Cistanoside Of Cistanche Herba zmierňuje poškodenie mužskej reprodukcie spôsobené hypoxiou prostredníctvom potlačenia oxidačného stresu-Ⅱ

Účinky Cis na životaschopnosť GC-1 buniek indukovanú hypoxiou in vitro.

Aby sa zistilo, či Cis môže zabrániť inhibičným účinkom hypoxie na životaschopnosť GC {{0}} buniek, vykonal sa test CCK-8. Bunky GC-1 boli ošetrené rôznymi podtypmi (Cis-A, B, C, H) a koncentračnými rozsahmi (0.02 μM, 0,2 μM, 2 uM) Cis počas 72 hodín. Porovnanie modelovej skupiny so skupinou DMSO ukázalo, že DMSO priamo nepodporoval životaschopnosť buniek GC{{1{24}}}} (obrázok 2A). Životaschopnosť buniek sa však výrazne obnovila (P < 0.05) pomocou liečby Cis. V porovnaní s modelovou skupinou všetky Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H vykazovali určité ochranné účinky na poškodenie životaschopnosti GC-1 buniek vyvolané hypoxiou a Cis-B vykazovali najvýznamnejšie účinok (obrázok 2A). Ochranné účinky Cis pri 0,2 μM boli výrazne vyššie ako ochranné účinky Cis pri 0,02 μM, zatiaľ čo rozdiel medzi 2 μM a 0,2 μM nebol zrejmý, čo naznačuje, že obnovená Životaschopnosť GC-1 buniek indukovaná Cis demonštrovala na dávke závislý nárast koncentračného rozsahu od 0,{32}},2 μM (obrázok 2A). Preto sa podľa experimentálnych potrieb vybralo 0,2 uM Cis ako optimálna koncentrácia v nasledujúcich in vitro experimentoch. Aby sa ďalej potvrdilo, či boli zárodočné bunky skutočne chránené pomocou Cis, vykonalo sa farbenie FCM a Ki-67, aby sa vyhodnotila zmena proliferácie buniek GC-1 po ošetrení s Cis. Po ošetrení Cis sa podiel GC-1 buniek vo fáze G1 znížil. Na rozdiel od toho do S fázy vstúpilo viac buniek, čo naznačuje, že ošetrenie Cis by mohlo zvýšiť index proliferácie zárodočných buniek (P < 0,01; obrázok 2B). Štatistiky pre GC-1 bunkový cyklus sú znázornené na obrázku 2Bb. Výsledky farbenia Ki-67 tiež ukázali, že liečba Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H významne zlepšila pomer Ki-67-pozitívnych buniek GC vyvolaných hypoxiou{{54} } buniek in vitro (obrázok 2C).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mechanizmus Cis chráni zárodočné bunky pred hypoxiou in vitro.

Aby sa zistilo, či ochranné účinky Cis na bunky GC{0}} súviseli s odstránením nadmerného množstva ROS, na detekciu hladín ROS v každej skupine sa použilo fluorescenčné farbivo DCFH-DA. Ako je znázornené na obrázkoch 3A a 3B, ošetrenie DMSO nezmenilo intracelulárny obsah ROS alebo hladinu LPO v porovnaní s modelovou skupinou. Avšak hladiny ROS v GC-1 bunkách boli výrazne znížené v skupinách liečených Cis (obrázok 3A). Okrem toho bol pokles LPO tiež pozorovaný v GC-1 bunkách vystavených Cis (obrázok 3B).

