Polysacharidy Cistanche Deserticola zmierňujú kognitívny úpadok a zlepšujú pamäť u starnúcich modelových myší

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRAKT

Nedávne dôkazy naznačujú, že zmeny v osi črevnej mikrobioty a mozgu môžu viesť k zhoršeniu kognitívnych funkcií starnutím. V tejto štúdii sme pozorovali, že dlhodobé podávanie D-galaktózy myšiam vyvolalo kognitívny pokles, črevnú mikrobiálnu dysbiózu, periférny zápal a oxidačný stres. V tomto modeli kognitívneho poklesu súvisiaceho s vekom zlepšili polysacharidy Cistanche deserticola (CDPS) kognitívnu funkciu u myší liečených D galaktózou obnovením črevnej mikrobiálnej homeostázy, čím sa znížil oxidačný stres a periférny zápal. Priaznivé účinky CDPS u týchto starnúcich modelových myší boli zrušené abláciou gutmikrobioty antibiotikami alebo imunosupresiou cyklofosfamidom. Metabolomické profily v sére ukázali, že hladiny kreatinínu, valínu, L-metionínu, o-toluidínu, N-etylanilínu, kyseliny močovej a prolínu boli u starnúcich myší zmenené, ale boli obnovené pomocou CDPS. Tieto zistenia ukázali, že CDPS zlepšuje kognitívnu funkciu v modeli starnutia indukovaného D-galaktózou u myší obnovením homeostázy mozgovej osi črevnej mikrobioty, ktorá zmierňuje nerovnováhu aminokyselín, periférny zápal a oxidačný stres. CDPS teda ukazuje terapeutický potenciál pre pacientov s poruchami pamäti a učenia, najmä s tými, ktoré súvisia s črevnou mikrobiálnou dysbiózou.

Cistanchebylina

ÚVOD

Dlhodobé podávanie D-galaktózy (D-gal) a solí berýlia indukuje starnutie v experimentálnych zvieracích modeloch a in vitro primárnych bunkových kultúrach a používa sa na identifikáciu mechanizmov, ktoré sú základom prirodzeného procesu starnutia [1–4]. Predchádzajúce štúdie ukazujú, že kognitívny pokles u myší na modeli starnutia vyvolaného D-galaktózou súvisí so zníženými hladinami proteínov nervového rastového faktora (NGF) a zvýšenými reaktívnymi formami kyslíka (ROS) v mozgu, ktoré spôsobujú degeneráciu hipokampálnych neurónov a znižujú neurogenéza [3, 4]. Nedávne štúdie tiež ukázali, že zloženie a počet ľudskej črevnej mikroflóry sa počas procesu starnutia výrazne mení[5].

Cistanche deserticola je bylina, ktorá rastie najmä v severozápadnej púštnej oblasti Číny a používa sa v tradičnej čínskej medicíne. Je všeobecne známy ako „ženšen púšte“. Extrakty z Cistanche deserticola obsahujú niekoľko farmakologicky aktívnych zlúčenín, vrátane fenyletanoidných glykozidov, iridoidov, lignózy, oligosacharidov, polysacharidov a aminokyselín; tieto zlúčeniny sú spojené s protizápalovými, antioxidačnými, antisenescentnými, neuroprotektívnymi a imunomodulačnými vlastnosťami [6, 7]. Napríklad polysacharidy extrahované z Cistanche deserticola sa v tradičnej čínskej medicíne používajú na liečbu kolorektálneho karcinómu [8]. Široká škála slabo toxických polysacharidov s užitočnými bioaktivitami bola izolovaná z niekoľkých organizmov, ako je polysacharid Chuanqiong, polysacharid Ganoderma lucidum a polysacharid Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 je galaktoglukán izolovaný z Cistanche deserticola, ktorý podporuje rast niekoľkých prospešných črevných baktérií vrátane niekoľkých druhov Bacteroides a Lactobacillus [12].

