Polysacharid Cistanche Deserticola zoslabuje osteoklastogenézu a kostnú resorpciu prostredníctvom inhibície signalizácie RANKL a produkcie reaktívnych druhov kyslíka

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song a kol

Osteoporóza je metabolické ochorenie charakterizované osteopéniou a zhoršením mikroštruktúry kostí. Osteoklasty sú primárne efektorové bunky, ktoré degradujú kostnú matricu a ich abnormálna funkcia vedie k rozvoju osteoporózy. Akumulácia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) počas bunkového metabolizmu podporuje proliferáciu a diferenciáciu osteoklastov, a preto hrá dôležitú úlohu pri osteoporóze.Cistanchedeserticolapolysacharid(CDP) má protinádorovú, protizápalovú a antioxidačnú aktivitu. Vplyv CDP na osteoklasty je však nejasný. V tejto štúdii sa použili farbenie kyslou fosfatázou rezistentnou na vínan, imunofluorescencia, reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia a analýza Western blot, aby sa preukázalo, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibovala osteoklastogenézu a resorpciu hydroxyapatitu. Okrem toho CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)tiež inhiboval expresiu osteoklastových markerových génov vrátane Ctsk, Mmp9 a Acp5 a nemal žiadny vplyv na expresiu receptorového aktivátora jadrového faktora κB (RANK). Mechanické analýzy odhalili, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zvyšuje expresiu antioxidačných enzýmov na zoslabenie produkcie ROS sprostredkovanej RANKL v osteoklastoch a inhibuje jadrový faktor aktivovaných T buniek a aktiváciu mitogénom aktivovanej proteínkinázy. Tieto výsledky naznačujú, že CDP môže predstavovať kandidátsky liek na liečbu osteoporózy spôsobenej nadmernou aktivitou osteoklastov.

KĽÚČOVÉ SLOVÁkostná resorpcia,Cistanchedeserticolapolysacharid, MAPK, osteoklasty, reaktívne formy kyslíka

cistanche kulturistika

1|ÚVOD

Rovnováha medzi tvorbou kosti sprostredkovanou osteoblastmi a kostnou resorpciou sprostredkovanou osteoklastmi hrá zásadnú úlohu pri udržiavaní metabolickej homeostázy kostí (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Keď kostná resorpcia prevyšuje kostnú tvorbu, dochádza k osteoporóze, ktorá je charakterizovaná znížením kostnej hmoty a mikroštrukturálnym poškodením kosti (Ikeda, 2008). Osteoporóza je bežné ochorenie u starších jedincov a žien po menopauze a jej patogenéza nie je úplne objasnená (Cooper & Melton, 1992). Nedostatok estrogénu je primárnou príčinou osteoporózy (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Navyše, reaktívne formy kyslíka (ROS) môžu byť indukované receptorovým aktivátorom ligandu jadrového faktora κB (RANKL) a sú spojené s tvorbou osteoklastov (Yip et al., 2005), a tak môžu prispievať k rozvoju osteoporózy (Manolagas, 2010). Niektoré štúdie zistili, že nedostatok antioxidantu Nrf2 zvyšuje hladiny ROS a podporuje diferenciáciu osteoklastov indukovanú RANKL (Hyeon, Lee, Yang a Jeong, 2013). Zníženie produkcie ROS počas diferenciácie osteoklastov by sa preto malo hodnotiť ako terapeutická stratégia na liečbu osteoporózy.

