Cistanche Deserticola zmierňuje poškodenie nervových buniek hippocampus u potkanov Parkinsonovej choroby prostredníctvom regulácie KEAP1/NRF2/HO -1 ANTIOXIDANT CESTA

Abstrakt:

 

Cieľ preskúmať účinokCistanche Deserticola o poškodení nervových buniek pri Parkinsonovej chorobe (PD)potkany a jeho súvisiaci mechanizmus. Metódy Sprague-Dawley (SD) Samce potkanov boli náhodne rozdelené do troch skupín (1 0 v každej skupine): kontrolná skupina, modelka a skupina Cistache. Potkanom v modelovej skupine a liečenej skupine sa intraniálne injikovalo 6- hydroxydopamín (6- OHDA). Po potkanoch v skupine Cistache sa podávali 0,216 g/ ml roztoku Cistache, potkanmi v slepej skupine a skupine s modelovou skupinou dostali normálne zavlažovanie fyziologického roztoku, množstvo zavlažovania bolo 1 ml/ (100 g · d) počas dvoch týždňov. Morfológia a ultraštruktúra nervových buniek sa pozorovalo hematoxylín-eozínovými mikrofinancujúcimi bunkami a transmisiou transmisiou. Morfológia telies Nishi v regióne Hemimani bola pozorovaná Nishiovým zafarbením. Hladiny malondialdehydu (MDA) a superoxiddismutázy (SOD) sa detegovali metódou kyseliny tiobarbiturovej a metódou tetrazóliu nitroblu. Zmeny proteínu 1 súvisiaceho s echom 1 (KEAP 1), jadrového faktora E 2- Faktor 2 (NRF 2) a proteínov HEM cyklooxygenázy 1 (HO {-1) sa analyzovali pomocou Western blot. Výsledky Po liečbe liekov na púšť z Cistchetovho púšte sa zlepšila zbavená štruktúra hippocampálneho tkaniva PD potkanov, morfológia neurónov sa zlepšila, jadrová pyretóza sa postupne zvýšila. znížené. Expresia proteínu NRF2 a HO -1 sa zvýšila. Závery Cistanche Deserticola môže zlepšiť poškodenie neurónov Hippocampus a znížiť hladinu oxidačnej stresovej reakcie v hippocampe u potkanov PD. TenÚčinok púšte cistanchevLiečba PDpotkany úzko súvisia s nariadením KEAP -1 /nrf 2 /ho -1 signalizačnú dráhu.

 

 

 

Vysoko kvalitná cistanche na liečbu PD

 

Kľúčové slová: Cistanche Deserticola;Parkinsonova choroba; Oxidačný stres; hippocampus; neuróny; KEAP1; Nrf2; Ho -1

 

Podľa štatistík zo štúdie údajov o globálnych chorobách sa neurologické choroby stali hlavnou príčinou zdravotného postihnutia na celom svete. V tejto oblasti sa Parkinsonova choroba (PD) stala jednou z najrýchlejšie rastúcich chorôb so svojou významnou vekovou štandardizovanou prevalenciou, zvýšením prípadov zdravotného postihnutia a rastúcou mieru úmrtnosti. jeden.
Od roku 1990 do roku 2020 sa počet pacientov s PD na celom svete zvýšil o 118%, dosiahol 6,2 milióna a výskyt sa stále zvyšuje [1-2]. Pacienti s PD sa zvyčajne vyskytujú s motorickými symptómami, ako sú tras, stuhnutosť svalov, bradykinézia a ťažkosti s rovnováhou v neskorom štádiu. V počiatočnom štádiu choroby sa však môžu vyskytnúť nemotorické príznaky, ako je kognitívny pokles. Ako choroba postupuje, kognitívne poškodenie sa postupne zhoršuje a bude závažnejšie.