Na ďalšie preskúmanie mechanizmu, ktorým Cis chráni zárodočné bunky pred hypoxickým poškodením, sa vykonalo farbenie TUNEL a analýza Western blot na vyhodnotenie apoptózy. Farbenie TUNEL (obrázok 3C) ukázalo významnú apoptózu v modelových a DMSO skupinách. Pri liečbe Cis však bolo pozorovaných menej apoptotických buniek, čo naznačuje, že liečba Cis znížila apoptózu GC-1 buniek. Okrem toho sa merala expresia PARP, kaspázy-3, Bax a Bcl-2, aby sa potvrdil molekulárny mechanizmus. Ako je znázornené na obrázku 3D, kaspáza-3 a PARP boli aktivované v GC-1 bunkách pri hypoxii a táto aktivácia bola inhibovaná liečbou Cis. Okrem toho pomer Bax/Bcl-2 bol vyšší v modelovej skupine ako v kontrolnej skupine a liečba Cis znížila pomer Bax/Bcl-2 (obrázok 3D). Tieto údaje naznačujú, že Cis má potenciálnu schopnosť zmierniť poškodenie oxidantom vyvolané hypoxiou a tento ochranný účinok možno dosiahnuť znížením akumulácie ROS a inhibíciou aktivácie dráhy apoptózy súvisiacej s kaspázou.

Enzymatický mechanizmus inhibujúci OS zahŕňa lapače voľných radikálov, ako je glutatiónreduktáza (GR), glutatiónperoxidáza (GPx) a superoxiddismutáza (SOD) [23]. Enzymatický mechanizmus inhibujúci OS hrá zásadnú úlohu v prevencii oxidačného poškodenia v bunkách a tkanivách [23]. Na ďalšie overenie potenciálneho mechanizmu Cis inhibície hypoxiou indukovaného OS v GC-1 bunkách sa merali aktivity GR, GPx a SOD. Výsledky ukázali, že všetky aktivity GR, GPx a SOD signifikantne (P < 0.01, obrázok 3E) poklesli pri hypoxii v porovnaní s kontrolnými skupinami a liečba Cis výrazne obnovila ich aktivity v GC -1 bunky vystavené hypoxii (P < 0,05, obrázok 3E), čo naznačuje, že tieto zlúčeniny by mohli aktivovať silný endogénny antioxidačný systém.

CISTANCHE TUBULOSA PRE STIMULÁCIU PRODUKCIE SPERMIÍ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Účinky Cis na reprodukciu u potkanov vyvolaných hypobarickou hypoxiou.

Aby sme určili účinky hypobarickej hypoxie na samcov potkanov, najprv sme testovali morfologické zmeny semenníkov u potkanov vyvolaných hypobarickou hypoxiou. Výsledky farbenia HE ukázali, že v kontrolnej skupine boli normálne spermatogénne bunky v rôznych štádiách usporiadané usporiadaným spôsobom od bazálnej membrány po lúmen a zrelé spermie boli viditeľné v lúmenoch tubulov (obrázok 4A). V porovnaní s kontrolami boli v modelovej skupine pozorované patologické zmeny testikulárneho tkaniva, bazálna membrána testikulárnych epiteliálnych buniek bola usporiadaná voľne, spermatogénny epitel bol extrémne tenký a hladina a počet zárodočných buniek boli výrazne znížené (obrázok 4A) . Liečba Cis však pozoruhodne zlepšila histológiu poškodenia semenníkov vyvolaného hypobarickou hypoxiou in vivo (obrázok 4A). Zmerali sme aj telesnú hmotnosť, hmotnosť semenníkov, hmotnosť nadsemenníka a hmotnosť semennej žľazy, čo viedlo k výpočtu indexu reprodukčných orgánov (pomer reprodukčný orgán/telesná hmotnosť). Ako je znázornené na obrázku 4B-D, index reprodukčných orgánov (semenníky, nadsemenníky a semenná žľaza) bol výrazne nižší v modelovej skupine (P < 0 0,01) ako v kontrolnej skupine. Účinok hypobarickej hypoxie na index reprodukčných orgánov potkanov bol však zvrátený liečbou Cis (obrázok 4B-D).