Osteoklasty pochádzajú z monocytovej alebo makrofágovej hematopoetickej línie a sú jedinými viacjadrovými bunkami, ktoré vykonávajú kostnú resorpciu (Teitelbaum, 2000). Preto má výskum zahŕňajúci tvorbu osteoklastov veľký význam pri vývoji účinnej liečby chorôb kostného metabolizmu (Lorenzo, 2017). Faktor stimulujúci kolónie makrofágov (M‐CSF) a RANKL, produkované osteoblastmi a aktivovanými T bunkami, sú dôležité cytokíny, ktoré regulujú osteoklastogenézu (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL indukuje expresiu jadrového faktora aktivovaných T buniek (NFATc1), čo je kritický transkripčný faktor aktívny počas tvorby osteoklastov (Ishida et al., 2002). Aktivovaný NFATc1 podporuje expresiu génov osteoklastových markerov, ako je tartrát-rezistentná kyslá fosfatáza (TRAcP) a katepsín K (CTSK), ktoré regulujú osteoklastogenézu a funkciu osteoklastov (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysacharid(CDP) sa izoluje z dužinatých stoniekCistanchea má imunitnú reguláciu, protinádorové, proti starnutiu a ďalšie farmakologické účinky (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)mal inhibičný účinok na produkciu oxidu dusnatého (NO) indukovanú lipopolysacharidmi v myších mikrogliálnych bunkách (BV‐2 bunky; Nan et al., 2013). Okrem toho extrakt bohatý na fenyletanoid (ECD) zCistanchezlepšila schopnosť plávania myší znížením poškodenia svalov, oddialením akumulácie kyseliny mliečnej a zlepšením ukladania energie (Cai et al., 2010). Účinky CDP na funkciu a aktivitu osteoklastov však zostávajú neznáme.

V tejto štúdii sme preukázali, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibuje RANKL-indukovanú diferenciáciu osteoklastov a kostnú resorpciu. Základným mechanizmom bol CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zvyšuje expresiu antioxidačných enzýmov na zoslabenie produkcie ROS a potom potláča RANKL-aktivovaný NFAT a mitogénom aktivované proteínkinázy (MAPK)-signalizačné kaskády. Tieto výsledky naznačujú, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)sa môže použiť na liečbu osteoporózy spôsobenej nadmernou osteoklastickou kostnou resorpciou.

maca ženšen cistanche

2|MATERIÁLY A METÓDY

2,1|Materiály

CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)(čistota > 98 percent) bol zakúpený od Solarbio (Peking, Čína) a pripravený v zásobnej koncentrácii 1 mM vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Protilátky sú špecifické pre c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforylovaný (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK a ‐aktín boli získané od Santa Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Protilátky proti V-ATPáze d2 boli produkované tak, ako už bolo opísané (H. Feng et al., 2009). 3‐(4,5‐dimetyltiazol‐2‐yl)‐5‐(3‐karboxymetoxyfenyl)‐2‐(4‐sulfofenyl)‐2H‐tetrazolium (MTS) a luciferázový testovací systém boli získané od Promega (Sydney, Austrália) . Rekombinantný M-CSF bol zakúpený od R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinantný proteín GST-rRANKL bol exprimovaný a purifikovaný, ako už bolo opísané (Xu et al., 2000).

2,2|Bunková kultúra

Bunky RAW264.7 (myšie makrofágové bunky) sa získali z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a kultivovali sa v modifikovanom minimálnom esenciálnom médiu (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Austrália) doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom, 2 mM L-glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu (kompletné médium). Monocyty odvodené z kostnej drene (BMM) boli izolované zo 6 týždňov starých myší C57BL/6J, ktoré boli usmrtené podľa postupov schválených Výborom pre etiku zvierat na Univerzite Západnej Austrálie (RA/3/100/1244). Dlhé kosti boli vypreparované bez mäkkých tkanív a kostná dreň bola vymytá zo stehennej a holennej kosti, ktorá bola potom kultivovaná v kompletnom médiu v prítomnosti M-CSF (50 ng/ml).

2,3|Test osteoklastogenézy

BMM boli nanesené na 96-jamkové kultivačné platne v hustote 6 × 103 buniek na jamku a ošetrené kompletným médiom obsahujúcim M‐CSF (50 ng/ml) a GST‐rRANKL (100 ng/ml), v prítomnosti resp. absencia rôznych koncentrácií CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tri jadrá) boli identifikované ako osteoklasty.