Základné mechanizmy normálneho procesu starnutia sa podieľajú aj na niekoľkých ľudských ochoreniach, ako sú neurodegeneratívne poruchy, koronárna ateroskleróza, diabetes typu 2 (T2DM) a hypertenzia [13, 14]. Nedávne štúdie ukázali, že zmeny v črevnej flóre zohrávajú významnú úlohu pri starnutí človeka [15]. Niekoľko štúdií ukázalo, že predĺžené podávanie D-galaktózy u experimentálnych myší a potkanov napodobňuje normálny proces starnutia a je užitočným modelom na štúdium fenotypov súvisiacich so starnutím, ako je pokles kognície [16]. Navyše model starnutia myší vyvolaný D-galaktózou vykazuje zmeny v zložení črevnej mikroflóry [17]. Preto sme predpokladali, že zmeny v zložení črevnej mikrobioty môžu spôsobiť kognitívny pokles u myší s modelom starnutia vyvolaného D galaktózou a skúmali sme, či polysacharidy Cistanche deserticola (CDPS) môžu zmierniť kognitívny pokles obnovením dysbiózy črevnej mikrobioty.

cistanche stonka

VÝSLEDKY

D-galaktózou indukovaný model starnutia myší demonštruje kognitívny pokles a črevnú mikrobiálnu dysbiózu

Analyzovali sme behaviorálnu výkonnosť myší divokého typu (WT) a myší liečených 150 mg D-gal na kg telesnej hmotnosti počas 2 mesiacov (model alebo Mod) pomocou nových testov na rozpoznávanie objektov a Morrisovho vodného bludiska (MWM). Hodnoty preferenčného indexu v novom teste rozpoznávania objektov boli významne znížené u myší v skupine Mod v porovnaní s myšami v skupine WT (obrázok 1A, 1B). Výsledky testu MWM ukázali, že čas únikovej latencie po šiestom dni sa významne zvýšil v skupine Mod v porovnaní so skupinou WT (obrázok 1C, 1D). Okrem toho sa prechody cieľovej platformy a časy plávania v cieľovom kvadrante výrazne znížili v skupine Mod v porovnaní so skupinou WT (obrázok 1E, 1F). Tieto výsledky preukázali významný pokles schopností učenia a pamäte u myší s modelom starnutia vyvolaného právnym predpisom.

Potom sme analyzovali rozdiely v množstve a zložení črevných mikrobiálnych kmeňov, rodov a druhov vo vzorkách výkalov skupín Mod a WT myší pomocou sekvenčných údajov 16S ribozomálnej RNA (rRNA) zo vzoriek výkalov. Prevládajúca črevná flóra u myší skupiny WT a Mod boli Firmicutes a Bacteroides. Početnosť Bacteroides sa však významne znížila a početnosť Firmicutes sa významne zvýšila v skupine Mod v porovnaní so skupinou WT (obrázok 2A). Ďalej sme vykonali lineárnu diskriminačnú analýzu (LDA), aby sme určili skóre veľkosti účinku LDA (LEfSe), po ktorých nasledovali Kruskal-Wallisove a Wilcoxonove testy na vyhodnotenie relatívneho množstva rôznych taxónov u myší skupiny WT a Mod. Výsledky LDA sú znázornené na obrázku 2B. Ďalej sme vytvorili kladogramy ukazujúce rozdielne obohatenie rôznych rodov a druhov patriacich do Bacteriodes a Firmicutes phyla v skupinách WT a modeloch (obrázok 2C). Celkovo naše výsledky preukázali zhoršenú kognitívnu schopnosť a črevnú mikrobiálnu dysbiózu u myší s modelom starnutia vyvolaného D-galaktózou.

cistanche zdravotné prínosy: antioxidácia

Liečba CDPS zlepšuje kognitívne schopnosti u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal

Analyzovali sme, či liečba CDPS zmierňuje kognitívny pokles u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal. Počas 2 mesiacov podávania bola telesná hmotnosť meraná každý druhý deň. Telesné hmotnosti modelových a CDPS skupín myší boli podobné (obrázok 3A). Vykonajte behaviorálne experimenty po poslednej dávke. Nové rozpoznávanie objektov a výsledky testu Morrisovho vodného bludiska ukázali, že krátkodobá pamäť bola významne vyššia v CDPS skupinách myší v porovnaní s modelovou skupinou myší; dlhodobá pamäť v skupine myší CDPS bola vyššia, ale štatisticky nevýznamná v porovnaní s modelovou skupinou myší (obrázok 3B, 3C). To naznačuje, že liečba CDPS zrušila stratu krátkodobej pamäte na rozpoznávanie objektov u myší liečených D-gal.

