Esenciálne oleje obsahujúce citral ako potenciálne inhibítory tyrozinázy: Bio-riadený frakcionačný prístup
Mar 19, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Abstrakt:
Nadmerná produkcia melanínu spôsobuje vážne dermatologické stavy, ako aj menšie estetické problémy (napr. pehy a solárne lentigo). Znížená regulácia tyrozinázy je rozšírený prístup na liečbu takýchto porúch a rastlinné extrakty sa často ukázali ako cenné zdrojetyrozinázainhibítory. Citral (zmes neralu a geranialu) je dôležitá vonná zložka, ktorá preukázala antityrozinázový potenciál. Je vysoko koncentrovaný v esenciálnych olejoch (EO) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. a Verbenaofficinalis L. Avšak len L. cubeba EO bol skúmaný na použiť ako potenciálne činidlo na bielenie pokožky. Táto práca hodnotí in vitrotyrozinázainhibičnú aktivitu týchto EO a štúdie s použitím frakcionácie orientovanej na biotest, či ich odlišné chemické zloženie ovplyvňuje celkové inhibičné aktivity EO prostredníctvom možných synergických, aditívnych a/alebo konkurenčných interakcií medzi zložkami EO. Inhibičná aktivita C. schoenanthus EO a M. officinalis EO, so zanedbateľným množstvom (plus)-citronellalu, boli v súlade s ich obsahom citralu. Na druhej strane, L. cubeba a V. officinalis EO inhibovalityrozinázav podstatne väčšej miere, keďže obsahovali -myrcén, čo prispelo k celkovým aktivitám EO. Podobné pozorovania boli urobené pre M. officinalis EO, ktorý má vysoký obsah (plus)-citronellalu, ktorý zvyšuje citralovú aktivitu.
Kľúčové slová:tyrozinázainhibícia; esenciálne oleje; citral
Úvod
tyrozinázaje kľúčovým enzýmom pri biosyntéze melanínových pigmentov u niekoľkých baktérií, húb, rastlín, zvierat a ľudí. U ľudí tyrozináza katalyzuje kroky obmedzujúce rýchlosť v biosyntetickej dráhe melanínu. Táto biosyntéza je charakterizovaná niekoľkými enzymatickými a chemickými reakciami, ktoré vedú k tvorbe melanínu z aminokyseliny L-tyrozínu, pričom tyrozináza katalyzuje jeho hydroxyláciu na o-dopachinón prostredníctvom mykofenolátových a difenolových aktivít. Aj keď sa na melanogenéze podieľajú aj iné enzýmy, iba reakcie katalyzované tyrozinázou nemôžu spontánne prebiehať, zatiaľ čo ostatné kroky môžu prebiehať bez enzýmovej aktivity pri fyziologickom pH [1]. Z tohto dôvodu je downregulácia tyrozinázy veľmi rozšíreným prístupom k redukcii nadmerného množstva melanínu. produkcia a použitie inhibítorov tyrozinázy ako činidiel na bielenie kože preukázalo významný klinický a kozmetický význam [2].
Na trhu EÚ,tyrozinázainhibítory, ktoré sa používajú ako činidlá na bielenie pokožky, možno rozdeliť do dvoch hlavných kategórií: tie, ktoré sú zakázané podľa nariadenia EÚ o kozmetike 1223/2009 (tj hydrochinón a mono benzyléter hydrochinón) z dôvodu ich závažných vedľajších účinkov, ale stále sa používajú na liečbu hyperpigmentácie v rámci lekárskych predpisov. dohľad; a inhibítory tyrozinázy, ktoré sú povolené na použitie v kozmetických výrobkoch (tj arbutín, aloezín, kyselina kojová) [2,3]. Táto druhá skupina sa však stále vyznačuje potenciálne významnými vedľajšími účinkami; klinické štúdie kyseliny kojovej skutočne poukázali na prípady erytému, pocitov štípania a kontaktného ekzému po aplikácii. Podobne Európsky vedecký výbor pre bezpečnosť spotrebiteľov vyjadril obavy týkajúce sa používania arbutínov ako kozmetických prísad [2] v dôsledku možnej hydrolýzy jeho glykozidickej väzby, ktorá uvoľňuje hydrochinón. Existuje teda potreba nových templátov molekúl a/alebo zmesí bioaktívnych zlúčenín na liečbu hyperpigmentácie.