2,4|Testy cytotoxicity

BMM sa naočkovali do 96-jamkových doštičiek v množstve 6 x 103 buniek na jamku a nechali sa cez noc priľnúť. Nasledujúci deň boli bunky inkubované s rôznymi koncentráciami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Po ďalších 48 hodinách sa pridal roztok MTS (20 ul/jamka) a inkuboval sa s bunkami počas 2 hodín. Absorbancia pri 490 nm sa stanovila pomocou čítačky mikrodoštičiek (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Imunofluorescenčné farbenie

BMM boli naočkované v hustote 6 x 103 buniek na jamku v prítomnosti M-CSF (50 ng/ml) cez noc. Bunky sa potom stimulovali M-CSF a GST-rRANKL (100 ng/ml), kým sa nevytvorili zrelé osteoklasty. Osteoklasty sa potom ošetrili rôznymi koncentráciami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)48 hodín pred fixáciou 4 percentami paraformaldehydu, permeabilizáciou s 0,1 percenta Triton X-100-PBS a blokovaním s 3 percentami hovädzieho sérového albumínu v PBS. Pripravené bunky sa inkubovali s rodamínom konjugovaným faloidínom počas 45 minút v tme, aby sa zafarbili na F-aktín. Bunky sa potom premyli PBS, jadrá sa kontrastne zafarbili 4',6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI) a pripevnili krycími sklíčkami na konfokálnu mikroskopiu.

cistanche skúsenosť

2,6|Skúška resorpcie hydroxyapatitu

Na meranie aktivity osteoklastov sa BMM (1 × 105 buniek na jamku) kultivované na šesťjamkových platniach potiahnutých kolagénom (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) stimulovali pomocou GST‐rRANKL (100 ng/ml) a M‐CSF (50 ng/ ml), kým sa nevytvoria zrelé osteoklasty (Zhou et al., 2016). Bunky sa potom jemne oddelili od platne pomocou roztoku na disociáciu buniek (Sigma-Aldrich) a rovnaký počet zrelých osteoklastov sa naočkoval do jednotlivých jamiek v 96-jamkových platniach potiahnutých hydroxyapatitom (Corning Osteoassay, Corning, NY). Zrelé osteoklasty sa inkubovali v médiu obsahujúcom GST‐rRANKL a M‐CSF s alebo bez CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)v uvedených koncentráciách. Po 48 hodinách sa polovica jamiek imunohistochemicky zafarbila na aktivitu TRAcP, ako je opísané vyššie, aby sa vyhodnotil počet viacjadrových buniek na jamku. Zostávajúce jamky boli bielené počas 10 minút, aby sa odstránili bunky a umožnilo sa meranie resorbovaných oblastí. Resorbované oblasti boli odfotografované pod štandardnou svetelnou mikroskopiou a softvér Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) bol použitý na kvantifikáciu percentuálnej plochy povrchu hydroxyapatitu resorbovaného osteoklastmi.

2,7|Luciferázové reportérové ​​testy

Na preskúmanie transkripčnej aktivácie NFATc1 boli bunky RAW264.7 stabilne transfekované luciferázovým reportérovým konštruktom reagujúcim na NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekované bunky sa kultivovali v 48-jamkových doštičkách v hustote 1,5 × 105 buniek na jamku a vopred sa ošetrili rôznymi koncentráciami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na 1 hod. Po predbežnom ošetrení sa bunky stimulovali GST-rRANKL (100 ng/ml) počas 24 hodín a luciferázová aktivita sa merala pomocou luciferázového reportérového testovacieho systému podľa protokolu výrobcu (Promega).

2,8|Kvantitatívna analýza reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR).

Celková RNA bola izolovaná z buniek s použitím činidla Trizol podľa protokolu výrobcu (Thermo Fisher Scientific). Komplementárna DNA bola syntetizovaná pomocou reverznej transkriptázy vírusu myšacej leukémie Moloney s 1 ug RNA templátu a oligo‐dT primérov. Amplifikácia špecifických sekvencií polymerázovou reťazovou reakciou sa uskutočnila s použitím nasledujúceho programu: 94 stupňov počas 5 minút, po ktorých nasledovalo 30 cyklov 94 stupňov počas 40 s, 60 stupňov počas 40 s a 72 stupňov počas 40 s a posledný krok predlžovania 5 minút pri 72 stupňoch. Podrobné informácie o špecifických priméroch sú uvedené v tabuľke 1. Relatívne hladiny mediátorovej RNA sa vypočítali normalizáciou na expresiu prevádzkového génu Hmbs.