Priestorové učenie a pamäť týchto myší boli vyhodnotené Morrisovým testom vo vodnom bludisku a výsledky ukázali, že časy únikovej latencie skupiny myší CDPS boli porovnateľné so skupinou myší WT a výrazne kratšie ako u skupinových myší Mod (obrázok 3D) . Okrem toho boli časy únikovej latencie významne nižšie v šiesty deň po podaní CDPS v porovnaní s modelovou skupinou (obrázok 3E). Čas plávania v cieľovom kvadrante bol výrazne vyšší v skupinách CH a CM v porovnaní s modelovou skupinou. Skupina CL je vyššia ako modelová skupina, ale nemá žiadnu štatistickú významnosť (obrázok 3F). Okrem toho bol počet prechodov nástupišťa výrazne vyšší v skupinách CM a CL v porovnaní s modelovou skupinou. Skupina CH je však vyššia ako modelová skupina a nemá žiadnu štatistickú významnosť (obrázok 3G). Tieto výsledky ukázali, že liečba CDPS zlepšila priestorové učenie a pamäť u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal.

Obrázok 1. Predĺžené podávanie D-galaktózy indukuje poškodenie učenia a pamäti u myší.

Obrázok 2. Predĺžené podávanie D-galaktózy indukuje črevnú mikrobiálnu dysbiózu u myší.

Liečba CDPS obnovuje homeostázu zloženia črevnej mikroflóry u myší na modeli starnutia D-galaktózy

Monosacharidy a polysacharidy sú základné živiny potrebné pre rast baktérií [18–21]. Uvádza sa tiež, že CDPS reguluje zloženie črevnej mikroflóry [22]. Preto sme analyzovali, či liečba CDPS zmiernila črevnú mikrobiálnu dysbiózu u myší v modelovej skupine vyhodnotením údajov o sekvenovaní 16S rRNA vzoriek výkalov zo skupín myší WT, modelu a CDPS.

Najprv sme vypočítali indexy diverzity alfa, aby sme vyhodnotili celkové bohatstvo fekálnej mikrobioty a štrukturálny rozdiel medzi týmito skupinami. Analyzovali sme indexy alfa diverzity (-diverzity), ako sú pozorované druhy, hodnoty indexu Shannon, Chao 1, ACE a Simpson, aby sme určili zmeny v zložení rôznych bakteriálnych druhov vo vzorkách výkalov rôznych skupín myší. Indexy diverzity (pozorované druhy, indexy Shannon, Chao 1, ACE a Simpson) boli vyššie v skupinách myší WT a CDPS v porovnaní s modelovou skupinou, ale štatistická významnosť bola pozorovaná len pre hodnoty indexu Chao 1 medzi CM. skupina a skupina Mod. Ukázalo sa, že podávanie s CDPS zvyšuje bohatosť mikrobiómov (obrázok 4A–4E). Ďalej sme analyzovali - indexy diverzity, aby sme identifikovali rozdiely v črevných mikrobiálnych druhoch medzi WT, modelovými a CDPS skupinami myší pomocou nemetrického viacrozmerného škálovania (NMDS), analýzy hlavných súradníc (PCoA) a analýzy hlavných komponentov (PCA). . PCA vykazovala variácie v črevnom mikrobiálnom zložení myší modelovej skupiny počas procesu starnutia, vrátane redukcie rozmerov a udržiavania vzorov a trendov (obrázok 4F). Rozdiely vo fekálnej mikroflóre medzi skupinami WT, model a CDPS boli identifikované na základe PCoA nevážených vzdialeností UniFrac pre gény 16S rRNA (obrázok 4G). Zhluková analýza ukázala významné rozdiely v NMDS medzi modelovou skupinou a skupinami WT a CDPS (obrázok 4H).

Vyhodnotili sme 10 najlepších kmeňov črevnej mikrobioty a zistili sme, že početnosť kmeňa Bacteroides phyla bola významne vyššia v skupinách CH, CM a CL v porovnaní s modelovou skupinou (obrázok 4I). To naznačuje, že CDPS obnovil homeostázu črevnej mikroflóry u myší liečených D-gal. Kladogramy ukázali rozdielne obohatenie rôznych rodov a druhov patriacich k Bacteriodes a Firmicutes phyla v skupinách WT, model a CDPS (obrázok 4J). Ako je znázornené na tepelných mapách, liečba CDPS znížila relatívne zastúpenie Thermoplasmata, Bacilli, neidentifikovaných Actinobacteria, Fusobacteria a neidentifikovanej Elusimicrobia a zvýšila relatívnu abundanciu Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, neidentifikovaných_,Deferositeseria,Analerribacteria ,Erysipelotrichia a neidentifikované_sinice v porovnaní s modelovou skupinou (obrázok 4K). Tieto výsledky ukázali, že liečba CDPS významne obnovila homeostázu črevnej mikroflóry u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal.