Rastliny sú cennými zdrojmi činidiel na bielenie pokožky a tri z piatich najpoužívanejších činidiel, medicínsky aj kozmeticky, sú rastlinné špecializované metabolity (tj hydrochinón, -arbutín, aloesín). K dnešnému dňu boli fenolové zlúčeniny v zásade skúmané ako potenciálnetyrozinázainhibítory, medzi ktoré patria flavonoidy (napr. kvercetín [4]), stilbény (napr. resveratrol [1]), fenylpropanoidy (napr. cinnamaldehyd [5] a eugenol [6]) a fenolové kyseliny (napr. kyselina anízová a kyselina benzoová [7]). Záujem o forterpenoidy bol podstatne nižší a relatívne boli nedostatočne skúmané ako antityrozinázové činidlá.
Citral patrí medzi obmedzený počet terpenoidných derivátov s antityrozinázovými vlastnosťami, ktoré boli študované. Ide o zmes dvoch izomérov, cis- a trans-3,7-dimetyl-2,6-oktadienalu (tj neralu a geranialu), o ktorých sa dokázalo, že blokujú enzymatická aktivita húb in vitrotyrozináza[8]. Okrem toho, že citral je dôležitý ako vonná prísada do nápojov, potravín a kozmetiky, preukázal sľubné biologické aktivity in vitro vrátane protiplesňových, antibakteriálnych, antioxidačných a protizápalových účinkov [9–11]. zdôraznil, že citral má potenciálny terapeutický význam ako relaxér hladkého svalstva a lokálne anestetikum, pretože podporuje relaxáciu hladkého svalstva priedušnice, maternice a aorty a inhibuje dráždivosť nervov na zvieracích modeloch [12–15].
Citral sa získava z éterických olejov (EO) niekoľkých botanických druhov, vrátane Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. a Verbena officinalis L. To najlepšie od autorov. Zistilo sa, že iba L. cubeba EO bola skúmanátyrozinázainhibičná aktivita [16]. Preto je cieľom tejto štúdie zhodnotiť inhibičné aktivity tyrozinázy EOs C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis a V. officinalis pomocou kolorimetrického testu in vitro, aby sa posúdilo, či rôzne chemické zloženie ovplyvňuje celkové inhibičné aktivity EO prostredníctvom akéhokoľvek možné synergické, aditívne a/alebo konkurenčné interakcie medzi ich zložkami. Táto štúdia využíva frakcionačný prístup riadený abiotestom na komplexné vyhodnotenie zložiek EO a ich enantiomérov, keď sú chirálne, ktoré prispievajú k inhibičnej aktivite EO proti hubovému zdroju tyrozinázy, čo je dobrý modelový systém na predbežný skríningtyrozinázainhibítory [17].
2. Výsledky a diskusia
2.1. Chemické zloženie a obsah citralu skúmaného esenciálneho oleja
V našom pokuse komplexne charakterizovať všetky potenciálne zložky EO, ktoré prispievajú k uvažovanej biologickej aktivite, boli skúmané EO analyzované pomocou GC s detekciou FID aj MS. Stanovili sa normalizované relatívne percentuálne abundancie (vypočítané z absolútnych plôch normalizovaných na vnútorný štandard C13 pomocou faktorov odozvy [18,19]) všetkých detekovaných zlúčenín a použili sa na porovnanie zloženia EO. Obrázok 1 uvádza profil GC-MS skúmaných EO analyzovaných konvenčnou kolónou. Tabuľka 1 uvádza pre každý skúmaný EO zlúčeniny, ktoré vykazovali normalizované percentuálne zastúpenie nad 0.1, zatiaľ čo úplné chemické zloženie EO je uvedené v doplnkových materiáloch (tabuľky S1–S5).
Všetky skúmané EO sú bohaté na neral (cis{{0}},7-dimetyl-2,6-oktadienal) a geraniálny (trans-3,{ {5}}dimetyl-2,6-oktadienal), čo sú najrozšírenejšie zlúčeniny. Pomer Theneral/geranial bol veľmi podobný vo všetkých skúmaných EO a zodpovedal 0,74 ± 0,05. EO z C. schoenanthus a L. cubeba vykazujú najvyšší obsah nervov a geranií, čo predstavuje v priemere 60 percent ich celkového zloženia EO, čo je 1.{14}}krát viac ako v EO V. officinalis a v tri M. officinalis EO (tj Vzorka 1, 2 a 3). Ďalšie okysličené zlúčeniny, ktoré sú spoločné pre všetky EO, sú 6-metyl-5-heptén-1-on, linalool a citronellal. Ten je v M. officinalis EO 1 výrazne hojnejší ako v ostatných skúmaných EO, vrátane M. officinalis EO2 a 3.