Vysoko kvalitná cistanche na liečbu PD

Ovplyvniť kvalitu života pacientov [3]. Hippocampus je dôležitou organizáciou v mozgu pre priestorové učenie a prijímanie externých informácií. Je to hlavná štruktúra realizácie ľudských kognitívnych funkcií. Hippocampálna dysfunkcia úzko súvisí s začiatkom kognitívnej dysfunkcie u pacientov s PD. Oxidačný stres sa podieľa na vývoji nervových buniek v hipokampálnom tkanive. Poškodenie [4-5]. Preto, ak sú hipokampálne neuróny chránené u pacientov s PD, môže to zlepšiť poznanie pacienta a oneskoriť progresiu choroby.
V posledných rokoch sa ukázalo, že pri liečbe neurologických chorôb súvisiacich s neurologickými chorobami súvisiacimi s neurologickými chorobami je účinné množstvo čínskych rastlinných liekov [6]. Cistanche Deserticola je tradičná čínska medicína, ktorá môže vyživovať obličky jang a doplniť podstatu a krv. Používa sa na liečbu neurologických chorôb, ako je ischemická mozgová príhoda a neuromyelitída [7]. Predchádzajúce štúdie výskumnej skupiny ukázali, že Cistache Deserticola môže zlepšiť správanie potkanov PD a znížiť apoptózu buniek nervových buniek dopamínu v oblasti substantia nigra [8-9]. Nie je však jasné, či Cistanche Deserticola môže zlepšiť poškodenie hipokampálneho tkaniva u potkanov modelu PD. Preto táto štúdia preukázala model PD potkanov na pozorovanie účinku Cistche Deserticola na poškodenie hipokampálneho tkaniva a preskúmanie jeho mechanizmu s cieľom poskytnúť nové nápady na liečbu PD.Tian Biological Company); Nissl Farbining Reagent (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isoflurane (biologická spoločnosť Shanghai Yaji).

 

1 materiály a metódy

1.1 Materiály

1.1.1 Experimentálne zvieratá

30 6- Týždenné SD samce potkanov vážiace 210-230 g sa použili. Experimentálne zvieracie centrum Fujianskej univerzity tradičnej čínskej medicíny poskytlo experimentálne zvieratá a všeobecné lekárske experimentálne zariadenia na životné prostredie pre zvieratá. Experiment bol schválený Výborom pre etiku zvierat tejto inštitúcie a registračné číslo etiky je 1N2023019.

1.1.2 Experimentálne činidlá
Cistanche Deserticola Granules (nemocnica tretieho ľudu v Fujian); 6- hydroxydopamín (6- OHDA) Reagent (Peking Biolabor Technology Co., Ltd.); Hematoxylín-eozín (HE) farbenie činidla (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Lyzát proteínu živočíšnych tkanív (Peking Solebao Biological Company); Inhibítory proteínovej fosfatázy (Wuhan Pujian Biological Company); Inhibítory proteázy (Hunan Yunbang Biotechnology Company); Proteín spojený s ECH-podobným Kelch -1 (KEAP1) Monoklonálna protilátka (Wuhan Sanying Biotechnology Company); Glyceraldehyd 3- fosfátová dehydrogenáza (GAPDH) monoklonálna protilátka (Wuhan Huamei Biological); Nukleárny faktor E2 Faktor 2 (Nrf2), heme oxygenáza 1 (hemoxygenas -1, Ho {{}}) monoklonálna protilátka (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); detekčné súpravy superoxidu dismutázy (SOD) a malondialdehyd (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Nissl Farbining Reagent (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Nástroje

JEA3001 Elektronická rovnováha (Shanghai Puchun Measuing Instrument Co., Ltd.); Elektronická rovnováha BSA224S (Sartorius, Nemecko); Stab S2T s nízkou teplotou Shaker (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Plne automatický krájač parafínu (Leica, Nemecko); Multifunkčná čítačka mikroplatín Pectramax I3X (Molecular Devices, USA); BX63
Fluorescenčný mikroskop (Olympus, Japonsko); DLAB Handheld Centrifuge D1008/D1008E (Peking Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); CryoCube F740HI Ultra nízka teplota chladničky (Epend, Nemecko); Minipro Epbasic Základná elektroforéza prístrojová energia (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); Rúna sušenia konštantnej teploty (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max Ductless Hood Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Metódy

1.2.1 Zriadenie modelu a zoskupovanie zvierat

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 kruhy, ktoré sa považovalo za úspešné modelovanie. Potom boli potkany v skupine Cistanche Deserticola každý deň gaveged s 0,216 g/ml roztoku púšte Cistache Deserticola a skupina slepých skupín a modelovej skupiny sa gavegovali normálnym soľným roztokom. Objem Gavage troch skupín potkanov bol 1 ml/(100 g · d) počas dvoch týždňov [9]. Po dokončení liečby každej skupiny potkanov sa potkany eutanizovali 2% izofluránovou inhalačnou anestéziou a mozgové tkanivá sa zbierali na následné experimentálne štúdie.

 

1.2.2 Pozorovanie patologických zmien v hipokampálnom tkanive farbením hematoxylín-eozín

 

Hippocampálne tkanivá potkanov v každej skupine sa zbierali, umiestnené v roztoku formaldehydu, dehydratované gradientovým etanolom, pečené v sušiacej peci, rozpustené vosky, sušené, devaskované, zafarbené HE, transparentifikované xylénom, zapečatené neutrálnou gumou a pozorované v mikroskope.

