štúdie verzus klinický význam. Neurology, 1998, 50(6 Suppl 6): S39
3. Maruyama W, Naoi M. Bunková smrť pri Parkinsonovej chorobe. J Neurol, 2002, 249 (Suppl 2): II6
4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian a kol. Klinické pozorovanie liečby Parkinsonovej choroby s funkciou pečene a obličiek: správa o 60 prípadoch. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22 (3): 14
5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang atď. Klinické pozorovanie 40 prípadov Parkinsonovej choroby liečených metódou výživy pečene a obličiek. Výskum čínskej medicíny, 1998, 14 (3): 10
6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron a kol. Pingchan č. 1 perorálna tekutina pri liečbe 40 prípadov Parkinsonovej choroby. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9
7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Vysoký percentuálny výťažok buniek pozitívnych na tyrozínhydroxylázu z kultúry mezencefalických buniek potkana E14. Brain Res, 1992, 586 (2): 319
8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming a kol. In vitro zachytávanie voľných radikálov a ochranné účinky na poškodenie DNA indukované OH spôsobené celkovými glykozidmi cistanche. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36 (1): 29
9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubuloside B z Cistanche salsa Zachraňuje neurónové bunky PC12 pred apoptózou a oxidatívnou indukovanou 1-metyl-4-fenylpyridíniovým iónom. Stress.Planta Med,2002,68(11):966