Množstvo uhľovodíkovej frakcie sa výrazne líši v rôznych EOs.M. officinalis EO 1 obsahuje iba trans- -karyofylén a -humulén ako seskviterpénové uhľovodíky, ktoré tvoria 2,7 percenta a 0,13 percenta celkového EO. C. schoenanthus EO predstavuje o niečo bohatšiu uhľovodíkovú frakciu ako M. officinalis EO 1 (t. j. 7.0 percent), pričom obsahuje oba monoterpény (t. j. kamfén, cis{{1{{20). }}}}ocimén, limonén, -pinén,trans{12}}ocimén, -thujen) a seskviterpény (tj trans- -karyofylén, -kadinén,δ-kadinén, germacrén D, -elemén) v miernom sumy. V L. cubeba a V. officinalis EO tvorí uhľovodíková frakcia 20 percent z celkového EO a limonén je najrozšírenejšou zlúčeninou (tj 15,0 a 10,9 percenta, v uvedenom poradí), po ktorej nasleduje -pinén, pinén , sabinén, trans- -karyofylén, -myrcén, kamfén a -kopaén. Nakoniec M. officinalis EO 2 a 3 sa vyznačujú najvyšším obsahom uhľovodíkových frakcií (38,8 percent a 31,8 percent z celkového EO). V oboch vzorkách uhľovodíková frakcia obsahuje hlavne seskviterpény, a to trans- -karyofylén (27,8 percenta a 20,0 percenta) a -humulén (3,0 percenta a 2,6 percenta) a redukovanú monoterpénovú frakciu, ktorá je charakteristická hlavne limonénom ( 4,2 percenta a 3,2 percenta).
Skúmali sa tri vzorky L. cubeba, V. officinalis a C. schoenanthus Eos vyrobené v rôznych rokoch, ako aj tri vzorky EO M. officinalis od rôznych výrobcov. GC-MS analýzy C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis a V. officinalis neodhalili významné kvalitatívne a kvantitatívne rozdiely v chemickom zložení troch vzoriek z rôznych rokov výroby. Možno to pripísať optimálnym skladovacím podmienkam, tj v nádobe z jantárového skla pri teplote 4 °C v tme so zanedbateľným priestorom nad hlavou. karyofylén v troch skúmaných EO M. officinalis. Citronella predstavovala 19,6 percenta, 0,26 percenta a 0,31 percenta v M. officinalis EO 1, 2 a 3, v tomto poradí. Naopak, ako už bolo opísané, trans- -karyofylén je podstatne hojnejší v M. officinalis EO 2 a 3 ako v M. officinalis EO 1. Tieto výsledky sú v súlade so zisteniami, ktoré uvádza Seidler-Lozykawska et al., ktorí zdôraznili významné rozdiely v abundanciách citralu, citronelalu a trans{19}}karyofylénu v EO získaných z 22 vybraných genotypov M. officinalis pochádzajúcich z európskych botanických záhrad [20].
Skutočná kvantifikácia bola vykonaná externou štandardnou kalibráciou na presné vyhodnotenie množstva potenciálnych bioaktívnych špecializovaných zlúčenín (tj neral, geranial, limonén, -myrcén a citronelal. Tabuľky 2 a 3 uvádzajú diagnostické ióny (m/z) použité pre SIM- MS kvantifikácia skúmaných markerových zlúčenín spolu s kalibračným rozsahom, rovnicou kalibračnej krivky, korelačnými hodnotami a regresnou štandardnou chybou každého analytu a výsledkami kvantifikácie, v danom poradí.
2.2. In vitro inhibičná aktivita skúmaných esenciálnych olejov proti hubovej tyrozináze
Ako už bolo opísané, EO C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba a V. officinalis predstavujú vysoké hladiny citralu, ktorý je charakterizovaný nekompetitívnou inhibičnou aktivitou proti hubovému zdroju tyrozinázy [8,16,21]. . Táto štúdia bola zameraná na skúmanie in vitrotyrozinázainhibičné aktivity týchto EO, aby sa zistilo, či ich inhibičnú aktivitu možno pripísať iba ich obsahu citralu, alebo či existujú iné bioaktívne zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú inhibičné účinky EO.
