Cistanche: Echinakozidom indukovaná produkcia oxidu dusnatého v endotelových bunkách: Úlohy androgénneho receptora a dráhy PI3K-Akt

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU a XIN LIU

Úvod

CistancheHoffmg. Et Link je viacročná parazitická bylina z čeľade Orobanchaceae. HerbaCistanche, stonkaCistanche deserticolaY. c. MA aCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight sa používali ako tonizujúce činidlo na liečbu obličkovej nedostatočnosti, impotencie, chorobnej leukorey a senilnej zápchy (1), čo môže byť spôsobené jeho androgénnym účinkom alebo regulačným účinkom pohlavných hormónov (2).Echinakozid(EcH; c35H46020;

molekulová hmotnosť, 786,73; 1), je jedným z fenyletanoidových glykozidov (PhGs) izolovaných zo stoniek HerbaCistanchea vykazuje viaceré biologické vlastnosti, vrátane antioxidačných, antiagingových, protizápalových, hepatoprotektívnych a neuroprotektívnych účinkov (3). Moderné farmakologické výskumy ukázali, že rôzne zložky HerbaCistanchevrátane EcH, akteozidu, kankanózy, kankanozidu F a cistanozidu F vykazujú vazorelaxačnú aktivitu (4).

Endotel je kritickým regulátorom vaskulatúry a oxid dusnatý (NO) je dôležitým relaxačným faktorom uvoľňovaným endotelovými bunkami. Difúziou do buniek hladkého svalstva NO aktivuje guanylátcyklázu, zvyšuje hladiny cyklického guanozínmonofosfátu (cGMP) a následne aktivuje cGMP-dependentné proteínkinázy (PKG) na podporu relaxácie hladkého svalstva (5). Už skôr bolo preukázané, že EcH pri 350-400 µM priamo pôsobí na hladké svalstvo ciev a inhibuje hypoxiou indukovanú proliferáciu v bunkách hladkého svalstva pľúcnej artérie potkana (6), zatiaľ čo 30-300 µM EcH spôsobuje akútnu vazorelaxáciu v endoteli- intaktné prstence spôsobom závislým od koncentrácie a zvýšená produkcia cGMP v hladkom svale corpus cavernosum prstencov aorty kontrahovaných fenylefrínom (7). Otvorením kanálov NO-cGMP-PKG-BKca v bunkách hladkého svalstva 100 alebo 300 uM EcH potlačilo noradrenalínom indukovanú kontrakciu v pľúcnych artériách potkanov, najmä v prstencoch s obnaženým endotelom (8). Endotelové bunky sú kľúčovými regulátormi kardiovaskulárnych funkcií a v niekoľkých prípadoch sa zistilo, že k relaxácii závislej od endotelu došlo v dôsledku prenosnej látky, akou je NO, uvoľnenej z endotelu (9). Avšak protismerný molekulárny mechanizmus produkcie NO indukovanej EcH vo vaskulárnych endotelových bunkách vyžaduje ďalšie skúmanie.

Vo vaskulárnom endoteli je tvorba NO primárne sprostredkovaná endoteliálnou NO syntázou (eNOS). Niekoľko skupín preukázalo, že fosfatidylinozitol 3-kinázová (PI3K) dráha aktivuje serín-treonín proteínkinázu B (Akt), ktorá spôsobuje priamu fosforyláciu eNOS na seríne 1177 (Ser1177) (10). Androgénny receptor (AR) je členom podrodiny jadrových receptorov s3, ktorý kanonicky modifikuje génovú expresiu. Je zapojená lokalizácia AR do kaveol v bunkovej membráne