Obrázok 3. Liečba CDPS zlepšuje učenie a pamäť u myší s modelom starnutia D-gal.

Liečba CDPS zmierňuje neurodegeneráciu u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal znížením oxidačného stresu

Ďalej sme analyzovali účinky CDPS na zápal analýzou sérových hladín prozápalových cytokínov (IL-2 a TNF- ) a protizápalových cytokínov (IL-4 a IL-10 ) v rôznych skupinách myší. Sérové ​​hladiny IL-2 a TNF- boli významne nižšie a sérové ​​hladiny IL-4 a IL-10 boli významne vyššie v skupinách CH, CM a CL v porovnaní s modelom skupina. Ukázalo sa, že CDPS má protizápalové účinky (obrázok 5A–5D).

Oxidačný stres je spôsobený zvýšenou produkciou reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a je jedným z hlavných faktorov, ktoré podporujú starnutie [23]. Preto sme analyzovali účinky CDPS na oxidačný stres v modeli starnutia myší vyvolanom D-gal vyhodnotením sérových hladín antioxidačného enzýmu, SOD, a produktu peroxidácie lipidov, malondialdehydu (MDA). Sérové ​​hladiny MDA boli významne vyššie a sérové ​​hladiny SOD boli významne znížené v skupine Mod v porovnaní so skupinou WT, ale liečba CDPS tieto účinky zvrátila (obrázok 5E, 5F). Tieto výsledky ukázali, že oxidačný stres bol zvýšený u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal, ale bol znížený liečbou CDPS.

Ďalej sme hodnotili hladiny oxidačného stresu v mozgových tkanivách analýzou hladín pokročilého oxidovaného proteínového produktu (AOPP), priamej peroxidácie lipidov (LPO) a MDA, ako aj aktivity antioxidačných enzýmov, ako je glutatión peroxidáza (GSH-Px). ) a superoxiddismutáza (SOD) v homogenátoch mozgového tkaniva. Mozgy myší skupiny Mod vykazovali významne znížené aktivity SOD a GSH-PX a významne zvýšené hladiny AOPP, LPO a MDA v porovnaní so skupinou WT, ale tieto účinky boli zvrátené v skupine CH, CM a CL (obrázok 6A– 6E).

Ďalej sme vykonali histologické farbenie mozgových rezov s H&E a Nissl farbením, aby sme vyhodnotili ochranné účinky CDPS na mozgy myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal. Myši skupiny Mod vykazovali významné zníženie počtu a objemu neurónov, zvýšenú medzeru medzi neurónmi, nepravidelné usporiadanie neurónov a jadrovú pyknózu v oblasti hipokampu CA1 v porovnaní so skupinou WT, ale tieto patologické zmeny boli významne znížené liečbou CDPS ( Obrázok 6F). Tieto výsledky ukázali, že liečba CDPS významne znížila oxidačný stres a patológiu mozgu u myší s modelom starnutia vyvolaného D gal.

Obrázok 4. Ošetrenie CDPS obnovuje črevné mikrobiálne zloženie u myší v modeli starnutia indukovaného D-galaktózou.

Liečba CDPS znižuje periférny zápal a oxidačný stres udržiavaním črevnej mikrobiálnej homeostázy u modelových myší vyvolaných D-gal

Ďalej sme analyzovali, či zmeny v zložení črevnej mikroflóry boli spojené so zvýšeným periférnym zápalom a oxidačným stresom počas starnutia. Na to sme použili trojitý antibiotický koktail (skupina ABX) alebo cyklofosfamid (skupina Cy; pozri tiež Materiály a metódy) na odstránenie črevnej mikroflóry alebo vyvolanie imunosupresie u myší s modelom starnutia liečených CDPS. Antibiotická liečba zrušila priaznivé účinky liečby CDPS u starnúcich modelových myší. Pozorovali sme zhoršené učenie a pamäť (obrázok 7A) a zmeny v zložení črevnej mikroflóry (obrázok 7B, 7C) u myší v skupine ABX v porovnaní so skupinou liečenou CDPS. Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že ani podávanie CDPS nemôže zvýšiť schopnosť učenia a pamäte myší po zmene črevnej flóry. Okrem toho sme pozorovali zvýšené hladiny prozápalových cytokínov v mozgu a sére myší skupiny ABX v porovnaní so skupinou CDPS (obrázok 7D–7N). Výsledky skupiny ABX a skupiny CY ukázali, že po zničení črevnej flóry a imunitnej funkcie ani podanie CDPS nedokázalo zlepšiť schopnosť učenia a pamäte myší. Tieto výsledky naznačujú, že liečba CDPS znížila periférny zápal, oxidačný stres a kognitívny pokles u myší s modelom starnutia vyvolaného Legal tým, že zabránila črevnej dysbióze.