Ďalej sa tiež merala aktivita akrozómového enzýmu a počet živých spermií samčích potkaních spermií, aby sa objasnilo poškodenie funkcie semenníkov. Ako je znázornené na obrázku 4E, 4F, aktivita akrozómového enzýmu a pohyblivosť spermií boli nižšie v modelovej skupine potkanov ako v kontrolnej skupine (P < 0.01). Avšak v porovnaní s potkanmi v modelovej skupine bola aktivita akrozómového enzýmu obnovená u potkanov liečených 8 mg/kg/d Cis (P < 0,05) (obrázok 4D). Okrem toho, ako je znázornené na obrázku 4F, ošetrenie s Cis tiežzvýšil počet živých spermií; všetky potkany liečené 8 mg/kg/d Cis vykazovali významne zvýšený počet živých spermií (55,83 ± 6.03 %, P < 0.05; 69.{101} {8}} ± 2,29 %, P < 0,01, P < 0,05 a 53,67 ± 2,25 %, P < 0,05) v porovnaní s modelovými potkanmi (43,83 ± 4,01 %); .

Celkovo tieto výsledky naznačujú, že hypobarické hypoxické prostredie viedlo k morfologickým zmenám semenníkov, strate hmotnosti reprodukčných orgánov a poškodeniu funkcie semenníkov u samcov potkanov a Cis mohol účinne chrániť reprodukčné orgány pred poškodením vyvolaným hypoxiou.

Účinky Cis na OS v semenníkoch potkanov vyvolaných hypobarickou hypoxiou.

Hladiny ROS a LPO v semenníkoch potkanov sa merali, aby sa analyzovali účinky Cis na OS vyvolaný hypobarickou hypoxiou. Analýza ROS odhalila, že v porovnaní s kontrolnou skupinou boli hladiny ROS v semenníkoch v modelovej skupine významne zvýšené (P < 0.01 Obrázok 5A). Naopak, LPO bol dramaticky zvýšený v semenníkoch (P < 0 0,01) pri hypobarickej hypoxii v porovnaní s normoxickými podmienkami (obrázok 5B). Ošetrenie Cis však zmenilo vyššie uvedené zmeny (P < 0,05), v ktorých Cis-B vykazoval lepšie účinky ako iné Cis (obrázok 5A, 5B). Zdá sa, že Cis chráni semenníky znížením OS za hypobarických hypoxických podmienok in vivo.

Okrem toho sa uskutočnili analýzy apoptózy na ďalšie vyhodnotenie mechanizmu, ktorým Cis chránil pred poškodením funkcie semenníkov vyvolaným hypobarickou hypoxiou. Výsledky farbenia TUNEL (obrázok 5C) ukázali, že v modelovej skupine existovala významná apoptóza v porovnaní s kontrolnou skupinou. Avšak po liečbe Cis (8 mg/kg/d) sa vyskytlo menej apoptotických buniek (P < 0 0,05) (obrázok 5C). Údaje Western blot tiež ukázali, že hypoxia a hypobarická liečba viedli k aktivácii kaspázy-3 a PARP a zvýšenému pomeru Bax/Bcl-2 v testikulárnom tkanive, čo naznačuje zvýšenie apoptózy (obrázok 5D). Okrem toho rôzne druhyCis liečbavýznamne znížila apoptózu v testikulárnom tkanive (obrázok 5D). Podobne analýza IHC testikulárneho tkaniva ukázala podobné výsledky (doplnkový obrázok 1).

Na overenie mechanizmu Cis-redukovaného OS vyvolaného hypobarickou hypoxiou sme ďalej testovali aktivity GR, GPx a SOD v semenníkovom tkanive. Ako je znázornené na obrázku 5E, v porovnaní s kontrolnou skupinou liečba hypobarickej hypoxie významne znížila aktivity GR, GPx a SOD (P < 0.01). Ošetrenie Cis však obnovilo enzýmové aktivity (GR, GPx a SOD) tkaniva semenníkov u potkanov liečených hypobarickou hypoxiou (P < 0,05). Na záver sa zdá, že Cis chráni semenníky aktiváciou silného endogénneho obranného mechanizmu antioxidačného enzýmu v podmienkach hypobarickej hypoxie.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskusia

V oblastiach s vysokou nadmorskou výškou je známe, že hypobarická hypoxia postihuje viaceré systémy u ľudí, vrátane mužského reprodukčného systému [4, 20]. Nedávne experimentálne výskumy sú zamerané na pochopenie mechanizmov toho, ako hypobarická hypoxia poškodzuje mužský reprodukčný systém. V tejto štúdii sa skúmal terapeutický účinok Cis extraktu z Cistanches Herba na hypoxiou vyvolané reprodukčné poškodenie. Výsledky ukázali, že Cis môže chrániť mužský reprodukčný systém pred hypoxickým poškodením znížením akumulácie ROS a OS vyvolaného hypoxiou zvýšením aktivity endogénnych antioxidačných enzýmov.