negenomická regulácia funkcie endotelových buniek alebo génovej expresie spustením kaskády c-Src/PI3K/Akt, čo nakoniec vedie k fosforylácii eNOS a produkcii NO (11). V endotelových bunkách ľudskej aorty sa uvádza, že testosterón aktivuje signalizáciu PI3K/Akt a rýchlo indukuje produkciu NO v dôsledku priamej interakcie AR a podjednotky p85 PI3K na kardiovaskulárnom systéme (12). Bolo hlásené, že EcH zhoršuje symptómy súvisiace s nedostatkom hormónov a prejavuje svoje androgénne účinky v dôsledku kompetitívnej väzby na AR namiesto testosterónu (2). Preto táto štúdia predpokladala, že dráha PI3K / Akt sa môže podieľať na produkcii NO prostredníctvom fosforylácie eNOS závislej od AR indukovanej EcH. Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť nasledujúce účinky EcH: i) indukcia produkcie NO a fosforylácie eNOS; ii) zapojenie AR do fosforylácie eNOS; a iii) aktivácia PI3K/Akt dráhy v ľudských endotelových bunkách pupočníkovej žily (HUVEcs), dobre známy experimentálny model na štúdium regulácie funkcií endotelových buniek a angiogenézy (13).

Materiály a metódy

Chemikálie a činidlá.EcH (čistota, 92,5 percenta) bola získaná z National drug Reference Standards v Národnom inštitúte pre kontrolu potravín a liečiv. Protilátky proti p-Akt (Ser473; kat. č. ab8805), Akt (kat. č. ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. č. ab184154) a eNOS (kat. č. ab76198) boli zakúpené od Abcam. Inhibítory nilutamidu a IcI 182780 boli získané od Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME bol zakúpený od Adamas-Beta, Ltd. a wortmannín bol zakúpený od Pribolab.

Bunka kultúra a liek liečbe.HUVEc boli získané od Sciencell Research Laboratories Inc. a kultivované v médiu pre endotelové bunky (EcM; Sciencell Research Laboratories) s 5 percentami (v/v) fetálnym hovädzím sérom (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 1 percentom endotelových buniek rastový doplnok (ECGS) pri 37˚C (5 percent CO2 a 95 percent vlhkosti) (14). Po dosiahnutí konfluencie boli bunky štiepené trypsínom a nanesené v EcM s 1 percentom FBS a 1 percentom EcGS. Pre všetky experimenty boli HUVEc nanesené na platne s koncentráciou 1 x 104/ml a rástli až do dosiahnutia konfluencie. Pred ošetrením EcH alebo inými stimulátormi sa bunky inkubovali v EcM bez fenolovej červene bez FBS a EcGS počas 6 hodín, aby sa indukovala

zastavenie rastu. V inhibičných experimentoch boli HUVEc predinkubované s rôznymi antagonistami alebo inhibítormi, vrátane 10 μM nilutamidu, 10 μM IcI 182780, 0,5 mM L-NAME alebo 5 μM wortmannínu, počas 30 minút, s alebo bez ECH, pri 37 °C. Vo všetkých skupinách, vrátane kontroly, sa ako rozpúšťadlo použil dMSO v rovnakých koncentráciách 0,001 percenta.

Meranie intracelulárne ŽIADNA výroba.

Relatívne zmeny v koncentrácii cytosolického NO v HUVEc sa monitorovali pomocou fluorescenčnej NO sondy DAF-FM (Cayman Chemical Company), ako už bolo uvedené (12). V stručnosti, bunky sa naniesli 5 uM DAF-FM diacetátom počas 20 minút pri 37 °C v čiernej mikrotitračnej doštičke a niekoľkokrát sa premyli PBS (pH 7,4). Fluorescencia bola stanovená pri excitačných a emisných vlnových dĺžkach 495 a 515 nm s použitím fluorescenčnej čítačky mikrodoštičiek (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) a kompaktného inverzného mikroskopu (Nikon eclipse Ts2R; Nikon corporation).

