Cistanche Tubulosa chráni dopaminergné neuróny prostredníctvom regulácie apoptózy a neurotrofického faktora odvodeného z gliových buniek: in vivo a in vitro-Ⅰ

ÚVOD

Parkinsonova choroba (PD) je bežné neurodegeneratívne ochorenie vyskytujúce sa u starších ľudí s patologickými prejavmi straty dopaminergných neurónov v substantia nigra (SN) v dôsledku degenerácie. Závažnosť ochorenia koreluje so stratou dopamínových (DA) neurónových buniek v SN, čo je v súlade s názorom, že neurodegeneratívny proces postupuje mnoho rokov predtým, ako sa objavia akékoľvek príznaky (Sawle a Myers, 1993). Progresívna povaha ochorenia naznačuje zaujímavé možnosti terapeutického zásahu blokovaním základného neurodegeneratívneho procesu. Hľadanie terapiou indukovaných silných a špecifických účinkov neurotrofických faktorov na prežitie DA neurónov je preto veľmi zaujímavé.

PRÍRODNÉ CISTANCHE TUBULOSA PRE OCHRANU DOPAMINERGICKÝCH NEURÓNOV PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Neurotrofické faktory sú esenciálne proteíny, vrátane nervového rastového faktora (NGF), neurotrofického faktora odvodeného z mozgu (BDNF) a neurotrofického faktora odvodeného od gliálnych buniek (GDNF), ktoré podporujú rast nervov, neurologický vývoj, axonálne vedenie a funkciu neurónov. Spomedzi všetkých neurotrofických faktorov, ktoré chránia a podporujú opravu dopaminergných neurónov, má GDNF najsilnejšie účinky (Hong a kol., 2008; Rangasamy a kol., 2010; Allen a kol., 2013). Ukázalo sa, že GDNF má silné neurotrofické účinky na DA neuróny in vitro (Lin a kol., 1993) a má neuroprotektívne účinky in vivo. Ukázalo sa, že GDNF zachraňuje nigrálne DA neuróny pred bunkovou smrťou vyvolanou léziami po chirurgickej alebo toxínom indukovanej axotómii u potkanov (Beck a kol., 1995; Kearns a Gash, 1995; Sauer a kol., 1995) a čiastočne aj po systémové podávanieN-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridín (MPTP)u myší (Tomac a kol., 1995). Zvýšený výskyt neuronálnej apoptózy a znížené ochranné účinky neurotrofických faktorov, potenciálne spúšťané rôznymi patologickými faktormi, sú základom degenerácie dopamínergných neurónov (Holden et al., 2006).

C. tubulosa je bylinný liek pochádzajúci z niekoľkých rastlín rodu Cistanche. Je to hlavná terapeutická možnosť pre syndróm obličkovej nedostatočnosti, ktorý úzko súvisí s androgénnymi hormónmi v tradičnej čínskej medicíne (TCM). K dnešnému dňu mnohé klinické a základné výskumy C. tubulosa preukázali aktivitu neurodegeneratívnych ochorení. Identifikácia receptov TCM na tonizáciu obličiek pri liečbe PD tak môže poskytnúť alternatívnu klinickú liečbu PD.Echinakozid (ECH)je hlavnou bioaktívnou zložkou, ktorá sa nachádza v liečivej byline C. tubulosa. Štúdie preukázali terapeutické účinky glykozidov Cistanche a ECH,verbaskozid(VER) a icariin (ICA) u pacientov s Alzheimerovou chorobou (AD), PD a inými pacientmi s vaskulárnou demenciou (Urano a Tohda, 2010; Wang a kol., 2013; Wu a kol., 2014). Wu a kol. (2014) navrhli, že extrakty C. tubulosa, ktoré obsahovali dostatok ECH a akteozidu, zlepšili kognitívnu dysfunkciu spôsobenú A -42 prostredníctvom blokovania depozície amyloidu a zvrátenia cholinergnej a hipokampálnej dopaminergnej neuronálnej funkcie. Tao a kol. (2015) to zistilifenyletanoidové glykozidyz C. tubulosa (Ph Gs-Ct) zabránili vysokohorskému edému mozgu znížením expresie proteínu a mRNA AQP4 v mozgovom tkanive potkaních modelov.