2,9|Western blot analýza

BMM boli kultivované v kompletnom médiu s M-CSF v šesťjamkových doštičkách a stimulované GST-rRANKL (100 ng/ml) počas uvedených časov. Bunky sa lyzovali v rádioimunoprecipitačnom lyzovacom pufri a proteíny sa rozdelili elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli sodnom a preniesli sa na poly(vinylidénfluoridové) membrány (GE Healthcare, Silverwater, Austrália). Membrány boli blokované v 5 percentnom odstredenom mlieku na 1 hodinu a potom sondované rôznymi špecifickými primárnymi protilátkami za jemného pretrepávania cez noc pri 4 stupňoch. Membrány sa premyli a následne inkubovali so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s chrenovou peroxidázou. Reaktivita protilátok sa potom detegovala pomocou chemiluminiscenčného činidla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a vizualizovala sa pomocou Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2,10|Intracelulárna detekcia ROS

Intracelulárne hladiny ROS boli detegované pomocou 2′,7′‐dichlórfluoresceín diacetátu bunkovej testovacej súpravy na detekciu ROS (Abcam, Melbourne, Austrália). BMM (5 x 103 buniek na jamku) sa kultivovali v 96-jamkových doštičkách a ošetrili RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) a CDP počas 72 hodín. Intracelulárne hladiny ROS boli merané pomocou 2′,7′‐dichlórfluoresceín diacetátu, ktorý v prítomnosti ROS oxiduje na fluorescenčný DCF. Bunky sa premyli v Hankovom pufri a inkubovali sa v tme počas 30 minút s 10 uM DCFH-DA. Obrázky sa získali pomocou konfokálnej mikroskopie.

2.11|Štatistické analýzy

Všetky údaje sú reprezentatívne pre najmenej tri experimenty uskutočnené trojmo, pokiaľ nie je uvedené inak. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Na určenie významnosti rozdielov medzi výsledkami sa použila jednosmerná analýza rozptylu nasledovaná Student-Newman-Keulsovými post hoc testami, pričom p < 0,05="" sa="" považovalo="" za="">

3|VÝSLEDKY

3.1|CDP inhibuje RANKL-indukovanú osteoklastogenézu a fúziu osteoklastov

Ak chcete zistiť, či CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)môže potlačiť tvorbu osteoklastov indukovanú RANKL, najprv sme vykonali test osteoklastogenézy pomocou myších BMM (Liu a kol., 2013; Song a kol., 2016). BMM boli liečené RANKL a M‐CSF počas 5 dní so zvyšujúcimi sa koncentráciami CDP. CDP znížil počet TRAcP-pozitívnych viacjadrových buniek pri koncentrácii CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)dosiahli 5 uM alebo vyššie (obrázok la, b). Na vyhodnotenie CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)toxicitu a potvrdili, že tieto výsledky neboli odrazom bunkovej smrti alebo počtu, vykonali sme test MTS. BMM boli liečené RANKL a M-CSF počas 48 hodín s rôznymi dávkami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). CDP nemal žiadny vplyv na proliferáciu BMM pri koncentrácii 15 uM alebo nižšej (obrázok 1c).

Na testovanie účinkov CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)pri fúzii osteoklastov boli osteoklasty indukované liečbou RANKL a M-CSF, s rôznymi dávkami CDP alebo bez nich(Cistanchedeserticolapolysacharid). Osteoklasty boli zafarbené rodamín-faloidínom a DAPI, aby sa vyhodnotil počet jadier na osteoklast (obrázok 2a). Počet osteoklastov aj priemerný počet jadier na osteoklasty sa po CDP znížili(Cistanchedeserticolapolysacharid)ošetrenie (5–10 uM; obrázok 2b,c). Preto CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)mali inhibičné účinky na osteoklastogenézu indukovanú RANKL a fúziu osteoklastov spôsobom závislým od dávky.