Hubatyrozinázabol tu prijatý pre jeho vysokú homológiu s humantyrozinázou, relatívne nízku cenu a ľahkú dostupnosť, čo z neho robí dobrý modelový systém na predbežný skríning inhibítorov tyrozinázy [17]. Presnosť in vitrotyrozinázainhibičný test bol hodnotený z hľadiska opakovateľnosti (vykonaním testu enzymatickej inhibície päťkrát v ten istý deň) a strednej presnosti (opakovaním testu enzymatickej inhibície päťkrát každé štyri týždne počas obdobia šiestich mesiacov). Tabuľka 4 uvádza variačný koeficient (CV) pre inhibičné testy uskutočnené s kyselinou kojovou, ktorá sa použila ako pozitívna kontrola, a s L. cubeba EO. Výsledky boli uspokojivé, pretože CV nikdy neprekročilo 7 percent pre opakovateľnosť a 10 percent pre strednú presnosť. Tabuľka 4 uvádza variačný koeficient pre inhibičné testy uskutočnené s kyselinou kojovou, použitou ako pozitívna kontrola, a s L. cubeba EO. Podobné hodnoty presnosti boli získané pre všetky testované EO.
Krivka citral koncentrácia-odozva bola študovaná vynesením pozorovanej inhibičnej aktivity ako funkcie jeho koncentrácie v reakčnej zmesi. Všetky EO boli testované pri koncentrácii 166,7 µg/ml, čo poskytlo, bez ohľadu na EO, výslednú koncentráciu citralu v rámci rozsahu linearity krivky závislosti odozvy na koncentráciu (y=0,3956x plus 1,8094,R{{7} }.9951, regresná chyba: 2,08448, rozsah linearity: 6,7–166,7 µg/ml) a nespôsobil problémy s rozpustnosťou v reakčnej zmesi.
Krabicový graf uvedený na obrázku 2 predstavuje percentotyrozinázainhibícia pre každý EO. V prípade EO L. cubeba, V. officinalis a C. schoenanthus zodpovedajú výsledky uvedené na obrázku 2 inhibičnej aktivite EOs na hubovú tyrozinázu 2020, pretože analýza rozptylu neodhalila žiadne štatisticky významné rozdiely medzi EO rôznych rokov výroby (p > 0,05). Pokiaľ ide o EO L. cubeba a C. schoenanthus, tieto výsledky sú v dobrej zhode s výsledkami získanými z kvantitatívnych analýz GCMS, ktoré odhalili takmer identické množstvo citralu v EO rôznych rokov výroby. Šarža 2020 V. officinalis EO obsahuje o niečo vyššie množstvo citralu ako šarže 2019 a 2018. Podľa krivky koncentrácia citralu – odozva však prebytok citralu v šarži 2020 nestačí na určenie štatisticky významného vyššieho percenta enzymatickej inhibície vzhľadom na náhodný chyba spojená s meraniami. Ďalšie podrobnosti nájdete na obrázku S1 v doplnkovom materiáli. Na druhej strane analýza rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukey-Kramer post-hoctest, odhalila, že tri testované EO M. officinalis, poskytované rôznymi výrobcami, inhibovali hubytyrozinázav rôznom rozsahu, ktorý bude bližšie popísaný v nasledujúcich odsekoch. Najväčšie inhibičné aktivity boli pozorované pre EO L.cubeba, M. officinalis 1 a V. officinalis, ktoré inhibovali 59 ± 6 percent, 55 ± 7 percent a 52 ± 6 percenttyrozinázapri testovaní pri koncentrácii 166,7 ug/ml. Štatisticky významné (p < 0,05)="" nižšie="" aktivity="" boli="" pozorované="" pre="" eos="" c.="" schoenanthus="" a="" m.