západnej škvrna analýza.Ako už bolo uvedené (15), konfluentné monovrstvy buniek boli dvakrát premyté v ľadovo studenom PBS a lyzované pufrom RIPA (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). Koncentrácia proteínu v supernatante sa merala použitím metódy testu s kyselinou bicinchonínovou (16). Následne bolo nanesených 30 ug proteínu na dráhu, separované pomocou 10 % polyakrylamidových gélov a prenesené na polyvinylidéndifluoridové membrány. Membrány boli blokované 5 percentným odstredeným mliekom počas 1 hodiny pri 25 °C. Po inkubácii s monoklonálnymi protilátkami proti Akt (1:1, 000 riedenie), p-Akt (1:500 riedenie), eNOS (1:2, 000 riedenie) alebo p-eNOS (1 :1,000 riedenie) pri 4 °C cez noc, membrány sa premyli TBST (obsahujúcim 0,1 percenta Tween-20) 4-krát po dobu ~15 minút na premytie pri 25 °C. Následne boli membrány inkubované so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s chrenovou peroxidázou (1:5, 000 riedenie; anti-myšia protilátka, kat. č. A0216, alebo anti-králičia protilátka, kat. č. A0208, Beyotime Institute biotechnológie) počas 1 hodiny pri 25 °C a detegovala sa pomocou vylepšenej chemiluminiscenčnej súpravy (kat. č. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Intenzity pásov boli kvantifikované pomocou softvéru na analýzu gélu Image J, verzia 1.8.{43}} (National Institutes of Health).

Malý zasahovanie (si) RNA príprava a transfekcia.Dlhé dvojvláknové RNA boli syntetizované cieľovou mRNA AR a estrogénového receptora (ER) so sekvenciami uvedenými v tabuľke I. Podmienky pre knockdown siRNA zahŕňali transfekciu HUVEC pri 70-percentnej konfluencii udržiavanej v neantimikrobiálnom prostredí kultivačné médium v ​​60 mm kolagénom potiahnutých kultivačných miskách. Transfekcia 5 nM AR-siRNA alebo 10 nM ER-siRNA s činidlom Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) sa uskutočnila oddelene podľa protokolov výrobcu. Účinnosť transfekcie bola hodnotená reverznou transkripčnou kvantitatívnou-PcR analýzou (RT-qPcR), ako už bolo uvedené (17). Podmienky termocyklovania boli nasledovné: 10 minút pri 95 °C; 40 cyklov 95 °C počas 5 sekúnd a 60 °C počas 1 minúty a krivka topenia pri 95 °C počas 15 sekúnd, 60 °C počas 1 minúty a 95 °C počas 15 sekúnd; pre každú vzorku sa uskutočnili tri nezávislé biologické replikáty. Nasledujúce experimenty sa uskutočnili 48 hodín po transfekcii. Páry primérov boli navrhnuté pomocou softvéru Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) s nasledujúcimi sekvenciami: AR forward, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' a reverzný, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER vpred, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' a vzad, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; a GAPdH vpred, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' a vzad, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Štatistické analýza.Všetky údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka. Štatistické porovnania medzi skupinami sa uskutočňovali pomocou Kruskal-Wallisovho testu alebo dvojcestnej ANOVA s Tukeyho post hoc testom na viacnásobné porovnania. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Výsledky

ECH vyvoláva NIE výroby a eNOS fosforylácia.Ako je znázornené na obr. 2A a B, 1 uM ECH významne zvýšilo intracelulárnu produkciu NO v HUVEc v porovnaní s negatívnymi kontrolnými bunkami, zatiaľ čo stimulačný účinok EcH bol oslabený na kontrolnú úroveň predošetrením L-NAME. Na získanie optimálnej koncentrácie sa fosforylácia eNOS testovala 60 minút po ošetrení EcH v koncentráciách

z {{0}}, 0.01, 0.1, 1 a 10 uM. Výsledky odhalili, že EcH v koncentráciách 0,01-10 uM môže významne indukovať fosforyláciu eNOS na Ser 1177 spôsobom závislým od koncentrácie, pričom maximálna fosforylácia eNOS sa pozoruje pri indukcii 10 uM EcH (obr. 2c a d). Okrem toho sa fosforylácia eNOS na Ser1177 skúmala analýzou Western blot 0, 5, 15, 30, 60 a 120 minút po inkubácii s 1 uM EcH. Pozorovalo sa, že fosforylácia eNOS bola rýchlo spustená pomocou EcH po 5 minútach a pokračovala v zvyšovaní až do 30 minút inkubácie (obr. 2E a F). Následne, napriek liečbe EcH, relatívna veľkosť fosforylácie eNOS zostala stabilná od 30 minút; preto EcH neovplyvnil celkovú expresiu eNOS (obr. 2c a E).

