Cistanche Tubulosa indukuje apoptózu primárnych a metastatických ľudských rakovinových buniek hrubého čreva sprostredkovanú reaktívnymi druhmi kyslíka

Afnan Saleh Al-Menhali, Safia Ali Jameela, Aishah A. Latiff, Mohamed A. Elrayess, Mohammed Alsayrafi, Morana Jaganjac

Antidopingové laboratórium Katar, Toxikológia a viacúčelové, Dauha, Katar.

Antidopingové laboratórium Katar, Life Science Research, Dauha, Katar.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

ABSTRAKT

Rakovina hrubého čreva je celosvetovo tretia najčastejšia rakovina. Konvenčné terapie preukázali miernu účinnosť so závažnými nežiaducimi účinkami, a preto existuje naliehavá potreba bezpečnejších alternatív. V tejto štúdii,Cistanchetubulosa, miestny názov Thanoon, bol považovaný za potenciálnu fytoterapeutickú stratégiu kvôli jeho známemu vysokému terapeutickému potenciálu v tradičnej medicíne a širokému množstvu v regióne Blízkeho východu. Bioaktívne zlúčeniny boli extrahované z práškuCistanchetubulosaa testované na ich protirakovinové vlastnosti proti štyrom hrubým črevámrakovinabunkové línie vrátane dvoch odvodených z primárneho nádoru (CaCo2 a HCT116) a dvoch odvodených z metastatického miesta (LoVo a SW620). ÚčinokCistanchetubulosaskúmala sa aj indukcia apoptózy a bunková redoxná homeostáza.Cistanchetubulosavykazovali koncentračne a časovo závislú inhibíciu proliferácie všetkých testovaných rakovinových bunkových línií o viac ako 60 percent po 72 hodinách liečby s 1 mg/ml surového extraktu. Inhibícia proliferácie bola poznačená indukciou apoptózy, intracelulárnou produkciou reaktívnych foriem kyslíka a mitochondriálnymi superoxidmi. Tieto údaje naznačujú, že Cistanche tubulosa je sľubným kandidátom na aditívnu liečbu rakoviny hrubého čreva. Toto je prvá štúdia, ktorá ukazuje protirakovinovú bioaktivitu Cistanche tubulosa proti bunkám rakoviny hrubého čreva.

Účinná látka zCistanchemáprotirakovinovéúčinok

skratky:

7-AAD, 7-amino-aktinomycín D;

CTE,Cistancheextrakt z tubulózy;

EMEM, Eagle's Minimum Essential Medium;

FBS, fetálne hovädzie sérum; DCF, 2,7-dichlórfluoresceín;

DCFH-DA, 2,7-dichlórdihydrofluoresceín diacetát;

DMEM, Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium;

DMSO, dimetylsulfoxid; MTT, 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazólium;

PE, fykoerytrín; RFU, jednotky relatívnej fluorescencie;

ROS, reaktívne formy kyslíka

ÚVOD

Kolorektálny karcinóm je celosvetovo jedným z najbežnejších druhov rakoviny (Brenner et al., 2014) a jeho výskyt neustále narastá s odhadovaným počtom 2,4 milióna prípadov v roku 2035 v dôsledku modernej stravy a životného štýlu spolu so zníženou fyzickou aktivitou. Súčasné úsilie nie je dostatočné na boj proti súčasnej epidémii kolorektálneho karcinómu, a preto sú potrebné nové prístupy na účinnú prevenciu a liečbu vrátane zmien životného štýlu v kombinácii s bezpečnejšími alternatívnymi zásahmi, ako sú fytoterapeutiká (Weidner et al., 2015). Fytoterapia, používanie liečivých rastlín na liečbu chorôb, bola nevyhnutnou súčasťou dávnej histórie ľudstva. Liečivé rastliny sa už dlho využívajú ako alternatívne zdroje liečby rakoviny a predstavujú viac ako šesťdesiat percent protirakovinových látok používaných v konvenčnej medicíne (Balunas a Kinghorn, 2005; Saibu et al., 2015). Niektoré z najznámejších príkladov zahŕňajú extrakty z Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) a Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg a Newman, 2005; da Rocha et al., 2001). Ukázalo sa, že niekoľko bylinných extraktov a fytochemikálií má protinádorové účinky pri kolorektálnom karcinóme, ktoré sa pripisuje indukcii produkcie reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a súvisiacej apoptóze rakovinových buniek, ako v prípade extraktov z Melissa officinalis (Weidner et al., 2015).