="" officinalis="" 2="" a="" 3,="" ktorých="" enzýmová="" inhibičná="" aktivita="" bola="" 42="" ±="" 5="" percent,="" 40="" ±="" 5="" percent="" a="" 38="" ±="" 6="" percent,="" resp.="" tabuľka="" 5="" uvádza="" koncentráciu="" inhibítora,="" ktorá="" znížila="" aktivitu="" enzýmu="" na="" polovicu="" za="" daných="" experimentálnych="" podmienok="" (ic50)="" pre="" každý="" skúmaný="" inhibítor="" (tj="" eo,="" jednotlivé="" zlúčeniny="" a="" kyselinu="" kojovú).="" všetky="" eo="" účinne="" inhibovali="" hubovú="" tyrozinázu="" a="" vykazovali="" inhibičnú="" aktivitu,="" ktorá="" bola="" v="" priemere="" 100--krát="" nižšia="" ako="" aktivita="" kojicacidu,="" ktorá="" bola="" použitá="" ako="" pozitívna="">
2.3. Identifikácia ďalších bioaktívnych zložiek okrem citralu frakcionáciou riadenou biotestom Histogram uvedený na obrázku 3 porovnáva percento experimentálne nameraných enzymatických inhibícií s hodnotami, ktoré by sa očakávali, ak by boli neral a geranial (považované za súčet, tj citral) iba aktívne zlúčeniny v skúmaných EO. Tieto hodnoty boli namerané interpoláciou z krivky citral koncentrácia-odozva. Ako je možné poznamenať, C. schoenanthus, M. officinalis 2 a M. officinalis 3 vykazovali inhibičné aktivity, ktoré boli v súlade s ich obsahom citralu, zatiaľ čo EO L. cubeba, M. officinalis 1 a V. officinalis inhibovali huby tyrozinázy vo väčšom rozsahu, ako sa očakávalo. Na identifikáciu ďalších zlúčenín, ktoré prispievajú k citralovej aktivite, bol prijatý bio-riadený prístup. Okysličené a uhľovodíkové frakcie EO L. cubeba, M. officinalis 1 a V. officinalis boli izolované pomocou flash chromatografie a individuálne testované na ich huby.tyrozinázainhibičné aktivity. Fytochemické frakcie boli testované na inhibičné aktivity hubovej tyrozinázy. Frakcie fytochemických frakcií boli testované v rovnakej koncentrácii ako ich výsledná koncentrácia pri testovaní 166,7 µg/ml príslušného EO (pozri časť Materiály a metódy v sekcii 3.2). a -myrcén v okysličených a uhľovodíkových frakciách frakcionovaných EO.
Čo sa týka EO L. cubeba a V. officinalis, tak okysličené, ako aj uhľovodíkové frakcie inhibovali tyrozinázu húb, hoci v rôznom rozsahu. Aktivity okysličených frakcií (53 ± 3 percentá a 44 ± 5 v uvedenom poradí) zodpovedajú za väčšinu EOsanti-tyrozinázapotenciál a boli v súlade s príslušným obsahom citralu, čo naznačuje, že zlúčeniny, ktoré prispievajú k aktivite citralu, patria k uhľovodíkovým frakciám. Uhľovodíkové frakcie EO L. cubeba a V. officinalis majú celkom podobné chemické zloženie. limonén (68,4 a 5{7}},3 percenta), trans- -karyofylén (12.{26}} a 7,8 percenta), -pinén (1,7 a 7,5 percenta), -pinén (2,5 a 12,9 percenta v uvedenom poradí), sabinén (2,7 a 3,8 percenta) a -myrcén (2,0 a 2,4 percenta, v tomto poradí) sú najhojnejšie zlúčeniny v oboch frakciách a sú prítomné v dosť podobných množstvách, s výnimkou -pinén a -pinén, ktoré prevládajú v uhľovodíkovej frakcii EO V. officinalis.
