Extrakt z Cistanche Deserticola zvyšuje tvorbu kostí v osteoblastoch--Časť I

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Abstraktné
Ciele Skúmali sme účinokCistanchedeserticolaMa. (CD) zapnutékosťtvoreniekultivovanými osteoblastmi. Metódy Test tvorby mineralizovaných uzlín sa použil na skúmanie účinkov CD in vitro(Cistanchedeserticola)nakosťtvorenie. Expresia mRNA alkalickej fosfatázy (ALP), kostných morfogenetických proteínov (BMP)-2 a osteopontínu (OPN) sa analyzovala kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase. Mechanizmus účinku CD(Cistanchedeserticola)extrakt bol skúmaný pomocou Western blotting. Antiosteoporotický účinok CD in vivo(Cistanchedeserticola)extrakt bol hodnotený na myšiach po ovariektómii.
Kľúčové poznatky

CD(Cistanchedeserticola)extrakt nemal žiadny vplyv na proliferáciu, migráciu alebo hojenie rán kultivovaných osteoblastov, ale zvýšil ALP, BMP{0}} a OPN mRNA a mineralizáciu kostí. Inhibítory mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) alebo nukleárneho faktora (NF)-kB redukovali CD(Cistanchedeserticola)vyvolané extraktomtvorba kostía výraz ALP, BMP-2 a OPN. Avšak, CD(Cistanchedeserticola)extrakt neovplyvnil osteoklastogenézu. Okrem toho CD(Cistanchedeserticola)extrakt zabránil strate kostnej hmoty vyvolanej ovariektómiou in vivo.
Závery

CD(Cistanchedeserticola)môže byť romántvorba kostíčinidlo na liečbu osteoporózy.

Kľúčové slovátvorba kostí; Cistanchedeserticola; Čínska bylina; osteoblasty

Cistanche deserticolaje dobré pretvorba kostí

Úvod

Kosť je komplexné tkanivo zložené z niekoľkých typov buniek, ktoré podstupujú nepretržitý proces obnovy a opravy nazývaný „remodelácia kostí“. Dva hlavné typy buniek zodpovedné za prestavbu kostí sú osteoklasty, ktoré resorbujú kosť, a osteoblasty, ktoré tvoria novú kosť. Remodeláciu kostí regulujú viaceré systémové hormóny (napr. parathormón, 1, 25-dihydroxy vitamín D3, pohlavné hormóny a kalcitonín) a lokálne faktory (napr. oxid dusnatý, prostaglandíny, rastové faktory a cytokíny).[1] Osteoporóza vzniká vtedy, keď resorpcia a tvorba kosti nie sú koordinované a nadmerné odbúravanie kostí prevyšuje stavbu kostí.[2] Súčasná liečba osteoporózy zahŕňa bisfosfonáty, kalcitonín a estrogén, čo sú inhibítory kostnej resorpcie, ktoré udržujú kostnú hmotu inhibíciou aktivity osteoklastov.[3] Účinok týchto liekov na zvýšenie alebo obnovenie kostnej hmoty je však relatívne malý, určite nie viac ako 2 percentá ročne.[3] Existuje teda potreba látok na stavbu kostí, ako je teriparatid, ktoré stimulujú novékosťtvoreniea napraviť zmenu v trabekulárnej mikroarchitektúre, ktorá je charakteristická pre rozvinutú osteoporózu.[4,5] Pretože novékosťtvorenieje primárne funkciou osteoblastov, látky, ktoré pôsobia buď zvýšením proliferácie buniek osteoblastickej línie alebo indukciou diferenciácie osteoblastov, môžu zvýšiť tvorbu kostí.[5,6]
Hoci mechanizmy osteoporózy zostávajú nejasné, pravdepodobne súvisia so zníženou dostupnosťou alebo účinkami rastových faktorov kostí, ako sú kostné morfogenetické proteíny (BMP).[7] BMP, ktoré štrukturálne súvisia s nadrodinou transformujúceho rastového faktora-b, boli pôvodne identifikované svojou schopnosťou vyvolať ektopickékosť tvorenieu hlodavcov.[8] BMP zohrávajú dôležitú úlohu vkosťtvoreniea diferenciáciu kostných buniek stimuláciou aktivity alkalickej fosfatázy (ALP), ako aj syntézy proteoglykánu, kolagénu a osteopontínu (OPN).[9] Nedávna štúdia zistila súvislosť medzi osteoporózou a špecifickými polymorfizmami v génoch BMP-2, ALP a OPN, čo naznačuje, že sú spojené s rozvojom osteoporózy.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; skrátene CD)(Cistanchedeserticola)je pôvodná bylina v Číne a je široko používaná v tradičnej medicíne ako terapeutické činidlo pre jej sedatívne, analgetické a imunostimulačné vlastnosti.[11] Moderné farmakologické štúdie ukázali, že CD(Cistanchedeserticola)extrakty môžu stimulovať imunitu,[12] vychytávať voľné radikály[13] a zvyšovať aktivitu superoxiddismutázy.[14] Protizápalové a antioxidačné činidlá majú potenciál liečiť osteoporózu zvýšenímkosť tvoreniea/alebo potlačenie kostnej resorpcie.[15,16] Avšak účinok CD(Cistanchedeserticola)na funkciu kostných buniek ešte nebola stanovená. Tu uvádzame toto CD(Cistanchedeserticola)extrakt neovplyvnil proliferáciu, migráciu alebo aktivitu hojenia rán kultivovaných osteoblastov, ale zvýšil expresiu ALP, BMP-2 a OPN a mineralizáciu kostí. Okrem toho sme ukázali, že mitogénom aktivovaná proteínkináza (MAPK) a signálne dráhy jadrového faktora (NF)-kB sa môžu podieľať na zvýšení expresie génov a mineralizácii kostí sprostredkovanom CD. Oproti tomu CD(Cistanchedeserticola)extrakt nepotláčal osteoklastogenézu in vitro. Najmä liečba myší CD(Cistanchedeserticola)extrakt zabránil strate kostnej hmoty vyvolanej ovariektómiou in vivo. Naše údaje teda naznačujú, že CD(Cistanchedeserticola)možno použiť na stimuláciukosťtvoreniena liečbu osteoporózy.