ROS sú voľné radikály odvodené od kyslíka, ktoré hrajú dôležitú úlohu vo fyziológii a patológii človeka. Nízke dávky ROS sú nevyhnutné prekapacita spermiíakrozómová reakcia a fúzia spermií a oocytov [24, 25]. Nadmerná akumulácia ROS však často vedie k poškodeniu zárodočných buniek a stromálnych buniek, čo vedie k mužskej neplodnosti [26]. ROS môže peroxidáciou ľahko poškodiť bunkové membrány, nukleové kyseliny, proteíny, enzýmy a ďalšie biologické makromolekuly. Okrem toho tiež vedú k potenciálnemu poškodeniu buniek a DNA, keď prekročia antioxidačnú kapacitu. Nahromadené dôkazy podporujú kľúčovú úlohu ROS v patogenéze mužskej fertility [27, 28]. Produkcia ROS je regulovaná napätím kyslíka. V hypoxických podmienkach sa znižuje dostupný kyslík v prostredí a zvyšuje sa viskozita krvi, čím sú ovplyvnené mnohé na kyslíku závislé metabolické procesy v organizme [29, 30]. Nižší atmosférický tlak vo vysokých nadmorských výškach však spôsobuje zlý venózny návrat a pokles množstva kyslíka transportovaného krvným obehom do všetkých buniek organizmu, čo ešte viac zvyšuje hypoxiu orgánov a buniek [29, 30]. Vystavenie vysokej nadmorskej výške teda vedie k sérii hypoxických fyziologických reakcií, vrátane produkcie a akumulácie ROS, keď dopyt po kyslíku prevyšuje vaskulárne zásobenie. Ako už bolo spomenuté, akumulácia ROS vedie k rôznym intracelulárnym účinkom, z ktorých najkritickejší je spôsobiť OS v bunkách.

OS označuje nerovnováhu medzi oxidačnými a redukčnými reakciami, čo vedie k tvorbe nadbytočných oxidantov alebo molekúl, ktoré prijímajú elektrón z iného reaktantu, čo zase produkuje ROS [31, 32]. OS je dobre známe, že môže byť spustený radom endogénnych a exogénnych faktorov, vrátane vystavenia vysokej nadmorskej výške. Spermie sú bunky, ktoré sú obzvlášť citlivé na OS vzhľadom na ich neadekvátne systémy na opravu buniek a vysoký obsah polynenasýtených mastných kyselín v plazmatickej membráne [33]. Tkanivá semenníkov a nadsemenníkov nie sú výnimkou, pretože prítomnosť ťažkého OS bola pozorovaná v okrúhlych spermatídach u potkanov vystavených hypoxii [4]. OS ovplyvňuje stabilitu DNA, čím ohrozuje integritu genetického materiálu gamét [34-36]. Potvrdilo sa však, že vysoká úroveň poškodenia DNA u mužských gamét vedie k aktivácii signalizácie apoptózy, čo má za následok zníženie počtu spermií nadsemenníkov a zvýšenie percenta defektných buniek [28, 37]. V tejto štúdii hypoxia významne znížila životaschopnosť GC-1 buniek prostredníctvom indukcie apoptózy a zastavenia bunkového cyklu. Ešte dôležitejšie je, že významne zvýšené hladiny ROS preukázala FCM analýza po stimulácii hypoxie, so zvýšenou mierou apoptózy a vyššou aktiváciou pomeru kaspázy-3, PARP a Bax/Bcl-2, čo naznačuje, že ROS môže aktivovať apoptózy aktiváciou kaspázovej signálnej dráhy počas poškodenia plodnosti vyvolaného hypoxiou. Súčasné zistenia ukázali, že hypoxia viedla k nadmernej akumulácii ROS, čo spôsobilo oxidačné poškodenie reprodukčných buniek. Preto je zmysluplné identifikovať nové antioxidanty, ktoré môžu slúžiť ako účinný prístup na zmiernenie poškodenia plodnosti spôsobeného hypoxiou.