PRÍRODNÉ OBJÍDKY S EXTRAKTOM CISTANCHE TUBULOSA ZLEPŠUJÚ PAMÄŤ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Predchádzajúce štúdie ukázali, že čínske bylinné zlúčeniny, vrátane troch zložiek C. tubulosa, epimedium a rhizoma polygonati, zmiernili poškodenie dopamínergných neurónov a zvýšili hladiny dopamínu reguláciou expresie neurotrofických faktorov (Wu et al., 2013). Zatiaľ teda nie je známe, či sú neuroprotektívne účinky vyvolané C. tubulosa dlhodobé a do akej miery môže záchrana nigral DA neurónov podaním GDNF poskytnúť významné zachovanie motorického správania relevantného pre symptomatológiu PD zvierat. V tejto štúdii sa použil recept TCM na tonizáciu obličiek, nanoprášok C. tubulosa, ktorý získal národný patent (číslo patentu: 2011103028541) v Číne a už predtým preukázal určitý terapeutický účinok pri PD. Táto štúdia bola preto navrhnutá tak, aby skúmala neuroprotektívne a regeneračné účinky liečby C. tubulosa a skúmala apoptózu na MES23.5 bunkách a behaviorálnych definitívnych potkanoch a reguláciu GDNF, ako sa meralo pomocou série cieľových testov. .

MATERIÁLY A METÓDY

Materiály, činidlá a vybavenie

C. tubulosa bola zakúpená od Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Peking, Čína. ECH, VER a ICA pochádzajú z Národného inštitútu pre kontrolu potravín a liečiv v Číne. Dopamínergná neurónová bunková línia MES23.5 bola darom od profesora Biao Chena, Laboratórium neurobiológie, Capital Medical University, Peking, Čína. Päťdesiat samcov myší C57BL/6 (každý s hmotnosťou 20 až 25 g) bolo zakúpených od spoločnosti Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (číslo licencie: SCXK2012-0002), Šanghaj, Čína.

MPP+, MTT a glutamín boli zakúpené od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); DMEM/F12 médium a fetálne bovinné sérum boli zakúpené od Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); a štandard MPTP, DA a štandard kyseliny homovanilovej (HVA) boli zakúpené od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -aktín, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF rodina receptora alfa (GFR 1) a protilátky Ret boli zakúpené od Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); Súprava 3,3'-diaminobenzidínu (DAB) farbiaceho činidla bola zakúpená od Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Čína); a súprava na prípravu vzorky gélu SDS-PAGE, súprava na detekciu ultrasenzitívnej zosilnenej chemiluminiscencie (ECL) a test s kyselinou bicinchonínovou (BCA) boli zakúpené od Beyotime Institute of Biotechnology (Peking, Čína).

V tejto štúdii sa použili nasledujúce prístroje: čítačka mikrodoštičiek ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 inkubátor (Heraeus, Hanau, Nemecko); Gél DOC 2000 gélový zobrazovací analytický systém, elektroforéza a elektroforéza nádrž (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650 proteínový analyzátor (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R vysokorýchlostná chladená odstredivka (Eppendorf, Hamburg, Nemecko); SXQM duálny planétový guľový mlyn (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Čína); MM400 miešací mlyn (Retsch GmbH, Haan, Nemecko); Agilent 1200 vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); Elektroforéza PowerPac Basic, systém transmembránového prenosu PowerPac Basic, chemiluminiscenčný zobrazovač Universal Hood II, systém reverznej transkripcie RNA S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad); Systém analýzy obrazu tkaniva a buniek Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Čína).