Cistanche deserticolaposilniť imunitu

Materiály a metódy

Extrakt a materiály Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)extrakt bol zakúpený od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extrakcia a izolácia CD(Cistanchedeserticola)postupovali tak, ako už bolo opísané (na základe spektrálnych údajov identifikovali chemické zloženie vrátane beta-sitosterolu, daukosterolu, kyseliny jantárovej, triakontanolu, akteozidu, betaínu a polysacharidu).[17] Králičie polyklonálne protilátky špecifické pre p-extracelulárne signálne regulované kinázy (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminálne kinázy (JNK), JNK, p-p65 a p65 boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Súprava osteokalcínu ELISA bola zakúpená od Biosource Technology (Nivelles, Belgicko). C-koncové telopeptidy súpravy kolagénu typu I ELISA sa získali od Cross Laps (Herlev, Dánsko). Dominantne-negatívny mutant p38 poskytol Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). JNK dominantne-negatívny mutant poskytol Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Dominantne-negatívny mutant ERK2 poskytol Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Všetky ostatné činidlá boli získané od Sigma-Aldrich (St Louis, USA).

Bunková kultúra

Myšia osteoblastová bunková línia MC3T3-E1 bola zakúpená od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Bunky sa kultivovali v 95 percentách vzduchu, 5 percentách CO2 s a-MEM, ktorý bol doplnený 20 mm HEPES a 10 percentami tepelne inaktivovaného fetálneho teľacieho séra, 2 mm glutamínu, penicilínu (100 U/ml) a streptomycínu (100 mg /ml).

Meranie tvorby mineralizovaných uzlín

Tvorba mineralizovaných uzlín bola hodnotená podľa popisu.[18] Stručne povedané, osteoblasty sa kultivovali v médiu obsahujúcom vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mm) počas dvoch týždňov a médium sa menilo každé tri dni. Po inkubácii s CD(Cistanchedeserticola)extraktu počas 12 dní, bunky sa dvakrát premyli 2 0 mm Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom obsahujúcim 0,15 m NaCl (pH 7,4), fixovali sa v ľadovo studenom 75 % (v/v) etanole počas 30 minút a na vzduchu sušené. Depozícia vápnika bola stanovená pomocou farbenia alizarínovou červenou-S. V stručnosti, etanolom fixované bunky a matrica sa farbili počas 1 hodiny s 40 mm alizarínovou červeňou-S (pH 4,2) a dôkladne sa opláchli vodou. Naviazané farbivo sa eluovalo 10 % (hmotn./obj.) cetylpyridíniumchloridom a alizarínová červeň-S vo vzorkách sa kvantifikovala meraním absorbancie pri 550 nm a porovnávala sa so štandardnou krivkou. Jeden mól alizarínovej červene-S selektívne viaže približne dva móly vápnika.