3,2|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)tlmí RANKL-indukovanú osteoklastickú resorpčnú aktivitu hydroxyapatitu

Na detekciu účinku CDP sa uskutočnil test resorpcie hydroxyapatitu(Cistanchedeserticolapolysacharid)na funkciu osteoklastov (obrázok 3a). Po 24-hodinovej inkubácii sa počet osteoklastov na jamku nezmenil, zatiaľ čo plocha resorpcie hydroxyapatitu bola významne znížená ošetrením 5 a 10 uM CDP v porovnaní s kontrolnými skupinami (obrázok 3b, c). Tieto výsledky ukazujú, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)má silné inhibičné účinky na tvorbu osteoklastov aj resorpčnú aktivitu osteoklastov bez akýchkoľvek cytotoxických účinkov.

3,3|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibuje expresiu génu osteoklastového markera

Ďalej skúmať inhibičné účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na osteoklastogenézu a osteoklastickú kostnú resorpciu boli BMM liečené RANKL a M‐CSF počas 5 dní s rôznymi koncentráciami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Potom sa uskutočnila RT-PCR na detekciu expresie génov osteoklastových markerov. Expresia Nfatc1, kľúčového transkripčného faktora počas osteoklastogenézy, bola inhibovaná CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)spôsobom závislým od dávky (obrázok 4a). Okrem toho CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)(5 a 10 uM) downregulovali expresiu génov súvisiacich s kostnou resorpciou, vrátane Mmp9, Ctsk a Acp5 (obrázok 4b–d).

3,4|CDP potláča aktivitu NFATc1 a expresiu downstream proteínu

Preskúmať účinok CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na RANKL-indukovanú aktivitu NFATc1 sa uskutočnil luciferázový reportérový test. Liečba pomocou CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)pri koncentráciách 5 uM a vyšších významne inhiboval aktivitu NFATc1 indukovanú RANKL (obrázok 5a). Okrem toho analýza Western blot ukázala, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)významne potlačil proteínovú expresiu NFATc1 a c-Fos v BMM liečených RANKL a M-CSF počas 3 a 5 dní (obrázok 5b). Navyše expresia proteínov súvisiacich s funkciou osteoklastov, ako je V-ATPáza-d2 a CTSK, bola znížená v prítomnosti CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)v porovnaní s kontrolnými skupinami. CDP však nemal žiadny vplyv na expresiu RANK (obrázok 5b).

3,5|CDP podporuje expresiu antioxidačných enzýmov na odstránenie produkcie ROS počas osteoklastogenézy indukovanej RANKL

Na preskúmanie základného mechanizmu inhibície osteoklastogenézy závislej od CDP boli BMM liečené RANKL (100 ng/ml) a M‐CSF (50 ng/ml) spolu s PBS alebo CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)počas 72 hod. Skúmali sme účinok CDP na intracelulárnu produkciu ROS stimulovanú RANKL. Intracelulárne hladiny ROS sa zvýšili liečbou RANKL, ktorá bola oslabená CDP (5 a 10 uM; obrázok 6a). Počet ROS-pozitívnych buniek aj intenzita farbenia ROS boli znížené ošetrením CDP spôsobom závislým od dávky (obrázok 6b, c). Analýza Western blot ukázala, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)podporovali expresiu tioredoxínu (TRX1) a glutatiónreduktázy (GSR), pričom potláčali expresiu indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého (NOS2) v BMM, ktoré boli liečené RANKL a M-CSF počas 3 dní (obrázok 6d).

Ak chcete ďalej preskúmať, či CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačili diferenciáciu osteoklastov znížením produkcie ROS, potom sme BMM ošetrili peroxidom (10 uM), aby sme napodobnili vysoký stav ROS v bunkách. BMM boli indukované RANKL a M‐CSF počas 3 dní a výsledky analýzy western blot a RT‐PCR ukázali, že peroxid podporoval expresiu NFATc1 a c‐Fos v porovnaní s kontrolnými skupinami. V súlade s výsledkami na obrázku 5 bola expresia NFATc1 a c-Fos potlačená CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zatiaľ čo peroxid zachránil inhibičný účinok CDP (obrázok 6e, f). Tieto údaje naznačujú, že CDP potlačil expresiu NFATc1 a c-Fos vychytávaním produkcie ROS.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potláča dráhy MAPK počas osteoklastogenézy indukovanej RANKL