Na ochranu pred OS existuje v tele komplexný antioxidačný systém, zložený najmä z enzymatických faktorov. Za fyziologických podmienok si obsah ROS a antioxidačný systém udržiavajú určitú rovnováhu. Nadprodukcia ROS však vyčerpáva antioxidačný systém spermií, čo vedie k OS, ktorý spôsobuje poškodenie DNA spermií a vedie k nižšej plodnosti a tehotenstvu [23]. Na riešenie nadmernej produkcie ROS a súvisiacich škodlivých účinkov na bunkovej úrovni v mužskom reprodukčnom systéme boli teda testované rôzne antioxidačné stratégie [23]. V súčasnosti je v literatúre o použití zlúčenín s antioxidačnou aktivitou azlepšenie funkcie spermiíje rozsiahly. Dôležité je, že väčšina správ popisuje zlepšenie parametrov spermií po perorálnom príjme antioxidantov, vrátanezlepšenie koncentrácie spermiía motilita alebo zníženie poškodenia DNA [38]. Rastúci počet urológov preto predpisuje perorálne antioxidanty na liečbu neplodnosti v dôsledku problémov súvisiacich s OS [39]. Medzi tieto antioxidanty patria najmä karnitíny, vitamíny, zinok, melatonín a prírodné zlúčeniny [23, 40]. V súčasnosti, s rozvojom technológie extrakcie liečiv, sa zvažuje aj rastúci počet extraktov TCM na zmiernenie mužskej neplodnosti, pretože tieto antioxidanty môžu znižovať deštruktívne účinky OS [41]. Yüce A. a kol. v roku 2013 uviedli, že škorica má priaznivé účinky na oxidačnú a antioxidačnú rovnováhu v semenníkoch a kvalitu spermií [42]. Zhang L a kol. ukázali, že kurkumín významne zlepšuje motilitu spermií u pacientov a znižuje H2O2 [43]. Okrem toho sa ukázalo, že množstvo ďalších rastlinných extraktov, ako je čučoriedka, krokus sativus, semená granátového jablka a zelený čaj, chránia reprodukčný systém prostredníctvom antioxidačných mechanizmov [27, 44-47]. Cistanches Herba je dôležitá TČM, ktorá má okrem iného priaznivý bezpečnostný profil a široké medicínske funkcie pri liečbe neplodnosti [13]. Moderné farmakologické štúdie ukázali, že Cistanches Herba má rôzne aktivity, ako sú antioxidačné, protizápalové, hepatoprotektívne a antineurodegeneratívne aktivity [13, 48]. Preto môžu mať extrakty, frakcie alebo zlúčeniny z Cistanches Herba potenciálne antioxidačné vlastnosti pri liečbe neplodnosti.