Cistanchedeserticola má inhibičný účinokbunkaapoptóza

Medzi kandidátmi na fytoterapiuCistanchetubulosa, parazitická púštna rastlina z Orobanchaceae (Jiang et al., 2009), ktorá je široko rozšírená v suchých a polosuchých oblastiach Afriky, Ázie a Stredomoria, má cenné liečivé vlastnosti.Cistanchetubulosa sa vo veľkej miere používa v tradičnej medicíne a predpokladá sa, že má liečivé účinky pri nedostatku obličiek, chorobnej leukoree, metrorágii, ženskej neplodnosti a stareckej zápche (Jiang et al., 2009). Cistanche Tubulosa boli v poslednom desaťročí intenzívne študované vrátane vazorelaxačných (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotektívnych (Morikawa et al, 2010), antihyperglykemických a hypolipidemických účinkov (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosawas sa tiež navrhuje ako silný posilňovač imunitného systému, promótor tvorby kostí a prostriedok proti starnutiu a únave (Xu et al., 2014). Okrem toho sa ukázalo, že extrakt z Cistanche tubulosa blokuje ukladanie amyloidu v modeli Alzheimerovej choroby (Wu et al., 2015). Napriek rôznym terapeutickým použitiam sa účinok Cistanche Tubulosa ako potenciálneho protirakovinového činidla ešte neskúmal.

V tejto práci sme skúmali protirakovinové účinkyCistancheTubulosa na dvoch primárnych a dvoch metastatických bunkových líniách rakoviny hrubého čreva a potenciálne mechanizmy, ktoré sú základom tohto účinku.

MATERIÁLY A METÓDY

Zber a príprava rastlinného extraktu

Vzorky zCistanchetubulosa boli zozbierané z púštnych oblastí v Katare počas roku 2014 a pravosť rastliny potvrdil herpetológ. Vzorky poukážok sú archivované na Toxikologickom a viacúčelovom oddelení v ADLQ. Vzorky rastlín vysušené na slnku sa rozomleli pomocou Retsch Knife Mill Grindomix GM300 na jemný prášok. Dvadsať gramov prášku sa extrahovalo s 200 ml ultračistej vody cez noc pri 37 stupňoch na rotačnej trepačke pri 200 pm. HrubéCistancheExtrakty tubulosa (CTE) sa centrifugovali 3 0 min pri 8000 ot./min., aby sa peletovali nerozpustné zlúčeniny, supernatant sa zhromaždil a lyofilizoval s použitím Labconco Freezone 6 plus Freeze dryer. Vysušený extrakt sa rekonštituoval v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM, SIGMA, Nemecko) na koncentráciu 20 mg/ml a sterilne sa prefiltroval cez 0,{7}}mikrónový membránový filter.

Bunkové línie a bunková údržba

Bunkové línie ľudského karcinómu hrubého čreva CaCo2, SW620 a LoVo boli získané od Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Nemecko), zatiaľ čo bunková línia HCT 116 bola láskavým darom z oddelenia biologických a environmentálnych vied na Katarskej univerzite. CaCo2 a HCT11 boli odvodené z primárneho miesta karcinómu hrubého čreva, zatiaľ čo SW620 a LoVo boli odvodené z metastatického miesta. Bunky SW620, HCT116 a LoVo sa kultivovali a udržiavali v médiu DME, zatiaľ čo bunky CaCo2 sa udržiavali v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu (EMEM, SIGMA, Nemecko). Bunky sa pestovali ako monovrstva kultivovaná pri 37 stupňoch v príslušnom médiu doplnenom 10 percentami fetálneho hovädzieho séra (FBS, SIGMA, Nemecko) a 1 percentom penicilínu/streptomycínu (SIGMA, Nemecko) vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 percent oxidu uhličitého.