The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 percent v oboch EO), limonén (97 a 94 percent v L. cubeba a V. officinalis EO, v uvedenom poradí) a sabinén (87 percent v oboch EO), zatiaľ čo rôzne enantiomérne prebytky boli pozorované pre -pinén ((-)- enantiomér: 38 percent v L. cubebaEO a 73 percent v V. officinalis EO) a -pinén ((-)-enantiomér: 67 percent v L. cubeba EO a 88 percent vo V. officinalis EO). V oboch EO tvorí (-)-limonén viac ako 50 percent celej frakcie. Hoci predchádzajúce štúdie uvádzali inhibičnú aktivitu proti tyrozináze húb kvôli jej vysokému výskytu [22,23], (-)-limonén tu nepreukázal inhibičnú aktivitu tyrozinázy. Podobné výsledky sa získali pre (plus)-limonén, racemickú zmes a zlúčeniny (-)-trans- -karyofylén, (±)- -pinén a (±)- -pinén . Sabinene nebol testovaný, pretože už bolo preukázané, že má zanedbateľné množstvo húbtyrozinázainhibičné účinky [8]. V súlade s predchádzajúcimi zisteniami [8] znížil myrcén aktivitu tyrozinázy húb. Pri testovaní pri koncentrácii pozorovanej v 166,7 ug/ml L. cubeba a V. officinalis EO, aktivita -myrcénu preklenula medzeru medzi očakávanými inhibičnými účinkami EO, ak bol citral jedinou aktívnou zlúčeninou a experimentálnymi výsledkami. Na rozdiel od pozorovaní Matsuuru a kol. [8], -myrcén sa ukázal byť silnejším inhibítorom hubovej tyrozinázy ako citral, pretože jeho IC50 bolo takmer desaťkrát nižšie (13,3 µg/ml oproti 121,8 µg/ml). Tento rozdiel možno pripísať rôznym použitým substrátom; Matsuura a kol. skúmali iba aktivitu hubovej tyrozinázy difenolázy, pretože ako substrát použili L-DOPA, zatiaľ čo v tejto štúdii sa použil L-tyrozín. Súčasné zistenia naznačujú, že -myrcén môže byť účinnejší pri inhibícii aktivity monofenolázovej tyrozinázy húb ako difenolázová.
M. officinalis EO 1 vykazuje malú uhľovodíkovú frakciu, ktorá predstavuje menej ako 3 percentá z celkového množstva a nemá žiadnu inhibičnú aktivitu voči tyrozináze. Okysličená frakcia M. officinalisEO 1 však inhibovala hubovú tyrozinázu vo väčšom rozsahu, ako by sa dalo očakávať z jej obsahu citralu (obrázok 3). Táto frakcia obsahuje okrem neralu a geranialu značné množstvá citronellalu a chirálna analýza odhalila vysokú enantiomérnu čistotu citronellalu v prospech (plus) enantioméru (98,3 percent). Keď bol testovaný nezávisle, v koncentrácii 166,7 µg/ml, (plus)-citronellal inhiboval hubtyrozinázu v zanedbateľnom rozsahu, hoci jeho aktivita bola významne zvýšená, keď sa testoval v kombinácii s citralom. Tieto výsledky môžu vysvetliť rozdiely pozorované v percentách húbtyrozinázainhibíciu v rôznych EO M. officinalis. M. officinalis EO 2 a 3 majú veľmi nízky obsah citronelalu, čo môže byť dôvodom, prečo sú ich inhibičné aktivity výrazne nižšie ako u M. officinalis EO 1.
3. Materiály a metódy
3.1. Činidlá
Dimetylsulfoxid (DMSO), hubová tyrozináza z Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrozín, kyselina kojová, citral, citronellal, -myrcén, (plus)-limonén, (-)-limonén,(±)-limonén, ( ±)- a pinén boli zakúpené od Merck Life Science Srl (Milán, Taliansko). Litsea cubeba, Verbena officinalis a Cymbopogon schoenanthus EO boli dodané spoločnosťou Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Taliansko). Pre každú boli testované tri šarže rôznych rokov (tj 2020, 2019, 2018). Skúmali sa tri vzorky EO Melissa officinalis; jednu poskytla Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), jednu ErboristeriaMagentina Srl, zatiaľ čo posledná bola zakúpená v miestnom obchode a bola od SpecchiasolS.rl (Busolengo, Taliansko). V texte autori označujú rôzne EO Melissaofficinalis ako M. officinalis EO 1, 2 a 3, v tomto poradí. Poskytnuté EO boli získané podľa postupov opísaných v Európskom liekopise [24]. Melissa officinalis a Verbena officinalis EO sa vyrábali hydrodestiláciou z listov a vzdušných častí rastlín; podobne, Litsea cubeba a Cymbopogon schoenanthus EO sa získali parnou destiláciou čerstvého ovocia a čerstvých nadzemných častí. Každý EO bol individuálne analyzovaný pomocou GC-MS hneď, ako bol zakúpený/dodaný príslušným výrobcom, každý rok skladovania a tesne pred štúdiom jeho inhibičnej aktivity na hubovú tyrozinázu.