Cistanche deserticolaje dobré pretvorba kostí

Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase

Celková RNA bola extrahovaná z osteoblastov pomocou súpravy TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Reverzná transkripcia sa uskutočnila s použitím 2 mg celkovej RNA a oligo(dT) priméru.[19,20] Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qPCR) sa uskutočnila s použitím TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Pridala sa celková cDNA (100 ng na 25-ml reakcie) so sekvenčne špecifickými primérmi a sondami Taqman®. Všetky priméry a sondy cieľového génu boli zakúpené komerčne, vrátane b-aktínu ako vnútornej kontroly (Applied Biosystems). qPCR testy sa uskutočňovali trojmo na sekvenčnom detekčnom systéme StepOnePlus (Applied Biosystems). Podmienky cyklovania boli 10-min aktivácia polymerázy pri 95 stupňoch, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 stupňov počas 15 s a 60 stupňov počas 60 s. Prah bol nastavený nad netemplátovým kontrolným pozadím a v rámci lineárnej fázy amplifikácie cieľového génu, aby sa vypočítal počet cyklov, pri ktorých bol detegovaný transkript (označené CT).

Western blot analýza

Bunkové lyzáty sa pripravili tak, ako bolo opísané vyššie.[21,22] Proteíny sa rozdelili pomocou SDS-PAGE a preniesli na polyvinyldifluoridové membrány Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Bloty sa blokovali 4 percentným hovädzím sérovým albumínom počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa sondovali králičími anti-ľudskými protilátkami proti p-65 alebo p-p65 (1:1000) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po troch premytiach sa bloty inkubovali s peroxidázou konjugovanou osliou anti-králičou sekundárnou protilátkou (1:1000) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Bloty sa vizualizovali zvýšenou chemiluminiscenciou s použitím filmu X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Osteoporóza vyvolaná ovariektómiou

Na túto štúdiu sa použili samice myší ICR, štyri týždne staré, 22 až 28 g. Myšiam sa ovariektómia obojstranne odstránila v anestézii trichlóracetaldehydom (100 mg/kg) a kontrolným myšiam sa na porovnanie vykonala falošná operácia (Sham). Minerálna hustota kostí a obsah kostných minerálov sa merali po perorálnom podaní rôznych koncentrácií CD(Cistanchedeserticola)extrahovať každé dva dni počas štyroch týždňov. Celková telesná kostná minerálna hustota a obsah kostných minerálov boli stanovené röntgenovým absorbiometrom s dvojitou energiou (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) s použitím režimu pre malé subjekty, ako bolo opísané vyššie.[18, 23] Všetky protokoly boli v súlade s inštitucionálnymi smernicami a boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá Čínskej lekárskej univerzity.

Štatistická analýza

Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softvéru Prism 4.{4}}1. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Uvedené hodnoty sú priemerné SEM. Štatistická analýza medzi dvoma vzorkami sa uskutočnila pomocou Studentovho t-testu. Štatistické porovnania viac ako dvoch skupín sa uskutočnili pomocou jednosmernej analýzy rozptylu s Bonferroniho posthoc testom. Vo všetkých prípadoch sa P < 0,05="" považovalo="" za="">