AR sprostredkuje ECH-indukované NIE výroby a eNOSinterferujúce účinky AR-siRNA-1 a ER-siRNA-2 boli v tejto štúdii najúspešnejšie pri inhibícii expresie AR a ER v HUVEc (obr. 3). Následne sa aplikoval antagonista na analýzu inhibície funkcie AR a siRNA na analýzu straty funkcie AR na vyhodnotenie zapojenia AR do aktivácie eNOS a produkcie NO vyvolanej EcH. Ako je znázornené na obrázku 4A, 1 uM ECH významne zvýšilo produkciu NO v HUVEc (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH aktivuje a PI3K/Akt chodník.V tejto štúdii sa fosforylácia Akt na Ser473 testovala 60 minút po inkubácii EcH pri koncentráciách 0, 0.01, 0.1 1 a 10 uM. Výsledky ukázali, že EcH (0.{10} µM) môže významne indukovať fosforyláciu Akt. Relatívne hladiny expresie p-Akt vrcholili pri 1 a 10 uM ošetrení EcH (obr. 5A a B). Okrem toho sa fosforylácia Akt skúmala analýzou Western blot v 0, 5, 15, 30, 60 a 120 minútach po pridaní 1 uM EcH ku kultúram HUVEc. Ako je znázornené na obr. 5c a d, EcH rýchlo zvýšilo fosforyláciu Akt po 5 minútach inkubácie a maximálna hladina proteínu p-Akt bola pozorovaná po 60 minútach. Na rozdiel od toho EcH neovplyvnil celkovú expresiu Akt (obr. 5A a c). Okrem toho, aby sa preskúmal potenciálny účinok dráhy PI3K na fosforyláciu eNOS, boli HUVEc pred aplikáciou EcH vopred ošetrené inhibítorom PI3K wortmannínom. Zistilo sa, že wortmannín znižuje EcH-indukovanú produkciu NO na základnú úroveň (obr. 5E). Podobný jav sa pozoroval pri použití fluorescenčnej mikroskopie pri skúmaní fluorescencie DAF-FM indukovanej EcH (obr. 5F). Okrem toho wortmannín môže mať schopnosť zrušiť rýchlu fosforyláciu eNOS v HUVEc (obr. 5G a H). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že EcH môže aktivovať fosforyláciu eNOS a produkciu NO prostredníctvom dráhy PI3K/Akt.

Diskusia

EcH je prírodná zlúčenina izolovaná z HerbaCistanches rôznymi farmakologickými vlastnosťami. Už skôr bolo preukázané, že EcH má vaskulárny relaxačný účinok závislý od endotelu otvorením NO-cGMP-PKG-BKca kanálov v bunkách hladkého svalstva krvných ciev (7, 8). Súčasné zistenia poskytujú dôkaz, že ECH vyvíjal aktiváciu eNOS závislú od AR na vyvolanie produkcie NO so zapojením signálnej dráhy PI3K / Akt vo vaskulárnych endotelových bunkách.

Ako najvnútornejšia vrstva cievnej steny môže endotel rýchlo snímať a reagovať na zmeny v prietoku krvi, čo následne vedie k prenosu signálu do podložných buniek hladkého svalstva s cieľom regulovať vaskulárny tonus (18). Vo veľkej miere sa uvádza, že existuje viacero vazodilatačných zlúčenín odvodených od endotelu, pričom najtypickejšia látkaje NO, tvorený z endotelovej izoformy eNOS, čo vedie k fosforylácii (19). Za normálnych podmienok zostáva eNOS neaktívny, keď je naviazaný na kaveolín a aktivuje sa nasledujúcim sledom udalostí v endotelibunky: i) eNOS disociuje od kaveolínu-1 a spája sa s ca2 plus /caM; ii) proteín tepelného šoku (HSP)90 podporuje eNOSdimerizáciu a uprednostňuje stérickú formáciu na nábor Akt; a iii) kalcineurín defosforyluje Thr495 na posilnenie aktivačného stavu (20). V tejto štúdii bola produkcia NO významne zvýšená v HUVEC ošetrených 1 uM ECH. Tento jav bol podobný predchádzajúcim výsledkom, kde EcH zvýšilo uvoľňovanie NO a stimulovalo syntézu cGMP v prstencoch hrudnej aorty potkana (7). Okrem toho sa dve fosforylačné miesta, Ser1177 a Thr495, zdajú byť obzvlášť dôležité pre reguláciu aktivity eNOS (20) a táto štúdia odhalila, že EcH vyvolal akútnu fosforyláciu eNOS na Ser1177 spôsobom závislým od koncentrácie. Okrem toho stimuly spojené s účinkami na hladiny proteínu eNOS určujú najmä stabilitu mRNA eNOS a ak je stimul udržiavaný dlhší čas, dochádza k transkripcii mRNA eNOS prostredníctvom mitogénom aktivovanej proteínkinázy a jadrového faktora κB (20). Celkovo tieto pozorovania naznačujú, že aktivácia eNOS na Ser1177 je zodpovedná za syntézu NO indukovanú EcH.