Test životaschopnosti buniek

Test {{0}}[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazólia (MTT) sa použil na vyhodnotenie cytotoxickej aktivity CTE podobne, ako je opísané skôr (Jaganjac et al., 2010). Hustota očkovania buniek CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo buniek kultivovaných v 96-jamkových doštičkách bola 104 buniek na jamku. Bunky boli nanesené do príslušného média doplneného 10 percentami FBS 24 hodín pred ošetrením. Po 24 hodinách sa médium odstránilo a bunky sa ošetrili s 0, 0,25, 0,5, 1 a 2 mg/ml CTE počas 24, 48 a 72 hodín pri 37 stupňoch vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 percent C02. Po ošetrení CTE sa médium odstránilo a do každej jamky sa pridalo 40 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml).

Po 3 hodinách inkubácie sa roztok MTT odstránil, formazanový produkt sa rozpustil v dimetylsulfoxide (DMSO, SIGMA, Nemecko) a merala sa absorbancia pri 590 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Švajčiarsko).

Test apoptózy

Apoptóza v bunkách CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo bola detegovaná pomocou PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I s 7-amino-aktinomycínom D (7-AAD) ako životne dôležitým farbivom (Becton Dickinson International, Belgicko) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, bunky sa naočkovali na 24-jamkové platne v hustote 5x104 bunky/jamku v príslušnom médiu doplnenom 10 percentami FBS počas 24 hodín pred pridaním CTE (0, 0,5, alebo 1 mg/ml). Po 24 CTE inkubácii sa bunky zozbierali, dvakrát sa premyli studeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom a farbili sa fykoerytrínom (PE) annexinom V a 7-AAD počas 15 minút pri teplote miestnosti v tme. Zafarbené bunky sa analyzovali do 1 hodiny prietokovou cytometriou s použitím FACS. Prietokový cytometer Aria III a softvér FACSDiva (Becton Dickinson) pri nízkej prietokovej rýchlosti s minimálne 104 bunkami. Ošetrenie buniek počas 4 hodín 6 uM kamptotecínu (SIGMA) sa použilo ako pozitívna kontrola pre test.

Intracelulárna produkcia ROS

Intracelulárna produkcia ROS bola skúmaná pomocou 2,7-dichlórdihydrofluoresceín diacetátu (DCFH-DA, SIGMA, Nemecko). DCFH-DA je nefluorescenčná sonda, ktorá sa oxiduje intracelulárnym ROS na fluorescenčnú zlúčeninu 2,7-dichlórfluoresceín (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Test DCFH DA sa uskutočnil podobne, ako sme opísali predtým (Cindric a kol., 2013; Poljak-Blazi a kol., 2011). Stručne, hustota naočkovania buniek CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo kultivovaných v 96-jamkových čiernych platniach bola 104 buniek na jamku. Bunky sa umiestnili do príslušného média doplneného 10 percentami FBS na 24 hodín. Pred ošetrením sa bunky inkubovali s 10 uM DCFH-DA pri 37 stupňoch počas 30 minút v 5 percentách CO2/95 percentách vzduchu. Bunky sa potom premyli a ošetrili s 0, 0,5 a 1 mg/ml CTE v médiu bez fenolovej červene. Intracelulárna tvorba ROS sa monitorovala nepretržite počas 25 hodín pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2 s použitím čítačky mikrodoštičiek s horným modulom fluorescencie a plynu (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švajčiarsko). Intenzita fluorescencie sa merala pri excitačnej vlnovej dĺžke 500 nm a emisnej detekcii pri 529 nm. Arbitrážne jednotky, relatívne fluorescenčné jednotky (RFU), boli založené priamo na intenzite fluorescencie.