 

1.2.3 Pozorovanie elektrónovej mikroskopie prenosu ultraštruktúry buniek hipokampálnych nervov

Hippocampálne tkanivo bolo umiestnené do 3% glutaraldehyd fixatívu, dehydratované gradientovým etanolom, vložené (epoxidová živici) a boli pripravené rezy ultratínu. Na pozorovanie ultraštrukturálnych zmien hippocampálnych nervových buniek (pod transmisnou elektrónovou mikroskopiou) sa použilo farbenie olovo a uranylcetátu.

 

1.2.4 Nissl Farbining, aby sa pozorovalo zmeny telies NISSL v hippocampálnom tkanive

Vyššie uvedené rezy hipokampálneho tkaniva sa hydratovali v bezvodom etanole, 95% a 70% gradientovi etanolu. Po trikom premytí destilovanou vodou sa zafarbte s Nissl farbením roztoku počas 5 minút, potom premyjte dehydratovaným alkoholom s gradientom a destilovanou vodou a čistá s xylénom. Rezy boli utesnené neutrálnym lepidlom a pozorované a zaznamenané pod optickým mikroskopom po tuhnutí.

 

1.2.5 Chemická kolorimetrická metóda na detekciu obsahu MDA a SOD v hippocampálnom tkanive

Potom, čo boli hippocampálne tkanivá rôznych experimentálnych skupín homogenizované, sa centrifugovali pri 1 000 g počas 20 minút a zozbierala sa supernatant každej experimentálnej skupiny. Podľa pokynov súpravy sa na detekciu obsahu MDA a SOD v každej skupine experimentálnych vzoriek použili testovacie súpravy MDA a SOD.

 

1.2.6 Proteín Imunobloting na detekciu špecifickej expresie KEAP1, NRF 2 a HO -1 proteínov v hipokampálnom tkanive

Hippocampálne tkanivá každej skupiny sa pridali s lýzovým vyrovnávacom pamäť a odstredené pri 12, 000 r · min -1 počas 15 minút. Supernatant bol zozbieraný na pohotovostné použitie. Koncentrácia proteínu bola stanovená metódou BCA. Podľa výsledkov kvantifikácie proteínu sa pridal zodpovedajúci objem celkového proteínu a naplnil sa elektroforézou proteínového gélu. Vzorky boli denaturované pri 95 stupňoch počas 10 minút, prenesené do membrány, rezané a blokované v blokovacom roztoku počas 1 hodiny. Pridali sa zriedené primárne protilátky KEAP1, NRF 2, HO -1 a GAPDH (1: 500), reagovali cez noc pri 4 stupni, premyté 1 x TBST, inkubované so sekundárnymi protilátkami (1: 4000) a premyli sa znova 1 x TBST na farebné zobrazovanie.

 

1.3 Štatistická analýza

Údaje počítania boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. Údaje, ktoré boli v súlade s normálnou distribúciou a homogenitou rozptylu, boli podrobené t testu, údaje, ktoré boli v súlade s normálnou distribúciou a nerovnakým rozptylom, boli podrobené korigovanému t testu; Údaje, ktoré nezodpovedali normálnej distribúcii, boli podrobené neparametrickému testu. Jednosmerná ANOVA sa použila na porovnanie rozdielov medzi rôznymi skupinami a potom sa na porovnanie týchto dvoch skupín použila metóda LSD. P <0. 05 sa považoval za štatisticky významný.

 

2 výsledky

2.1 Vplyv cistchanovej púšte na morfologickú štruktúru hippocampálnej CA1 oblasti v PD modelových potkanoch, ktoré farbenie výsledkov, ukázali, že neuróny v oblasti CA1 v hippocampe hippocampu slepých skupín potkanov boli úhľadne usporiadané, s pravidelnou morfológiou a rovnomernou distribúciou a žiadne zjavné poškodenie neuronálnych buniek; Neuronálne bunky v modelovej skupine boli usporiadané viac neustále, bunkové jadrá boli zmenšené, prehĺbilo sa jadrové farbenie a poškodenie neuronálnych buniek bolo zrejmé; Neuronálne bunky v skupine Cistache Deserticola boli usporiadané pravidelnejšie ako bunky v modelovej skupine, počet jadrovej kondenzácie sa relatívne znížil a zmiernil sa poškodenie neuronálnych buniek. Výsledky sú znázornené na obrázku 1.

 

 

Obrázok 1 Vplyv cistanche Deserticola na patologickú štruktúru v oblasti CA1 hippocampu u Parkinsonovho potkana (HE, × 400) Poznámka: A: kontrolná skupina; B: Model Group; C: Cistanche Group. Čierne šípky označujú poškodené nervové bunky.