Okrem toho rastúci počet štúdií preukázal, že AR je exprimovaný v endotelových bunkách v mnohých ľudských tkanivách, čo naznačuje potenciálnu úlohu androgénov a ich analógov, ktoré pôsobia prostredníctvom procesov sprostredkovaných AR, pri modulácii ľudského endotelu. bunková homeostáza (21). V neklasickej dráhe PI3K/Akt môže AR aktivovať PI3K priamou interakciou s regulačnou podjednotkou p85 PI3K (22). Táto štúdia preukázala, že antagonista AR alebo AR siRNA znížil produkciu NO a fosforyláciu eNOS indukovanú EcH v HUVEc. Už skôr bolo publikované, že estrogény indukujú fosforyláciu eNOS a stimulujú produkciu NO prostredníctvom klasickej aktivácie ER v endotelových bunkách (23) a podávanie ECH významne zvyšuje expresiu ER v maternici (24). V tejto štúdii bol však účinok AR výraznejší v porovnaní s účinkom ER na aktiváciu eNOS indukovanú EcH a produkciu NO. Okrem toho sa pozorovalo, že EcH spôsobil akútnu produkciu NO v priebehu niekoľkých minút prostredníctvom aktivácie eNOS v HUVEc spojenej s AR, čo je v súlade s negenomickou povahou odpovede v endotelových bunkách. AR je v cytoplazme spojená s proteínmi lešenia, vrátane HSP90, HSP70 a kinázy Src, a môže byť transportovaná na membránu z komplexu AR do 5 minút po liečbe testosterónom (23). Na základe stratégie „cieľového rybolovu“ bol HSP90 identifikovaný ako cieľ spojený s PhGs, čo naznačuje, že EcH môže uľahčiť disociáciu AR od proteínov lešenia (25). Ďalšia štúdia naznačila, že v hypotalame sa EcH môže kombinovať s AR vreckom na aminokyselinách Met-894 a Val-713 a inhibovať transport cytoplazmatického AR do jadra (26). Avšak základný mechanizmus, prostredníctvom ktorého EcH sprostredkúva cytoplazmatickú translokáciu AR na membránu, si vyžaduje ďalšie skúmanie. Preto je potrebný ďalší výskum na objasnenie mechanizmu, prostredníctvom ktorého EcH dosahuje aktiváciu eNOS závislú od AR a ako môže byť spojená s väzbou na HSP90 vo vaskulárnych endotelových bunkách.

Dráha PI3K/Akt je jednou z najdôležitejších signálnych kaskád, ktorej aktivácia je indukovaná produkciou fosfatidylinozitol-3,4,5-trifosfátu, ktorý sa viaže na N-terminálnu pleckstrínovú homológnu doménu Ser/ Thr kináza Akt. To uľahčuje nábor Akt do plazmatickej membrány (27). Dráha PI3K/Akt môže hrať dôležitú úlohu pri kontrole relaxácie závislej od NO indukovanej EcH.