PrípravaC. tubulosaNanoprášok

C. tubulosa bola odvážená, potom purifikovaná a dehydratovaná. Po bežnom rozdrvení na prášok sa jemný prášok C. tubulosa preosial cez 200-sito a vysušil sa vymrazením. Na prípravu nanoprášku C. tubulosa sa použil vákuový a vysokoenergetický guľový mlyn s riadenou teplotou. Najprv sa surový nanoprášok C. tubulosa umiestnil do vákuovej guľovej mlecej nádrže, ktorá bola naplnená karbidovými mlecími guľami. Pomer medzi mlecími guľôčkami a nanopráškom C. tubulosa sa pohyboval od 15:1 do 5:1. Na získanie jemného prášku sa rýchlosť a trvanie vysokoenergetického guľového mlyna nastavili na 300 otáčok za minútu a 20 minút. Jemný prášok bol odvážený na spracovanie nanomateriálov a spracovaný v miešacom mlyne s frekvenciou 25/sa osciláciou 20s pre tri opakovania. PBS sa použil na rozpustenie a prípravu 25 mg/ml zásobného roztoku, po čom nasledovala 30 minútová ultrasonikácia, autoklávovanie a nakoniec skladovanie pri -20 °C.

Kontrola kvality aktívnych zložiekC. tubulosapomocou HPLC

ECH a VER obsahovali gradientovú elúciu s oktadecylsilánom viazaným oxidom kremičitým ako plnivom, metanolom ako mobilnou fázou A a 0,1 % roztokom kyseliny mravčej ako mobilnou fázou B. Detekčná vlnová dĺžka bola 330 nm. ICA obsahovala gradientovú elúciu s oktadecylsilánom viazaným oxidom kremičitým ako plnivom a zmesou acetonitril-voda (30:70) ako mobilnou fázou. Detekčná vlnová dĺžka bola 270 nm. Vzorka, kontrola a negatívna kontrola boli namerané po 10 ul pre test.

Bunková kultúra a MTT test na meranie životaschopnosti MPP+- Ošetrené bunky

Bunky MES23.5 sa naočkovali 5 % fetálnym teľacím sérom, 1 % glutamínom, 2 % 50x Satoov roztok a médium DMEM/F12 s 2 % penicilín/streptomycín. Boli inkubované pri 37 °C v 5% CO2 inkubátore s nasýtenou vlhkosťou. Bunky boli izolované a pasážované s 0,25 % trypsínom a bunková suspenzia bola zozbieraná v logaritmickej rastovej fáze. Izolované bunky s hustotou 1 × 105 sa naočkovali do polylyzínom potiahnutých 96-jamkových platní, po ktorých nasledovalo pridanie rôznych konečných koncentrácií (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 a 800 µmol/l ) médií MPP+. Bunky MES23.5, ktoré sa inkubovali s normálnym kultivačným médiom počas 24 hodín a 48 hodín, sa použili ako negatívne kontroly v experimentoch in vitro. Bunky z rôznych liečebných skupín boli inkubované s MTT činidlom počas 4 hodín. Roztok v jamkách sa následne zlikvidoval a pridalo sa 150 ul DMSO a oscilovalo sa 10 minút. Absorbancia každej vzorky pri vlnovej dĺžke 570 nm sa merala pomocou automatickej čítačky mikrodoštičiek. Percento bunkovej životaschopnosti (%)=priemerná absorbancia experimentálnej skupiny/priemerná absorbancia negatívnej kontrolnej skupiny × 100 %.

Príslušné koncentrácie média MPP+ sa pridali na 24-hodinové ošetrenie v bunkách MES23.5 použitím rovnakého prístupu ako pri kultúre in vitro. Po ošetrení sa roztok v jamke zlikvidoval. Médium obsahujúce rôzne koncentrácie (10, 50, 100, 200, 250, 500 a 1000 ug/ml) nanoprášku C. tubulosa sa pridalo k bunkám MES23.5 v rôznych jamkách a nechalo sa inkubovať 24 hodín a 48 hodín. Bunky MES23.5, ktoré sa inkubovali s normálnym kultivačným médiom počas 24 hodín a 48 hodín, sa použili ako negatívne kontroly. Ako vehikulum sa použili bunky MES23.5, ktoré boli inkubované s MPP+ médiom. Merania sa uskutočňovali trojmo pre každú vzorku. Merala sa absorbancia zodpovedajúcich liečených a kontrolných skupín, aby sa vypočítala životaschopnosť buniek.