 

2.2 Vplyv Cistche Deserticola na ultraštruktúru hippocampálnych neurónov u potkanov PD modelu PD

Pri pozorovaní hipokampálnych neurónov je možné pozorovať, že bunková štruktúra zachováva čistú morfológiu, jadro predstavuje pravidelný okrúhly alebo oválny tvar, jadrová membrána zostáva hladká a neporušená a chromatín v jadre je rovnomerne distribuovaný a neexistuje žiadna agregácia jadrového chromatínu. Naopak, hippocampálne neuróny modelovej skupiny vykazovali zjavné zmeny: celková hustota elektrónov buniek sa zvýšila, jadro sa kondenzovalo, chromatín v jadre agregovanej a pripojenej k spodnej časti jadrovej membrány, zhrubnutá jadrová membrána sa pozorovala v cytoplazme. After intervention with Cistanche deserticola, compared with the model group, the hippocampal neurons of the Cistanche deserticola group showed a certain recovery trend: the size of the neuronal cell body was restored, the cell membrane remained intact, the edge aggregation of nuclear chromatin was alleviated to a certain extent, the thickening of the nuclear membrane was also alleviated, and the number of Vákuky v cytoplazme sa znížili, čo naznačuje, že Cistanche Deserticola má určitý ochranný alebo opravný účinok na nervové bunky. Pozri obrázok 2.

 

Obrázok 2 Vplyv Cistche Deserticola na neuronálnu ultraštruktúru v hippocampu Parkinsonových chorôb potkanov (× 7000) Poznámka: A: kontrolná skupina; B: Model Group; C: Cistanche Group.

 

2.3 Vplyv cistchanovej púšte na telá NISSL v hipokampálnych neurónoch modelových potkanov PD

Výsledky farbenia NISSL ukázali, že neuróny v slepej skupine boli úzko usporiadané s pravidelnou morfológiou, hojnými telesami NISSL a tmavým farbením; Neuróny v modelovej skupine boli voľne usporiadané, opuchnuté a väčšina Nissl telies sa rozpustila a ľahko zafarbila; Neuróny v skupine Cistche Deserticola boli úzko usporiadané s pravidelnou morfológiou a počet a farbenie telies NISSL sa zlepšili v porovnaní so skupinou modelu. Výsledky sú znázornené na obrázku 3.

 

Obrázok 3 Vplyv Cistche Deserticola na telo Nissl's Body of Hippocampal Nerve Bunks u Parkinsonovho ochorenia potkana (NISSL, × 200) Poznámka: A: kontrolná skupina; B: Model Group; C: Cistanche Group.

 

2.4 Účinky Cistche Deserticola na obsah SOD a MDA v hippocampus z Parkinsonových chorôb potkanov

 

V porovnaní s prázdnou skupinou sa obsah SOD v hippocampe modelovej skupiny znížil, zatiaľ čo obsah MDA sa zvýšil; V porovnaní so skupinou modelov sa obsah SOD v hippocampe skupiny Cistche Deserticola zvýšil, zatiaľ čo obsah MDA klesol. Pozri tabuľku 1.

 

Tab. 1 Účinky Cistche Deserticola na obsah SOD a MDA u hippocampu Parkinsonových potkanov chorôb

Zoskupenie	SOD (PG/ML)	MDA (pg/ml)
Ovládanie	12.36±2.75	2.85±0.83
Model	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Poznámka: V porovnaní s kontrolnou skupinou, *P<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Vplyv cistanche Deserticola na expresiu proteínov KEAP1, NRF2 a HO -1 u hippocampu potkanov Parkinsonovej choroby

Výsledky experimentov Western blot ukázali, že expresia proteínov Nrf2 a Ho -1 v hippocampe potkanov v modelovej skupine sa znížila, zatiaľ čo expresia proteínu Keap1 sa zvýšila; V porovnaní so skupinou modelu sa expresia proteínov Nrf2 a Ho -1 v hippocampe potkanov v skupine Cistache Deserticola zvýšila, zatiaľ čo expresia proteínu Keap1 sa znížila. Pozri obrázok 4 a tabuľka 2.

Obrázok 4 Vplyv cistanche Deserticola na expresiu KEAP1, NRF2 a HO -1 u hippocampu Parkinsonových potkanov chorôb

Poznámka: A: Control Group; B: Model Group; C: Cistanche Group

 

 

Tab. 2 Vplyv Cistche Deserticola na expresiu KEAP1, NRF2, HO -1 v hippocampu Parkinsonových potkanov choroby

 

Zoskupenie	Kelpovať	Nrf2	Ho -1
Slepá skupina	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Modelka	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Skupina pozitívnej skupiny	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Poznámka: V porovnaní s riadiacou skupinou, *p <{{0}}. 05; V porovnaní so skupinou modelu #P <0,05.