Táto štúdia odhalila, že produkcia NO indukovaná EcH bola významne znížená, keď boli bunky inkubované s PI3K inhibítorom wortmannínom. Predchádzajúca správa preukázala, že 15 mg/kg EcH aktivovalo signálnu dráhu PI3K/Akt v bunkách kostnej drene potlačených 5-fluóruracilom (28). V tejto štúdii inhibítory PI3K významne znížili fosforyláciu eNOS indukovanú EcH na Ser1177. Okrem toho bola aktivita Akt prevažne regulovaná upstream regulačnými dráhami, najmä fosforyláciou závislou od PI3K na Ser473 (20). V tejto štúdii EcH indukoval Akt fosforyláciu na Ser473 spôsobom závislým od dávky; podobne predchádzajúca štúdia preukázala, že 5, 10 alebo 20 uM EcH má kardioprotektívny účinok proti anoxii/reperfúznej liečbe spôsobom závislým od dávky potenciálnou reguláciou p-Akt a SLc8A3 (29). Transkripčná regulácia génu Akt zostáva do značnej miery neznáma (30); preto sa táto štúdia zamerala na post-transkripčné regulačné účinky EcH na Akt. Vzhľadom na vyššie uvedené zistenia sa usúdilo, že aplikácia EcH na HUVEcs môže viesť k aktivácii dráhy PI3K/Akt, ktorá fosforyluje eNOS a následne zvyšuje produkciu NO.

Záverom, EcH je prírodný produkt, ktorý sa izoluje hlavne z HerbaCistanche.Potenciálny mechanizmus, ktorý je základom EcH-indukovanej produkcie NO v endotelových bunkách, môže zahŕňať nasledovné (obr. 6): i) EcH pôsobí ako funkčný ligand AR, ktorý je lokalizovaný v kaveolách v bunkovej membráne; ii) PI3K sa viaže na hydrofóbnu doménu Akt na Ser473 a uľahčuje prijímanie Akt do bunkovej membrány; iii) nábor PI3K/Akt kaskád spúšťa AR-závislú eNOS fosforyláciu; a iv) tvorba NO je sprostredkovaná eNOS v endotelových bunkách. Pozorovanie, že EcH indukuje produkciu NO prostredníctvom AR-závislej fosforylácie eNOS so zapojením PI3K/Akt dráhy, môže prispieť k ďalšiemu pochopeniu vazorelaxačných účinkov EcH. Okrem toho môže byť EcH zacielený na dráhy NO odvodené od endotelu spôsobené negenomickými účinkami. Preto táto štúdia môže pomôcť objasniť mechanizmy, prostredníctvom ktorých EcH uplatňuje svoje farmakologické účinky na prevenciu kardiovaskulárnych ochorení.

Poďakovanie

Nepoužiteľné.

Financovanie

Táto štúdia bola podporená Národnou nadáciou pre prírodné vedy v Číne (grant č. 81503333).

Dostupnosť z údajov a materiálov

Súbory údajov generované a analyzované počas tejto štúdie sú k dispozícii od príslušného autora na primeranú žiadosť.

autorov príspevkov

LG a XL vymysleli a navrhli experimenty. dL a YZ uskutočnili experimenty. WZ a JG analyzovali údaje. Spoločnosť LG vypracovala rukopis. XL skontroloval a upravil rukopis. Všetci autori prečítali a schválili konečný rukopis.

1202 GUet al: ECHINACOSID VYVOLÁVA PRODUKCIU OXIDU DUSIČNÉHO POMOCOU AR-ZÁVISLEJ PI3K/AKT PATHWAY

Etika schválenie a súhlas do zúčastniť sa

Nepoužiteľné.

Pacient súhlas pre zverejnenie

Nepoužiteľné.

Súťažiť záujmy

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne konkurenčné záujmy.