Potom sme použili imunosupresívny liek, cyklofosfamid [24], aby sme určili úlohu zápalu v priaznivých účinkoch CDPS. Myši CDPS liečené cyklofosfamidom (skupina Cy) vykazovali zhoršenú schopnosť učenia a pamäte, zmeny v zložení črevnej mikroflóry a aberantné hladiny prozápalových a protizápalových cytokínov v mozgu a sére v porovnaní s myšami divokého typu a myšami skupiny CDPS. V porovnaní s modelom a skupinou ABX však neexistuje žiadny význam. (Obrázok 7A–7N). Tieto údaje ukazujú, že zmeny v zložení črevnej mikroflóry zvyšujú periférny zápal u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal.

Obrázok 5. Liečba CDPS moduluje cirkulujúce hladiny prozápalových a protizápalových cytokínov a faktorov súvisiacich s oxidačným stresom u myší s modelom starnutia vyvolaného D-galaktózou.

CDPS zabraňuje starnutiu vyvolanému D-gal reguláciou metabolizmu aminokyselín

Imunitný systém hostiteľa je ovplyvnený metabolitmi generovanými črevnou mikroflórou [25]. Fekálne metabolity predstavujú funkčný údaj o črevnom mikrobiálnom metabolizme a črevnom mikrobiálnom zložení [26]. Okrem toho metabolity črevnej mikroflóry vstupujú do krvného obehu a ovplyvňujú metabolizmus a zdravie hostiteľa [26, 27]. Vo vzorkách séra od myší FWT, Mod a CDPS bolo identifikovaných celkovo 1058 metabolitov. Potom sme tieto metabolity analyzovali pomocou BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a Human Metabolome Database (HMDB) a zistili sme, že 65 metabolitov bolo rozdielne exprimovaných v skupine Mod v porovnaní so skupinou WT. Ďalej sme zistili, že hladiny 8 metabolitov (kreatinín, valín, L-(-)-metionín, o-toluidín, N-etylanilín, kyselina močová, prolín a fenylalanín) sa medzi skupinami WT, Mod a CDPS výrazne líšili. Analýza obohatenia dráhy týchto 8 metabolitov pomocou MetaboAnalyst [28, 29] ukázala, že tieto metabolity súviseli s metabolizmom arginínu, histidínu, arginínu, prolínu a purínu (obrázok 8A, 8B). 7 rôznych metabolitov skupiny MOD a skupiny CDPS v skupine WT.

Potom sme analyzovali, či zmeny v metabolizme aminokyselín súviseli so zmenami v zložení črevnej mikroflóry. Pozorovali sme, že 7 rôznych metabolitov skupín WT, Mod a CDPS (kreatinín, valín, L-(-)-metionín, o-toluidín, N-etylanilín, kyselina močová a prolín) bolo významne znížených v ABX, Cy, a Mod skupiny v porovnaní so skupinami WT a CDPS. Okrem toho neexistuje žiadny význam medzi skupinami ABX a Cy (obrázok 8C). Nakoniec, aby sme preskúmali, existuje korelácia medzi rozdielnym metabolizmom a inými chorobami súvisiacimi so starnutím. Analyzovali sme koreláciu medzi týmito siedmimi rozdielne exprimovanými metabolitmi a ľudskými chorobami pomocou databázy MetaboAnalyst a zistili sme, že tieto metabolity sú spojené s Alzheimerovou chorobou (p=0.00173; obrázok 8D, 8E). Celkovo tieto údaje naznačujú, že CDPS chráni pred starnutím vyvolaným D-gal reguláciou metabolizmu aminokyselín.