PRÍRODNÝ EXTRAKT Z CISTANCHE TUBULOSA PROTI ÚNAVE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Expresia TH meraná imunocytochémiou

Keď bol nanoprášok C. tubulosa v 100, 200 a 250 ug/ml, miera prežitia buniek sa výrazne zvýšila (obrázok 2G). V nasledujúcich experimentoch sme teda testovali tri koncentrácie: skupiny s nízkou dávkou, strednou dávkou a vysokou dávkou. Pre každú zo skupín C. tubulosa boli testované tri replikácie. Sterilizované krycie sklíčka potiahnuté polylyzínom sa umiestnili do 6-jamkových platní. Ďalej sa do každej jamky naočkovalo 5 x 104 buniek a inkubovalo sa 24 hodín. Bežné čerstvé médium sa nahradilo v normálnej kontrolnej skupine a konečná koncentrácia 100 umol/l média MPP+ sa nahradila v zostávajúcich liečebných skupinách, aby sa inkubovali 24 hodín. Konvenčné čerstvé médiá sa potom nahradili v normálnych kontrolných skupinách a skupinách s vehikulom a konečné koncentrácie 100, 200 a 250 ug/ml nanoprášku C. tubulosa sa inkubovali s bunkami počas 24 hodín v nízkej, strednej a vysokej dávke. skupiny liečené C. tubulosa, resp. Bunky MES23.5 v rôznych skupinách sa trikrát premyli v PBS, aby sa odstránil supernatant a ďalej sa fixovali v 4% paraformaldehyde počas 15 minút. Po premytí PBS sa bunky inkubovali s blokátorom peroxidázy pri 37 °C počas 30 minút a potom sa znova premyli PBS. Na permeabilizáciu buniek počas 10 minút sa použil 0,2 % roztok Triton X{30}}, po ktorom nasledovalo premytie PBS. Do každej vzorky sa pridalo normálne kozie sérum a inkubovalo sa pri teplote miestnosti 30 minút. Normálne kozie sérum sa potom odstránilo a ku každej vzorke sa pridala primárna protilátka zriedená 1:400 v PBS a inkubovala sa pri 4 °C cez noc. Bunky v negatívnej kontrolnej skupine boli cez noc inkubované s PBS pri 4 °C. Po premytí PBS sa bunky inkubovali so sekundárnymi protilátkami značenými biotínom vo vlhkej komore pri 37 °C počas 20 minút. Každá vzorka sa potom premyla v PBS a označila konjugátmi chrenovej peroxidázy-streptavidínu (pracovný roztok C) pri 37 °C počas 20 minút. Po premytí PBS boli bunky zafarbené DAB činidlom v tme približne 1-10 minút a vývoj hnedej farby bol sledovaný pod svetelnou mikroskopiou. Každá vzorka sa potom dvakrát premyla v destilovanej vode počas 1 až 2 minút a jadrá sa kontrastne zafarbili roztokom hematoxylínu počas 0, 5 až 1 minúty. Po dôkladnom opláchnutí každej vzorky vo vode sa bunky ponorili do 1% kyseliny chlorovodíkovej na diferenciáciu a 1% vodného amoniaku, potom sa bunky dôkladne premyli vo vode. Bunky z každej vzorky sa potom dehydratovali v 70% etanole počas 2 minút, 80% etanole počas 2 minút, 90% etanole počas 2 minút dvakrát, 95% etanole počas 2 minút dvakrát a 100% etanole počas 2 minút dvakrát. Bunky sa potom dvakrát ponorili do roztoku xylénu na 2 minúty a umiestnili sa na podložné sklíčko s neutrálnymi živicami. Pod svetelnou mikroskopiou sa každá vzorka podrobila zachyteniu obrazu a náhodnému výberu 5–10 efektívnych vizuálnych polí na určenie expresie vybraných proteínov v dopamínergných neurónoch indikovaných intenzitou hnedých častíc a na semikvantifikáciu obsahu proteínu jeho priemernou sivou hodnotou. .