Aktívne látky v rastlinách, ktoré zlepšujú plodnosť, zahŕňajú rôzne chemické skupiny, ako sú PhG, saponíny, kyslíkaté prchavé zlúčeniny a alkaloidy [41]. Štúdie farmakologickej aktivity PhG preukázali, že PhGs vykazujú širokú škálu bioaktivít, ako je antioxidácia, antiradiačná neuroprotekcia a zlepšenie sexuálnej funkcie [49, 50]. Spomedzi týchto aktivít postupne priťahuje pozornosť antioxidácia. Uvádza sa, že niektoré jednotlivé zložky alebo frakcie PhG inhibujú apoptózu zárodočných buniek indukovanú rôznymi chemikáliami a ich antioxidačné schopnosti in vitro boli tiež preukázané in vivo na niekoľkých zvieracích modeloch [51, 52]. Tieto výsledky naznačujú, že PhG by mohli byť atraktívnym kandidátom preliečba mužskej neplodnosti. Cis je aktívna PhG, ktorú možno izolovať z Cistanches Herba. V tejto štúdii sme skúmali účinky Cis na bunky ošetrené hypoxiou alebo potkaní model a skúmali sme základné molekulárne mechanizmy. Cis vykazoval ochranné účinky na zníženie životaschopnosti vyvolanej hypoxiou a zvýšenie apoptózy v GC-1 bunkách a tiež vykazoval ochranný účinok na poškodenie vyvolané hypoxiou v reprodukčnom systéme potkanov in vivo. Pozoroval sa významný pokles aktivít GR, GPx a SOD pri hypoxii v porovnaní s normoxickými skupinami, zatiaľ čo špecifické aktivity GR, GPx a SOD sa významne zvýšili v semenníkoch alebo GC -1 bunkách ošetrených Cis. Zdá sa, že Cis chráni semenníky a GC-1 bunky v hypoxických podmienkach zvýšením aktivít antioxidačných enzýmov.

Enzýmové antioxidanty fungujú hlavne tak, že vychytávajú superoxidové anióny, čím zabraňujú peroxidácii lipidov a poškodeniu DNA, aby sa zabránilo neplodnosti. Enzymatické antioxidačné mechanizmy zohrávajú kľúčovú úlohu v prevencii oxidačného poškodenia [23]. Enzymatický mechanizmus proti OS zahŕňa lapače voľných radikálov a enzýmy závislé od glutatiónu vrátane GR, GPx a SOD [12]. Antioxidačné enzýmy sú dobre známe ako nevyhnutné pre mužský reprodukčný systém. V súčasnej štúdii bol účinok znížených aktivít antioxidačných enzýmov pri hypobarickej hypoxii sprevádzaný zvýšenými ROS a LPO v modelovej skupine, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami [12]. Podávanie Cis však viedlo k obnoveniu antioxidačných enzýmových aktivít v GC-1 bunkách a semenníkoch potkanov, čo umožnilo vytvoriť stratégie podávania Cistanches Herba na prevenciu poškodenia spôsobeného hypobarickou hypoxiou, ako sa už navrhovalo. Aj keď súčasné výsledky ukázali, že liečba Cis čiastočne znížila poškodenie zárodočných buniek vyvolané hypoxiou u potkanov, na odhalenie úplného obrazu jeho reprodukčných ochranných účinkov sú potrebné ďalšie výskumy. Napríklad špecifický mechanizmus Cis ovplyvňuje aktivitu antioxidačných enzýmov. Okrem toho existuje otázka, či by mohli byť relevantné aj nejaké iné mechanizmy, pretože Cis sa len čiastočne zotavil z reprodukčného poškodenia spôsobeného hypoxiou. Nakoniec by sa malo zvážiť aj to, či má Cis priamy rast podporujúci účinok na zárodočné bunky.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA UDRŽANIE AKTIVITY SPERMÍ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Závery

Vo všeobecnosti zistenia tejto štúdie zdôrazňujú potenciál Cis ako antioxidantu na liečbu hypoxiou vyvolaného mužského reprodukčného poškodenia. Cis môže chrániť pred hypoxiou vyvolaným reprodukčným poškodením u mužov obnovením aktivity antioxidačného enzýmu, znížením OS indukovaného ROS, súčasným zvýšením životaschopnosti buniek a znížením apoptózy. Dôležité je, že všetky podtypy Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H) študované v tejto štúdii vykazovali určitý ochranný účinok na reprodukčný systém a Cis-B vykazoval najvýznamnejší účinok. Preto špekulujeme, že Cis môže byť dobrým kandidátom na antioxidantliečbu hypoxiou vyvolaného mužského reprodukčného poškodenia, hoci presný základný mechanizmus si vyžaduje ďalšie skúmanie.