Obrázok 6. Liečba CDPS znižuje oxidačný stres v mozgoch myší s modelom starnutia vyvolaným D-galaktózou

DISKUSIA

Charakteristickým znakom starnutia je progresívny pokles kognitívnych funkcií. Predchádzajúce štúdie ukázali, že liečba CDPS významne zlepšila učenie a pamäť u starnúcich myší [30–33]. V tejto štúdii sme preukázali, že liečba CDPS zlepšila kognitívne funkcie inhibíciou periférneho zápalu a oxidačného stresu prostredníctvom obnovenia črevnej mikrobiálnej homeostázy u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal (obrázok 9). Potkany Sprague-Dawley kŕmené polysacharidmi Cistanche vykazovali zvýšený rast prospešných črevných baktérií a zvýšenú črevnú mikrobiálnu diverzitu [34]. CDA-0.05, neutrálny polysacharid Cistanche, zlepšil rast probiotických laktobacilov [22]. Tieto údaje naznačujú, že polysacharidy Cistanche zlepšili homeostázu črevných baktérií.

V tejto štúdii sme preukázali, že CDPS má protizápalové účinky a zlepšuje kognitívnu schopnosť starnúcich modelových myší moduláciou množstva črevných bakteriálnych rodov, ako sú Bacteroidetes, Firmicutes a Proteobacteria. CDP teda môžu byť terapeuticky prospešné pri ochoreniach súvisiacich so starnutím tým, že pretvoria zloženie črevnej mikroflóry [35,36]. Predchádzajúce štúdie navyše ukázali, že hladiny zápalových cytokínov v sére a hrubom čreve sú spojené s relatívnym množstvom bakteriálnych rodov, ako sú Bacteroidetes, Firmicutes a Proteobacteria [37, 38]. Okrem toho črevné mikrobiálne zloženie reguluje funkciu mozgu moduláciou cirkulujúcich hladín niekoľkých cytokínov [39–43]. Naše výsledky ukázali, že liečba CDPS znížila relatívnu abundanciu Thermoplasmata, Bacilli, neidentifikovaných Actinobacteria, Fusobacteria a neidentifikovanej Elusimicrobia a zvýšila relatívnu abundanciu Metanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, neidentifikovaných{8}}Deferribacteres, Nitroserophaleria, Mollicuseria Erysipelotrichia a neidentifikované_sinice.

Črevné mikrobiálne metabolity sa uvoľňujú do krvného obehu a regulujú zdravie a metabolizmus hostiteľa [26, 27]. Črevné mikrobiálne metabolity možno odhadnúť vyhodnotením zloženia fekálnych metabolitov, ktoré sa mení so zmenami v zložení črevných mikróbov [44]. Nedávne štúdie ukázali, že plazmatické hladiny citrulínu, prolínu, arginínu, asparagínu, fenylalanínu a treonínu sú spojené s neurodegeneratívnymi poruchami vrátane Alzheimerovej choroby [45, 46]. Naša štúdia ukázala, že sérové ​​hladiny kreatinínu, valínu, L-metionínu, o-toluidínu, N-etylanilínu, kyseliny močovej a prolínu boli spojené so starnutím vyvolaným D-gal u myší.

Extrakt z Cistanche: Anti-Alzheimerova choroba

Vrodené a adaptívne ramená imunitného systému hrajú významnú úlohu pri udržiavaní hostiteľsko-mikrobiálnej homeostázy v črevnom luminálnom povrchu [47]. Črevná mikroflóra tiež zohráva významnú úlohu pri regulácii centrálneho nervového systému (CNS) a imunity uvoľňovaním cytokínov a metabolitov do krvného obehu [48, 49]. Prozápalové cytokíny hrajú kľúčovú úlohu pri niekoľkých neurodegeneratívnych ochoreniach [50–52]. Napríklad vekom podmienená degenerácia makuly (AMD) a glaukóm sú spojené s extracelulárnou akumuláciou amyloidu (A ) a intracelulárnym ukladaním hyperfosforylovaného tau (p tau) a železa v gangliových bunkách sietnice (RGC) [44]. Okrem toho zápal hrá významnú úlohu v patogenéze spojenej s glaukómom [53]. Zrakové postihnutie je skorým príznakom Alzheimerovej choroby (AD) a prejavuje sa pred nástupom kognitívneho poklesu [54]. Naša štúdia preukázala, že CDPS chráni pred kognitívnym poklesom a periférnym zápalom udržiavaním homeostázy črevnej mikroflóry.

Táto štúdia má niekoľko obmedzení. Po prvé, vzťah medzi metabolizmom aminokyselín a zložením črevnej mikroflóry nie je dobre známy. Po druhé, zloženie a molekulárna štruktúra CDPS nie je známa. Preto sú potrebné budúce štúdie na ďalšie skúmanie regulačnej úlohy CDPS pri zmierňovaní AD prostredníctvom osi črevnej mikrobioty a mozgu.