Cistanche deserticolaje dobré pretvorba kostí

Výsledky

Cistanche deserticolaextrakt zvyšuje mineralizáciu kostí osteoblastmi Pridanie CD(Cistanchedeserticola)extrakt počas 24 alebo 48 hodín neovplyvnil proliferáciu myších osteoblastov MC3T3-E1 buniek v teste MTT (údaje nie sú uvedené). Pretože diferenciácia osteoblastov je komplexný proces zahŕňajúci bunkovú proliferáciu a migráciu, testovali sme aj migračnú schopnosť buniek MC3T3-E1 po liečbe CD(Cistanchedeserticola)extrakt. Pomocou Transwell a testov hojenia rán sme zistili, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt neovplyvnil migráciu osteoblastov (údaje nie sú uvedené). Tvorba mineralizovaných uzlín je jedným z markerov dozrievania osteoblastov. Farbenie alizarínovou červenou S ukázalo, že mineralizované uzliny sa vytvorili, keď sa osteoblasty kultivovali počas dvoch týždňov v médiu obsahujúcom vitamín C (50 ug/ml) a -glycerofosfát (10 mm), spôsobom závislým od koncentrácie pridaním CD(Cistanchedeserticola)(Obrázok 1a). Preto CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukoval tvorbu kostných uzlín kultivovanými osteoblastmi, ale nie ich proliferáciu alebo migráciu. Preskúmali sme aj úlohu CD(Cistanchedeserticola)extrakt v RANKL-indukovanej osteoklastogenéze, ale nezistil žiadny účinok (údaje nie sú uvedené).

Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje expresiu alkalickej fosfatázy, kostného morfogenetického proteínu-2 a osteopontínu v kultivovaných osteoblastoch

Diferencované osteoblasty vykazujú zvýšenú aktivitu ALP, ktorá koreluje s vysokými hladinami expresie enzýmov.[18] Zistili sme, že liečba CD(Cistanchedeserticola)extrakt počas 72 hodín významne zvýšil aktivitu ALP osteoblastov (obrázok 1b). Vzhľadom na kľúčovú úlohu BMP-2, ALP a OPN pri diferenciácii osteoblastov sme testovali, či CD(Cistanchedeserticola)extrakt pôsobí na diferenciáciu osteoblastov reguláciou expresie BMP-2, ALP a OPN. Ošetrenie buniek CD(Cistanchedeserticola)extrakty zvýšili expresiu mRNA ALP, BMP{0}} a OPN spôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 1c), čo dokazuje, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukoval diferenciáciu osteoblastov zvýšením expresie ALP, BMP{0}} a OPN.

Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostných uzlín prostredníctvom mitogénom aktivovanej proteínkinázovej dráhy

Uvádza sa, že MAPK hrá dôležitú úlohu vkosťtvorenie[24,25], takže sme ďalej skúmali, či je táto signálna dráha zapojená do CD(Cistanchedeserticola)extraktom indukovaná mineralizácia kostí. Predbežné ošetrenie buniek inhibítorom ERK U0126, inhibítorom p38 SB203580 alebo inhibítorom JNK SP600125 znížilo CD(Cistanchedeserticola)extraktom zvýšená mineralizácia kostí (obrázky 2a, 3a a 4a). Okrem toho inhibítory tiež blokovali CD(Cistanchedeserticola)extraktom indukovaná expresia ALP, BMP-2 a OPN (obrázky 2b–4c). Transfekcia buniek s ERK2, p38 alebo mutantom JNK znížila CD(Cistanchedeserticola)extrakt-zvýšenie expresie mRNA ALP, BMP-2 a OPN (obrázky 2c, 3c a 4c). Ďalej sme priamo skúmali aktiváciu ERK, p38 a JNK po CD(Cistanchedeserticola)extrakčné ošetrenie. Inkubácia buniek s CD(Cistanchedeserticola)extrakt indukoval fosforyláciu ERK, p38 a JNK (obrázky 2d, 3d a 4d). Preto ERK, p38 a JNK sprostredkovávajú zvýšeniekosťtvorenieindukované CD(Cistanchedeserticola)liečba osteoblastov.

Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostných uzlín prostredníctvom dráhy jadrového faktora-kB

Ako už bolo spomenuté, je potrebná aktivácia NF-kBkosťtvorenie[26,27] Ďalej sme ošetrili osteoblasty inhibítormi NF-kB pyrolidínditiokarbamátom (PDTC) a N-tozyl-L-fenylalanín chlórmetylketónom (TPCK), ktoré sme zakúpili od Calbiochem (Darmstadt, Nemecko), aby sme zistili, či je aktivácia NF-kB zapojené do CD(Cistanchedeserticola)extraktom indukovaná mineralizácia kostí. Obrázok 5a ukazuje, že predbežné ošetrenie osteoblastov PDTC alebo TPCK inhibovalo CD(Cistanchedeserticola)extraktom indukovanú tvorbu kostných uzlín a tiež znížila zvýšenie expresie ALP, BMP-2 a OPN (obrázok 5b a 5c). Fosforylácia podjednotky NF-kB p65 je indikátorom aktivácie NF-kB;[28] v súlade s tým sme zistili, že CD(Cistanchedeserticola)extrakt zvýšil fosforyláciu p65 v osteoblastoch (obrázok 5d). Tieto výsledky ukázali, že aktivácia NF-kB je dôležitá pre expresiu ALP, BMP-2 a OPN a tvorbu kostných uzlín indukovanú CD extraktom.