Ďalej sme skúmali účinok CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)liečba na expresiu TRAF6 sprostredkovanú RANKL a aktiváciu dráhy MAPK. Po inkubácii v médiu bez séra počas 2 hodín boli BMM stimulované pomocou RANKL, s alebo bez CDP, počas 60 minút. Stimulácia s CDP (10 uM) nemala žiadny vplyv na expresiu TRAF6 a zoslabila fosforyláciu JNK2 a ERK1/2 po 10 a 20 minútach (obrázok 7). Okrem toho bola fosforylácia p38 významne inhibovaná CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)ošetrenie 60 minút v porovnaní s kontrolnými skupinami (obrázok 7). Tieto údaje ukazujú, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potláča RANKL-indukované MAPK signálne dráhy, čo je v súlade s jeho inhibičným účinkom na tvorbu a aktivitu osteoklastov.

4|DISKUSIA

Cistanche, známy ako „púštny ženšen“, pritiahol v poslednej dobe veľkú pozornosť pre svoju schopnosť modulovať imunitu a pôsobiť ochranne počas starnutia a oxidačného stresu (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Ukázalo sa, že fenylpropanoidom substituované glykozidy, hlavné aktívne zložky Cistanche, inhibujú aktivitu NO v makrofágoch (Ahn, Chae, Chin a Kim, 2017). Okrem toho aCistancheextrakt znižoval oxidačný stres v reperfundovanom myokarde po ischémii a hral významnú úlohu pri inhibícii apoptotických dráh vedúcich ku kardioprotekcii (Yu, Li, & Cao, 2016). Ako dôležitá súčasť Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)má rôzne farmakologické funkcie. Naša súčasná štúdia zistila, že CDP potlačil diferenciáciu a aktiváciu osteoklastov aktivovaných RANKL oslabením produkcie ROS, ako aj aktiváciou NFAT a MAPK.

Ako kyslá fosfatáza existuje TRAcP v rôznych bunkách a je hojný v osteoklastoch a alveolárnych makrofágoch (Snipes, Lam, Dodd, Gray a Cohen, 1986). TRAcP je charakteristický enzým osteoklastov a jeho expresia úzko súvisí s funkciou osteoklastov, ktorá sa považuje za indikátor aktivity osteoklastov a kostnej resorpcie (Minkin, 1982). V našej štúdii CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhiboval počet TRAcP-pozitívnych buniek, čo naznačuje, že RANKL-indukovaná osteoklastogenéza bola blokovaná CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Degradácia kostnej matrice osteoklastmi závisí od katepsínu K (CTSK) a MMP (Gruber, 2015). Tu CDP významne znížila expresiu funkčných génov osteoklastov, ako sú Mmp9, Ctsk a Acp5.

Diferenciácia a funkcia osteoklastov sú regulované viacerými signálnymi dráhami (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Po naviazaní na RANK RANKL získava adaptérový proteín TRAF6 na aktiváciu expresie NFATc1, ktorý je dôležitým transkripčným faktorom pre tvorbu osteoklastov, ovplyvňujúcim génovú expresiu špecifickú pre osteoklasty, vrátane TRAcP a CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). V tejto štúdii sme zistili, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)nemal žiadny vplyv na expresiu RANK a TRAF6 v osteoklastoch. Avšak CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibovala aktiváciu NFATc1 indukovanú RANKL počas osteoklastogenézy BMM. Okrem toho sa preukázalo, že ROS, produkovaný mitochondriami v procese dodávania elektrónov, podporuje proliferáciu a diferenciáciu osteoklastov a reguluje degradáciu kostnej matrice (Ha et al., 2004). Nedávna štúdia zistila, že RANKL indukoval jadrový import Bach1 a zoslabil produkciu antioxidačných enzýmov sprostredkovanú Nrf2, čím zvýšil intracelulárnu expresiu ROS a osteoklastogenézu u myší (Kanzaki et al., 2017). Okrem toho zvýšená tvorba intracelulárnych ROS homocysteínom zvýšila tvorbu a aktivitu osteoklastov (Koh et al., 2006). Naša štúdia zistila, že CDP znížila akumuláciu ROS v osteoklastoch inhibíciou expresie NOS2 a podporou expresie antioxidačných enzýmov, ako je TRX1 a glutatiónreduktáza. Keď sme BMM ošetrili peroxidom, aby sme zvýšili intracelulárnu akumuláciu ROS, výsledky, ktoré zvýšili ROS, mohli zlepšiť expresiu NFATc1, odhalili, že ROS bol pred NFATc1. Zistili sme tiež, že peroxid zachránil inhibičný účinok CDP na expresiu NFATc1. Naše údaje teda naznačujú, že CDP potláča akumuláciu ROS na inhibíciu expresie NFATc1 a potom na potlačenie tvorby a funkcie osteoklastov.