Generovanie mitochondriálneho superoxidu

Schopnosť CTE indukovať tvorbu superoxidu mitochondriami sa odhadla pomocou sondy MitoSOX Red (Life Technologies) a Hoechst 33342 na farbenie jadier (Life Technologies), ktorá je priepustná pre bunky a je zacielená na mitochondrie. Bunky CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo sa vysiali na 96-jamkové platne v hustote 104 buniek na jamku v príslušnom médiu doplnenom 10 percentami FBS počas 24 hodín. Bunky sa potom naplnili 4 uM MitoSOX a 2 uM Hoechst 33342 počas 20 minút, nadbytok farbiva sa premyl a jamky sa ošetrili 0, 0,5 a 1 mg/ml CTE počas 24 hodín pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2. Intenzita fluorescencie sa merala pri excitačnej vlnovej dĺžke 510 nm a emisnej detekcii pri 580 nm pre MitoSOX a excitačnej vlnovej dĺžke 350 nm a emisnej detekcii pri 461 nm pre Hoechst 33342 pomocou čítačky mikrodoštičiek so špičkovou fluorescenciou (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švajčiarsko).

Štatistická analýza

Opisné štatistiky boli uvedené ako priemer plus /- SD. Významnosť rozdielov medzi skupinami bola hodnotená pomocou Studentovho t-testu a Chi-kvadrát testu. Keď sa porovnávali viac ako dve skupiny, použili sme jednostrannú ANOVA s príslušným post hoc testovaním. Bol použitý SPSS 11.{5}}1 pre Mircosoft Windows. Rozdiely s P menším ako 0,05 sa považovali za štatisticky významné.

Cistanchemáprotirakovinovévlastnosti a zlepšujeimunita

VÝSLEDKY

Účinok CTE na proliferáciu ľudských bunkových línií rakoviny hrubého čreva je znázornený na obrázku 1. Všetky testované koncentrácie CTE vykazovali silný inhibičný účinok na bunkovú líniu CaCo2 v závislosti od koncentrácie a času (obrázok 1A). Sedemdesiatdva hodín liečby CTE inhibovalo rast buniek CaCo2 o viac ako 60 percent v porovnaní s kontrolou (p < 0.05="" pre="" všetky="" koncentrácie).="" významný="" vplyv="" liečby="" cte="" na="" rast="" buniek="" hct116="" bol="" tiež="" zistený="" vo="" všetkých="" časových="" bodoch="" pri="" dvoch="" najvyšších="" koncentráciách="" (1="" mg/ml="" a="" 2="" mg/ml),="" pričom="" v="" druhom="" prípade="" sa="" dosiahlo="" zníženie="" o="" viac="" ako="" 70="" percent="" koncentrácia="" (obrázok="" 1b,="" p="">< 0,05).="" hoci="" dve="" nižšie="" koncentrácie="" cte="" (0,25="" a="" 0,5="" mg/ml)="" významne="" znížili="" rast="" buniek="" hct116="" po="" 24="" hodinách=""><0.05), they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" 72="" hours="" treatment="" compared="" to="" control="" (p="">{{0}}.{{10}}5). Inhibícia proliferácie pomocou CTE závislá od času a koncentrácie sa ďalej potvrdila v LoVo bunkách o viac ako 60 percent pri najvyššej koncentrácii (p < 0.05)="" (obrázok="" 1c)="" a="" všetky="" štyri="" testované="" koncentrácie="" cte="" znížili="" rast="" buniek="" sw620="" po="" 48="" hodinách="" (obrázok="" 1d,="" p="">< 0,05="" pre="" všetky).="" po="" 72="" hodinách="" liečby="" sa="" rovnaký="" účinok="" pozoroval="" len="" pri="" dvoch="" najvyšších="" koncentráciách="" (p="">< 0,05),="" zatiaľ="" čo="" koncentrácie="" 0,25="" a="" 0,5="" mg/ml="" nevykazovali="" žiadny="" významný="" účinok="" v="" porovnaní="" s="" kontrolou="" (p=""> 0,05). Vplyv liečby 0,5 a 1 mg/ml CTE na indukciu apoptózy sa ďalej testoval vo všetkých štyroch bunkových líniách (obrázok 2). Zvýšený počet buniek v skorej apoptóze bol detegovaný v HCT116 a LoVo po 24-hodinovom ošetrení 0,5 mg/ml (p<0.05, figure="" 2b="" and="" 2c)="" and="" in="" all="" cell="" lines="" at="" 1="" mg/ml=""><0.05). a="" significant="" increase="" in="" necrotic="" or="" late="" apoptotic="" cell="" number="" was="" further="" observed="" in="" caco2="" and="" sw620="" cell="" lines=""><0.05, figure="" 2a="" and="" 2d).="" the="" ability="" of="" cte="" to="" induce="" intracellular="" ros="" production="" is="" demonstrated="" in="" figure="" 3.="" three="" hours="" following="" cte="" treatment="" there="" was="" a="" strong="" increase="" in="" intracellular="" ros="" production="" in="" all="" cell="" lines=""><0.05). the="" intracellular="" ros="" production="" increased="" progressively="" throughout="" the="" 25="" hours="" of="" treatment="" in="" a="" time="" and="" concentration-dependent="" manner.="" furthermore,="" staining="" of="" cells="" with="" mitochondria-targeted="" probe="" revealed="" a="" strong="" impact="" of="" cte="" on="" mitochondrial="" superoxide="" production="" in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 4).="" the="" highest="" increase="" in="" superoxide="" production="" by="" mitochondria="" was="" observed="" in="" hct116="" (69%,="" figure="" 4b)="" and="" lovo="" cells="" (82%,="" figure="" 4c)="" following="" 24="" hours="" of="" treatment="" with="" 1="" mg/ml="" of="">