Rýchlosť apoptózy buniek MES23.5 meraná prietokovou cytometriou

Adherentné bunky sa raz premyli PBS. Na izoláciu buniek sa pri teplote miestnosti pridalo vhodné množstvo roztoku trypsínu bez EDTA a roztok sa jemne odpipetoval, aby sa umožnilo oddelenie adherentných buniek. Potom sa pridalo médium bunkovej kultúry, aby sa zastavila trypsinizácia. Zmes sa preniesla do novej centrifugačnej skúmavky a potom sa 5 minút centrifugovala pri 1500 otáčkach za minútu, aby sa zozbierali izolované bunky. Po odstránení supernatantu sa bunková peleta jemne resuspendovala s použitím PBS a bunky sa spočítali. Približne 1 x 105 až 5 x 105 resuspendovaných buniek sa 5 minút centrifugovalo pri 1500 ot./min. a supernatant sa zlikvidoval. K bunkovej pelete sa pridalo päť mikrolitrov viažuceho roztoku Annexin V-FITC, aby sa bunky jemne resuspendovali. Pridalo sa ďalších 5 ul Annexinu V-FITC a dôkladne sa premiešalo. Päť mikrolitrov roztoku propídiumjodidu sa použilo na farbenie buniek inkubáciou pri teplote miestnosti počas 10 minút krátko pred prietokovou cytometriou.

Western Blot analýza prein vitro

Bunky boli rozdelené do normálnej skupiny, skupiny liečenej MPP+, s nízkou dávkouC. tubulosaliečebná skupina, liečebná skupina so strednou dávkou C. tubulosa a liečebná skupina s vysokou dávkou C. tubulosa. Expresia Bcl2 a Bax sa merala v každom z nich. Celkom 1 x 1{14}}5 buniek na jamku v 6-jamkovej doštičke sa použilo na modelovanie a ošetrenie v každej skupine pred zberom buniek. Pridal sa zmiešaný lyzát obsahujúci RIPA pufor, inhibítor proteázy a inhibítor fosfatázy na lýzu buniek počas 30 minút na ľade. Po odstredení sa supernatant použil na analýzu proteínov. Celkový proteín bol kvantifikovaný pomocou BCA testu a separovaný pomocou 10% SDS-PAGE. Separované proteíny sa preniesli na membránu a inkubovali sa s 5 % tlmivým roztokom blokujúcim odstredené mlieko pri teplote miestnosti počas 2 hodín. Membrána sa potom inkubovala v primárnej protilátke (Bcl-2 0 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, riedenie 1:200) pri 4 °C cez noc. Po premývacom kroku bola membrána inkubovaná v sekundárnej protilátke (0,5 mg/ml, riedenie 1:5000) pri 4 °C počas 1 hodiny a potom vo vývojke ECL počas 2 minút pre konvenčné vyvíjanie. Množstvo Jeden softvér sa použil na semikvantitatívnu analýzu expresie proteínu.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE PROTI ÚNAVE CHRÁNI PEČEŇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Experimentálne zvieracie modelovanie a administrácia liečiv

Päťdesiat týždňových samcov bez špecifických patogénov bolo náhodne rozdelených do piatich skupín: normálna skupina, skupina liečená MPTP (vehikulum), skupina liečená nízkou dávkou C. tubulosa, liečba strednou dávkou C. tubulosa skupine a skupine liečenej vysokou dávkou C. tubulosa. Zvieratá boli umiestnené pri teplote 20–22 °C s voľným prístupom k potrave a vode. Myšiam v normálnej skupine sa intraperitoneálne injikoval rovnaký objem normálneho fyziologického roztoku počas siedmich po sebe nasledujúcich dní. Myšiam v iných liečebných skupinách sa intraperitoneálne injikoval MPTP (30 mg/kg/deň) počas siedmich po sebe nasledujúcich dní, aby sa vytvorili vehikulá.

Počas modelovania PD boli myšiam v skupinách liečených nízkou dávkou, strednou dávkou a vysokou dávkou C. tubulosa intragastricky podávané ekvivalentné klinické objemy 4 g/kg/deň, 8 g/kg/deň a 16 g/d. kg/dC. tubulosa nanoprášok, respektíve počas 14 po sebe nasledujúcich dní. Myšiam v kontrolnej skupine a skupine s vehikulom sa intragastricky podávali ekvivalentné objemy normálneho fyziologického roztoku počas 14 po sebe nasledujúcich dní. Všetky experimentálne postupy boli schválené etickou komisiou Fujianskej univerzity TCM a boli vykonané podľa medzinárodne uznávaných zásad pre použitie a starostlivosť o laboratórne zvieratá. V tejto štúdii sa vynaložilo všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia zvierat.