Obrázok 4 Zapojenie c-Jun N-koncových kináz (JNK) vCistanchedeserticola(CD) extraktom indukovaná mineralizácia kostí v osteoblastoch. (a) Bunky boli nanesené na 24-jamkové platne a kultivované v médiu obsahujúcom vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mM) počas dvoch týždňov. Bunky boli súčasne ošetrené CD(Cistanchedeserticola)extrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Tvorba mineralizovaných uzlín bola hodnotená farbením alizarínovou červenou-S (n=5). (b, c) Bunky boli vopred ošetrené SP600125 počas 30 minút alebo transfekované mutantom JNK alebo 24 hodín, po čom nasledovala stimulácia CD extraktom a aktivitou alkalickej fosfatázy (ALP) a ALP, kostného morfogenetického proteínu (BMP)-2 a Expresia mRNA osteopontínu (OPN) sa merala pomocou súpravy ALP a kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase. (d) Bunky boli ošetrené CD extraktom v uvedených časových intervaloch a expresia p-JNK bola skúmaná pomocou Western blottingu. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)skupina ošetrená extraktom.

Inhibícia úbytku kostnej hmoty extraktom Cistanche deserticola u ovariektomizovaných myší

Preskúmať účinok CD(Cistanchedeserticola)extraktu pri strate kostnej hmoty bola u samíc myší indukovaná osteoporóza ovariektómiou. Ako sa očakávalo, ovariektomizované myši vykazovali zníženú celkovú telesnú hustotu kostných minerálov a obsah kostných minerálov (obrázok 6a a 6b). Liečba pomocou CD(Cistanchedeserticola)extrakt počas štyroch týždňov inhiboval stratu kostnej minerálnej hustoty a obsahu kostných minerálov spôsobom závislým od dávky (obrázok 6a a 6b). Krvné koncentrácie ALP môžu odrážať osteoblastickú aktivitu.[29] Ako je znázornené na obrázku 6c, CD(Cistanchedeserticola)extrakt inhiboval pokles aktivity ALP v sére vyvolaný ovariektómiou. Okrem toho CD(Cistanchedeserticola)extrakt tiež zvýšil hladinu osteokalcínu, markerakosťtvoreniea znížili hladinu C-terminálnych telopeptidov kolagénu typu I, markera kostnej resorpcie (obrázok 6d a 6e). Tieto zistenia teda podporujú potenciu a účinnosť CD(Cistanchedeserticola)extrakt pri prevencii straty kostnej hmoty in vivo.

Obrázok 6 Inhibícia zníženia hustoty minerálov v kosti a obsahu minerálov v kostiach vyvolaného ovariektómiouCistanchedeserticola(CD) extrakt. Samiciam ICR myší sa podrobila falošná operácia alebo sa im odstránili ovariektómie. Myši po ovariektómii boli liečené uvedenými koncentráciami CD(Cistanchedeserticola)extrakt perorálnym podávaním. Celková telesná kostná minerálna hustota (a), kostný minerálny obsah (b), aktivita sérovej alkalickej fosfatázy (ALP) (c), sérový osteokalcín (d) a sérové ​​C-terminálne telopeptidy kolagénu typu I (e) boli stanovené štyri týždňov po operácii. Údaje sú prezentované ako priemer SE, n=8–10 myší/skupina. *P < 0.05,="" v="" porovnaní="" so="" simuláciou;="" #p="">< 0,05="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" po="">

DISKUSIA

Kliknutím sem získate informácie o časti II (Diskusia a záver) tohto článku.

Od: 'Cistanchedeserticolaextrakt sa zvyšujekosťtvoreniev osteoblastochTe-Mao Li^aa kol

---© 2012 Autori. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Časopis pre farmáciu a farmakológiu, 64, s. 897–907