DISKUSIA

Hoci predchádzajúce štúdie uvádzali početné liečivé vlastnostiCistanchetubulosa, toto je prvá správa o jeho antiproliferatívnom účinku v malígnych bunkách. Bioaktívne zlúčeniny Cistanchetubulosa extrahované vodou, vysoko polárnym rozpúšťadlom, vykazovali silnú protirakovinovú bioaktivitu. Predtým sme porovnávali účinnosťCistanchetubulosa solubilizovaná vo vode proti iným rozpúšťadlám, ako je metanol a etylacetát, ale vodné extrakty vykazovali najsľubnejšie protirakovinové aktivity (údaje nie sú uvedené).

Preukázali sme schopnosť CTE pri 1 mg/ml a 2 mg/ml inhibovať 60 percent rastu primárnych aj metastatických bunkových línií rakoviny hrubého čreva, čo odhaľuje potenciálne dôležitú úlohu Cistanche tubulosa ako liečby rakoviny hrubého čreva. V porovnaní s normálnymi bunkami sú rakovinové bunky vo všeobecnosti charakterizované poruchou redoxnej homeostázy a bežnou stratégiou súčasných protirakovinových terapií je zvýšenie bunkového oxidačného stresu (Yang et al, 2013). Hoci fyziologicky nízke hladiny ROS majú dôležitú úlohu ako signálne molekuly, nadmerná produkcia ROS môže prispieť k nestabilite a malignancii rakoviny (Liou a Storz, 2010). Paradoxne, táto nerovnováha v bunkovej redoxnej homeostáze spôsobuje, že rakovinové bunky sú zraniteľnejšie voči bunkovej smrti indukovanej ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira a Hay, 2013). Antiproliferatívny účinok CTE uvádzaný v tejto štúdii môže byť sprostredkovaný rôznymi extra- a intracelulárnymi mechanizmami známych a neznámych zlúčenín v extrakte, ktoré sa zameriavajú na viaceré dráhy, ktoré hrajú zásadnú úlohu v apoptóze. Aby sme rozlíšili medzi rôznymi spôsobmi bunkovej smrti, skúmali sme potenciálny mechanizmus zodpovedný za pozorovanú cytotoxicitu indukovanú CTE.