Na záver naša štúdia preukázala, že CDPS zlepšila kognitívne schopnosti u myší s modelom starnutia vyvolaného D-gal obnovením homeostázy črevnej mikroflóry, čím sa obnovila nerovnováha aminokyselín, periférny zápal a oxidačný stres. Tieto zistenia naznačujú, že CDPS je potenciálnym liekom pre pacientov s poruchami učenia a pamäti, najmä tých, ktoré sú spojené s črevnou dysbiózou.

MATERIÁLY A METÓDY

Príprava CDPS

Asi 1.0 kg vyčistenej Cistanche deserticola sa vysušil na vzduchu v sušiarni pri 40 °C a rozdrvil na surový prášok. Prášok sa extrahoval v horúcom etanole počas 3 hodín. Zvyšok sa prefiltroval cez gázu, aby sa odstránil filtrát, a potom sa zriedil vodou (8x) a refluxoval sa postupne 2 hodiny, 1,5 hodiny a 1 hodinu pri 90 °C. V každom časovom bode sa roztok odstredil, aby sa oddelil supernatant a v kombinácii s hnedočerveným filtrátom. Potom sa filtrát zahustil pri zníženom tlaku, ochladil sa na teplotu miestnosti, pomaly sa pridal k 95 percentnému etanolu (3x) a nechal sa stáť pri 4 °C počas 24 hodín. Potom sa roztok odstreďoval pri 6000 ot./min. počas 20 minút pri teplote 4 °C. Zrazenina sa zhromaždila po trikrát opakovanej extrakcii vodou a vyzrážaní alkoholom. Precipitát sa rekonštituoval vo vode, deproteinoval, dialyzoval a lyofilizoval, čím sa získal surový polysacharid Cistanche deserticola (CDP). Obsah polysacharidov bol viac ako 90 percent, ako bolo vyhodnotené ultrafialovou spektrofotometriou.

extrakt z cistanche

Zoskupovanie zvierat a liečba

Osemtýždňový samček myší Kunming (číslo licencie SCXK.{2}}) bol zakúpený od spoločnosti SPF Biotechnology Co. Ltd (Peking, Čína), umiestnený v miestnosti s kontrolovaným svetlom a teplotou a kŕmený jedlom a vodou. Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali podľa protokolov schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich použitie Lekárskej univerzity v Inner Mongolia. Experimenty sa uskutočňovali podľa Príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Národného inštitútu zdravia (NIH).

Po 1 týždni adaptácie na nové prostredie sa 120 myší rozdelilo do nasledujúcich 7 skupín: (1) kontrola divokého typu (WT); modelová skupina (150 mg/kg/deň D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) skupina ABX: antibiotiká plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (7) Skupina Cy: cyklofosfamid plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS.

Myši z modelových skupín, ABX, Cy a CDPS dostávali subkutánne injekcie 150 mg/kg D-gal rozpusteného vo fyziologickom roztoku každý deň počas 2 mesiacov. Skupine WT sa subkutánne podával rovnaký objem fyziologického roztoku počas 2 mesiacov. Myšiam v skupine CDPS sa tiež denne podávali intragastrické injekcie obsahujúce 100 mg/kg, 50 mg/kg alebo 25 mg/kg CDPS počas 2 mesiacov. Myši skupiny ABX dostávali pitnú vodu s 0,1 mg/ml ampicilínu a 0,5 mg/ml streptomycínu počas 2 mesiacov okrem injekcií D-gal a CDPS. Pred podaním D-gal dostali myši injekcie obsahujúce 0,1 mg/ml ampicilínu, 0,5 mg/ml streptomycínu a 0,1 mg/ml kolistínu počas 7 dní v skupine ABX. Myši skupiny Cy dostávali intraperitoneálne injekcie 20 mg/kg cyklofosfamidu každý druhý deň (qod) počas 2 mesiacov navyše k denným injekciám D-gal a CDPS.

Nový test rozpoznávania objektov

Vykonajte behaviorálne experimenty po poslednej dávke. Test rozpoznávania objektov zahŕňal fázy zoznámenia, školenia a testovania. Počas fázy zoznamovania sa myši privykali v prázdnej testovacej komore počas 10 minút počas dvoch dní. Potom, na tretí deň (tréningový deň), boli dva predmety rovnakej veľkosti, tvaru a farby (A1 a A2) umiestnené na opačné konce komory. Každá myš potom dostala 10 minút na preskúmanie dvoch podobných objektov. Po 1-hodine (tretí deň) a 24-hodine (štvrtý deň) intervaloch medzi tréningom a testovaním bol jeden z podobných objektov (A1 alebo A2) nahradený B alebo C objekt, ktorý sa v deň testovania líši veľkosťou, farbou a tvarom. Počas testovacej fázy sa každá myš testovala 5 minút a vypočítal sa preferenčný index, aby sa určila pamäť rozpoznávania nového objektu (B alebo C) pomocou nasledujúceho vzorca: preferenčný index{11}}čas na objekte B alebo C/ (Čas na objekte B alebo C plus čas na objekte A)×100 percent .