ERK, JNK a p38 patria do rodiny MAPK, ktorá sa tiež podieľa na regulácii diferenciácie osteoklastov (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktivuje MAPK dráhu zvýšením fosforylácie ERK, JNK a p38 (Mizukami et al., 2002). Ukázali sme, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačil RANKL-sprostredkovanú fosforyláciu kľúčových proteínov v MAPK dráhe, čím prispel k inhibičnému účinku CDP na expresiu génov osteoklastových markerov. Pokiaľ je nám známe, toto je prvá štúdia, ktorá ukazuje inhibičné účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na produkciu ROS, aktiváciu NFAT a MAPK, čo predstavuje nové mechanizmy účinku CDP in vitro.

V súhrne sme demonštrovali, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zoslabuje osteoklastogenézu a resorpciu hydroxyapatitu a expresiu génov osteoklastových markerov vrátane Ctsk, Mmp9 a Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)dokázal potlačiť produkciu ROS sprostredkovanú RANKL, ako aj aktiváciu NFAT a MAPK (obrázok 8). Súhrnne naše výsledky naznačujú, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)môže predstavovať kandidátsky liek na liečbu stavov súvisiacich s osteoklastmi sprevádzaných nadprodukciou ROS.

OBRÁZOK 8 Schematický diagram CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)funkciu pri diferenciácii osteoklastov. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potláča produkciu ROS indukovanú RANKL, ako aj aktiváciu NFATc1 a MAPK, čím inhibuje osteoklastogenézu. CDP,Cistanchedeserticolapolysacharid; MAPK, mitogénom aktivovaná proteínkináza; NFATc1, jadrový faktor aktivovanej T bunky; RANKL, receptorový aktivátor ligandu jadrového faktora κB; ROS, reaktívne formy kyslíka [Farebný obrázok si môžete pozrieť na wileyonlinelibrary.com]

POĎAKOVANIE

Túto štúdiu podporili Čínska nadácia pre prírodné vedy (81572164), Národný program výskumu a vývoja kľúčových technológií v Číne (2017YFC1103300), Nadácia prírodných vied v provincii Guangxi (2016GXNSFAA380295) a Univerzitný projekt výskumu vedy a techniky v Guangxi Provincia (KY2015YB054). Čiastočne je podporovaný aj projektom plánu vedeckého výskumu a technologického rozvoja mesta Guangxi (GKG13349003, 1598013‐15), Fondom infraštruktúry pre medicínsky a zdravotnícky výskum v Západnej Austrálii, nadáciou Arthritis Australia Foundation, cenami za spoluprácu na Univerzite Západnej Austrálie (UWA) a Austrálska rada pre zdravie a lekársky výskum (NHMRC, č. 1107828 a 1027932).

KONFLIKT ZÁUJMOV

Autori vyhlasujú, že neexistujú žiadne konflikty záujmov

Od: 'Cistanchedeserticolapolysacharidoslabuje osteoklastogenézu a kostnú resorpciu prostredníctvom inhibície signalizácie RANKL a produkcie reaktívnych foriem kyslíka od Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684