Naše údaje naznačujú, že CTE zvyšuje intracelulárnu produkciu ROS a následne ROS-indukovanú bunkovú smrť. Redoxný stav bunky tiež hrá kľúčovú úlohu pri regulácii apoptózy a mitochondriálny elektrónový transportný reťazec je jedným z hlavných miest bunkovej tvorby ROS (Trachootham et al., 2008). Okrem toho by intracelulárny ROS mohol spôsobiť bunkovú apoptózu prostredníctvom mitochondrií závislých aj nezávislých dráh (Sinha et al., 2013). Naše údaje tiež naznačujú, že externalizácia fosfatidylserínu indukovaná CTE, bežný účinok pri apoptóze, v primárnych aj metastatických rakovinových bunkových líniách, čo naznačuje, že mechanizmus smrti indukovanej CTE je sprostredkovaný skôr apoptózou než nekrózou. Aktivácia apoptózy v rakovinových bunkách je korekčnou stratégiou a mnohé protirakovinové lieky môžu mať apoptotické účinky v rakovinových bunkách.

Zlúčeniny alebo extrakty s proapoptickými aktivitami v rakovinových bunkách sú preto potenciálne užitočné pri výskume protirakovinových liekov (Wong, 2011). Aby sme určili, či proapoptotický účinok indukovaný CTE je sprostredkovaný mechanizmom ROS indukovaným mitochondriami, merali sme produkciu superoxidu pomocou fluorescenčnej sondy zacielenej na mitochondrie v bunkách ošetrených CTE. Naše údaje jasne ukazujú, že CTE stimuluje produkciu mitochondriálneho superoxidu, čo naznačuje, že protirakovinová aktivita Cistanche tubulosa je aspoň čiastočne sprostredkovaná mechanizmom ROS vyvolaným mitochondriami.

Cistanchemáprotirakovinovéapečeňochranuúčinky

ZÁVERY

Na záver, naše údaje naznačujú, že vodný extrakt z púštnej rastliny Cistanche tubulosa môže predstavovať sľubného kandidáta na protirakovinový prístup v kombinácii s inými konvenčnými terapiami na prevenciu a liečbu rakoviny hrubého čreva. Tiež demonštrujeme, že toxicita rastlinného extraktu proti rakovinovým bunkám je sprostredkovaná zvýšenou intracelulárnou produkciou ROS a aspoň čiastočne apoptózou závislou od mitochondrií. Prebiehajú ďalšie štúdie s cieľom izolovať a charakterizovať jednotlivé biologicky aktívne zložky zodpovedné za protirakovinovú aktivitu.

Na vyhodnotenie potenciálneho použitia tohto extraktu ako účinného chemopreventívneho činidla a na pochopenie mechanizmov účinku na bunky rakoviny hrubého čreva na molekulárnej úrovni je potrebný ďalší výskum. Na potvrdenie pozorovaných priaznivých zdravotných účinkov Cistanche tubulosa na prevenciu rakoviny sú potrebné aj ďalšie predklinické a klinické štúdie.

POĎAKOVANIE

Finančná podpora a sponzorstvo

Túto štúdiu podporilo Antidopingové laboratórium Katar.

Konflikt záujmov:

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

LITERATÚRA

Balunas MJ, Kinghorn, AD. Objav liečiv z liečivých rastlín. Life Sci. 2005;78:431-41.

Brenner H, Kloor M, Pox CP. Kolorektálny karcinóm. Lancet 2014;383,1490-502.

Cindric M, Cipak A, Zapletal E, Jaganjac M, Milkovic L, Waeg G, Stolc S, Zarkovic N, Suzana Borovic S. Stobadine zmierňuje poškodenie modelu črevnej bariéry spôsobené 4-hydroxynonenalom. Toxicol In Vitro. 2013; 27:426-32.

Cragg GM, Newman DJ. Rastliny ako zdroj protirakovinových látok.J Ethnopharmacol. 2005;100:72-9.da

Rocha AB, Lopes RM, Schwartsmann G. Prírodné produkty v protinádorovej terapii. CurrOpinPharmacol. 2001;1:364-9.