Morrisov test vo vodnom bludisku

Test Morrisovho vodného bludiska sa uskutočnil v okrúhlom bazéne, ktorý mal hĺbku 45 cm a priemer 90 cm. Protokol opísaný v Ruediger S, et al. (2011) [55] a Wood RA, et al. (2018) [56] tu bol zamestnaný. Hĺbka vody v bazéne bola 30 cm a teplota vody bola 20±1 °C. Plošina mala priemer 6 cm a 1 cm pod vodou. Čas na tréning a testovanie bol 60 s. Na školenie sme vykonali štyri pokusy po 60 s každý deň so skrytou platformou počas piatich nepretržitých dní. Ak plošinu neobjavili myši do 60 s, boli navedené na plošinu a umiestnené na plošinu na 5 s. Počas fázy testovania sa zaznamenávala a analyzovala latencia dosiahnutia skrytej platformy v tréningových a skúšobných reláciách sondy, počet prechodov cez odstránenú polohu platformy a čas strávený v cieľovom (platformovom) kvadrante.

ELISA testy

Sérové ​​hladiny prozápalových cytokínov ako IL-2(), IL-4, IL-10 a TNF- boli analyzované pre každú skupinu myší pomocou súprav ELISA zakúpených od Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Čína) podľa pokynov výrobcu. Aktivita antioxidačného enzýmu, superoxiddismutázy (SOD) a hladiny produktu peroxidácie lipidov, malondialdehydu (MDA), v sére každej skupiny myší sa analyzovali testovacími súpravami zakúpenými od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). . Hladiny produktov pokročilej oxidácie proteínov (AOPP) vo vzorkách myšacieho hipokampu sa odhadli pomocou súpravy ELISA od Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, Čína) podľa pokynov výrobcu.

Odhad oxidačného stresu v myšacích mozgoch

Homogenizovali sme 100 mg tkaniva hipokampu s 0,9 ml ľadovo vychladeného fyziologického roztoku a homogenát sme centrifugovali pri 12 000 ot./min počas 30 minút pri teplote 4 °C. Obsah proteínu v supernatante sa analyzoval pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Šanghaj, Čína). Hladiny peroxidácie lipidov (LPO) a malondialdehydu (MDA) a aktivity GSH-Px a SOD vo vzorkách hipokampu sa analyzovali kolorimetricky s použitím súprav z Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína) podľa pokynov výrobcu.

Doplnok Cistanche: zlepšuje pamäť

Zloženie črevnej mikroflóry

Vzorky výkalov boli odobraté od všetkých myší a ihneď uložené pri -80 stupni C. Oblasť V3 plus V4 génu rRNA 16S bola sekvenovaná pomocou Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Peking, Čína) a analyzovaná pomocou QIIME otvorená platforma na určenie profilov črevnej mikroflóry.

LC/MS analýza sérových metabolitov

Vzorky séra sa inkubovali 10 minútu s vopred vychladeným metanolom v pomere 1:3, aby sa vyzrážali proteíny. Vzorky sa centrifugovali pri 12000r/min počas 15 minút pri 4 °C. Supernatanty sa analyzovali kvapalinovou chromatografiou Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 s rýchlym rozlíšením a QExactive hmotnostným spektrom. Chromatografické podmienky sú uvedené v tabuľke 1. Analyty sa separovali v XBridge BEH Amide chromatografickej kolóne (2,1 x 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) s použitím 0,1 % kyseliny mravčej a acetonitrilu ako mobilných fáz A a B , resp. Prietok bol nastavený na 0,4 ml/min, objem vstreku bol 5 ul a teplota kolóny bola nastavená na 25 °C (tabuľka 1). Signály hmotnostného spektra sa získali pomocou režimu skenovania pozitívnych a negatívnych iónov. Napätie iónového spreja a ďalšie špecifické parametre MS sú uvedené v tabuľke 2.

Štatistická analýza

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.{1} a str< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">