Referencie

1. komisia pre čínsky liekopis:CistancheHerba. In: Liekopis Čínskej ľudovej republiky 1. brada. Med. Sci. Tlač, Peking, str. 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X a Zhang X: Echinakozid aCistanche tubulosa(Schenk)R. wight zmierňuje poškodenie semenníkov a spermií vyvolané bisfenolom A u potkanov prostredníctvom steroidogénnych enzýmov regulovaných osou gonád. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B a Ma X: Echinakozid, neoceniteľný prírodný produkt pri liečbe neurologických a iných porúch. Molekuly 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S a Muraoka O: Fenyletanoidové oligoglykozidy a acylované oligocukry s vazorelaxačnou aktivitou zCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S a Murad F: Oxid dusnatý aktivuje guanylátcyklázu a zvyšuje hladiny guanozín 3':5'-cyklického monofosfátu v rôznych tkanivových prípravkoch. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y a Ge RL: Antiproliferatívny účinok echinakozidu na bunky hladkého svalstva pľúcnej artérie potkana pri hypoxii. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ a Tu PF: Echinakozid vyvoláva relaxáciu závislú od endotelu v krúžkoch aorty potkana prostredníctvom NO-cGMP dráhy. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y a Ge RL: Echinakozid indukuje vazorelaxáciu pľúcnej artérie potkana otvorením NO-cGMP-PKG- BKca kanály a zníženie intracelulárnych hladín ca2 plus. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y a Higashi Y: Hodnotenie vazodilatácie nezávislej od endotelu: Od metodológie ku klinickým perspektívam. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J a derivát na endotelových bunkách ľudskej pupočníkovej žily proti poškodeniu vyvolanému oxidačným stresom: Zapojenie antioxidačných a signálnych dráh PI3k/Akt/eNOS/NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y a Okabe T: Src kináza sprostredkuje negenomickú aktiváciu signálnej kaskády závislú od androgénneho receptora vedúcu k endoteliálnej syntáze oxidu dusnatého . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y a Okabe T: Aktivácia endotelovej syntázy oxidu dusnatého vo vaskulárnych endotelových bunkách závislá od androgénneho receptora: Úloha fosfatidylinozitolu {{3} }kináza/Akt dráha.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F a Reno F: NO-závislá proliferácia a migrácia indukovaná vitamínom d v HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X a Xu X: Nadmerná expresia odpájacieho proteínu 2 inhibuje apoptózu ľudských endotelových buniek pupočníkovej žily indukovanú vysokou glukózou. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

Obr. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ a Klenk dc: Meranie bielkovín pomocou kyseliny bicinchonínovej. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H a Liu X: Biosyntéza triterpenoidov a transkripčná odpoveď vyvolaná oxidom dusnatým pri submerznej fermentáciiGanoderma lucidum. Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY a Gutterman dd: Hyperpolarizácia odvodená od endotelu a koronárna vazodilatácia: rozmanité a integrované úlohy epoxyekozatriénových kyselín, peroxidu vodíka a medzerových spojov. Mikrocirkulácia 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK a Gutterman dd: komunikácia je kľúčová: Mechanizmy medzibunkovej signalizácie pri vazodilatácii. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B a debret R: Snímanie endotelového mikroprostredia vedúce k vazodilatácii sprostredkovanej oxidom dusnatým: Prehľad nervových a biomechanických signálov. Oxid dusnatý 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS a Smith GJ: Androgénny receptor v ľudských endotelových bunkách. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H a Gui YT: Negenomické pôsobenie androgénov je sprostredkované rýchlou fosforyláciou a reguláciou smerovania androgénneho receptora. Cell Physiol Biochem 43: 223-236,2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP a Ghedini Pc: Aktivácia PI3K/Akt dráhy sprostredkovaná estrogénovými receptormi zodpovedá za estrónom indukovanú vaskulárna aktivácia cGMP signalizácie. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guoc, Zhangc, Yang Z a Li P: Antiosteoporotická aktivita echinakozidu u potkanov po ovariektómii. Fytomedicína 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y a Tu PF: Identifikácia farmakologických cieľov a analýza účinnosti fenyletanoidových glykozidov zCistanchesHerba založená na stratégii „cieľového rybolovu“. brada Tradit Herbal drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM a Zhang X: Echinakozid zvyšuje množstvo spermií u potkanov zacielením na hypotalamický androgénny receptor. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J a Woodgett JR: Proteínkináza B (c-Akt): Multifunkčný mediátor aktivácie fosfatidylinozitol 3-kinázy. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y a Qian J: Echinakozid zlepšuje hematopoetickú funkciu u myší s myelosupresiou vyvolanou 5-FU. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W a Zhou H: Ochranné účinky echinakozidu proti anoxii/reperfúznemu poškodeniu v bunkách H9c2 prostredníctvom up-regulácie p-AKT a SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P a Su Y: Kritická úloha Akt v kardiovaskulárnej funkcii. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.