Jaganjac M, Matijevic T, Cindric M, Cipak A, Mrakovcic L, Gubisch W, Zarkovic N. Indukcia CMV-1 promótora pomocou 4-hydroxy-2-nominálu v ľudských embryonálnych obličkových bunkách. Acta Biochim Pol. 2010;57:179-83.

Jaganjac M, Poljak-Blazi M, Zarkovic K, Schaur RJ, Zarkovic N. Zapojenie granulocytov do spontánnej regresie Walker 256 karcinómu. Cancer Lett. 2008; 260:180-6.

Jiang Y, Tu PF. Analýza chemických zložiek v druhoch Cistanche. J Chromatogr A. 2009;1216:1970-9.Liou GY, Storz P. Reaktívne formy kyslíka pri rakovine. Free Radic Res. 2010;44:479-96.

Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, Yoshikawa M, Yuan D, Muraoka O. Acylované fenyletanoidové oligoglykozidy s hepatoprotektívnou aktivitou z púštnej rastliny Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem. 2010;18:1882-90.

Nogueira V, Hay N. Molekulárne dráhy: homeostáza reaktívnych foriem kyslíka v rakovinových bunkách a dôsledky pre terapiu rakoviny. Clin Cancer Res. 2013; 19:4309-14.

Poljak-Blazi M, Jaganjac M, Sabol I, Mihaljevic B, Matovina M, Grace M. Vplyv železitých iónov na tvorbu reaktívnych foriem kyslíka, rast bunkových línií rakoviny krčka maternice a expresiu onkogénu E6/E7. Toxicol In Vitro. 2011; 25:160-6.

Saibu GM, Katerere DR, Rees DJG, Meyer M. In vitro cytotoxické a proapoptotické účinky vodných extraktov listov a cibúľ Tulbaghia violacea. J Ethnopharmacol. 2015;164:203-9.

Sinha K, Das J, Pal PB, Sil PC. Oxidačný stres: mitochondriálne závislé a mitochondriálne nezávislé dráhy apoptózy. Arch Toxicol.2013; 87:{4}}.

Trachootham D, Lu W, Ogasawara MA, Nilsa RD, Huang P. Redoxná regulácia prežitia buniek. Antioxidačný redoxný signál. 2008; 10:1343-74.

Weidner C, Rousseau M, Plauth A, Wowro SJ, Fischer C, Abdel-Aziz H, Sauer S. Extrakt z Melissa officinalis indukuje apoptózu a inhibuje proliferáciu v bunkách rakoviny hrubého čreva prostredníctvom tvorby reaktívnych foriem kyslíka. Fytomedicína. 2015; 22:262-70.

Wong RS. Apoptóza pri rakovine: od patogenézy po liečbu. J Exp. Clin Cancer Res. 2011;30:87.

Wu SH, Chou FP, Chyau CC, Chen JH, Tu SF, Lin HH. Protirakovinové účinky extraktu Wasabia japonica v bunkách rakoviny pečene Hep3B prostredníctvom akumulácie ROS, poškodenia DNA a apoptózy sprostredkovanej p73-. J Funct Foods. 2015;14:{11}}.

Xiong WT, Gu L, Wang C, Sun HX, Liu X. Antihyperglykemické a hypolipidemické účinky Cistanche tubulosa u diabetických DB/DB myší typu 2. J Ethnopharmacol. 2013; 150:935-45

Xu R, Sun S, Zhu W, Xu C, Liu Y, Shen L, Shi Y, Chen J. Viacstupňové infračervené makro-odtlačkové vlastnosti etanolových extraktov z rôznych druhov Cistanche v Číne v kombinácii s HPLC odtlačkom prsta. J Mol Struct. 2014;1069:236-244.

Yang Y, Karakhanova S, Werner J, Bazhin AV. Reaktívne formy kyslíka v biológii rakoviny a protirakovinovej terapii. Curr Med Chem. 2013; 20:3677-92.

Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, Muraoka O. Fenyletanoidné oligoglykozidy a acylované oligocukry s vazorelaxačnou aktivitou z Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem. 2006;14:7468-75.