3.2. In vitro test inhibície tyrozinázy
Thetyrozinázainhibičné aktivity EO a izolovaných zlúčenín boli skúmané in vitro pomocou kolorimetrického enzýmového testu založeného na čítaní optimalizovaného Zenghom a kol. [25], s malými úpravami. Tyrozinázové inhibičné aktivity EO, ako aj ich príslušné uhľovodíkové a okysličené frakcie a čisté zlúčeniny boli skúmané in vitro pomocou kolorimetrického enzýmového testu založeného na čítaní, ktorý optimalizovali Zengh et al. [25], s miernymi úpravami: test sa uskutočnil pri teplote miestnosti atyrozinázainhibícia sa merala s ohľadom na absorbanciu kontroly a vzorky po 6 minútach inkubácie, a nie po 20 minútach, aby prebiehala pod lineárnou časťou enzymatickej reakcie, čo poskytuje presnejšie výsledky inhibície [26,27]. Pre túto štúdiu bola vybraná hubová tyrozináza z Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach. Ako substrát bol použitý L-tyrozín, čo znamená, že celková inhibičná aktivita tyrozinázy bola skúmaná bez rozlíšenia medzi aktivitou tyrozinázy monofenolázy a difenolázovej aktivity. Fotometrické merania pri 475 nm sa uskutočňovali na Thermo specttronic Genesys6 a ako inhibítor pozitívnej kontroly sa použila kyselina kojová. Roztoky skúmaných potenciálnych inhibítorov (EO, izolované frakcie EO, jednotlivé zlúčeniny EO a kyselina kojová) boli pripravené v DMSO. Tabuľka 7 uvádza testované koncentrácie pre každý skúmaný potenciálny inhibítor. Hubatyrozinázaroztok 200 U/ml (27,9 ug/ml) bol pripravený v pufri fosforečnanom sodnom (pH 6,8) a alikvóty s objemom 9 ml boli skladované pri -18 ◦C a rozmrazené tesne pred experimentmi. Roztok tyrozínu 0 0,1 mg/ml bol pripravený v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného (pH 6,8) a denne obnovovaný. Zložky reakčnej zmesi sa umiestnili do liekovky v nasledujúcom poradí: 1 ml roztoku hubovej tyrozinázy 200 U/ml; 1 ml tlmivého roztoku fosforečnanu sodného; 10 ul roztoku EO/jedna zlúčenina/kyselina kojová; a nakoniec 1 ml roztoku tyrozínu 0,1 mg/ml. Konečné percento DMSO v reakčnej zmesi bolo 0,3 percenta. Test sa uskutočnil v uzavretej 4 ml fľaštičke, aby sa zabránilo strate akýchkoľvek zložiek EO do okolitého prostredia a aby sa minimalizovalo ich uvoľnenie do priestoru nad reakčnou zmesou. Reakčná zmes bola inkubovaná v termostatickom vodnom kúpeli pri 25 °C počas 6 minút. Následne sa zaregistrovala absorbancia pri 475 nm, pretože táto vlnová dĺžka umožňuje identifikáciu dopacrómu. Absorbancia zodpovedajúca 100 percentám tyrozinázovej aktivity sa merala nahradením roztoku EO/jednotlivá zlúčenina/kyselina kojová 10 ul čistého DMSO. Prázdne roztoky sa pripravili nasledovne: 2 ml tlmivého roztoku fosforečnanu sodného, 10 ul EO/individuálna zlúčenina roztok kyseliny kojovej/DMSO a 1 ml tyrozínového roztoku 0,1 mg/ml. Percento inhibície tyrozinázy sa meralo podľa nižšie uvedenej rovnice: percento inhibície=∆A (kontrola) − ∆A (vzorka) / ∆A (kontrola) × 100, ∆A (kontrola) alebo (vzorka) {{ 33}} A475 (kontrola) alebo (vzorka) − A475 (kontrola slepá) alebo (vzorka slepá).
3.3. Flash kolónová chromatografia
Frakcionácia EO sa uskutočnila na flash stĺpcovom chromatografickom systéme PuriFlash450 od Sepachromu (Rho, Miláno, Taliansko), vybavenom UV aj ELSD detektormi. Množstvo frakcionovaného EO: 900,0 mg. Stacionárna fáza: sférické častice silikagélu, 50 um, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) boli od Sepachromu; mobilná fáza: petroléter (A) a etylacetát (B); prietoková rýchlosť 25 ml/min. Lineárna gradientová elúcia bola prijatá od 100 percent A do 80 percent A a 20 percent B počas 20 minút.
3.4. Podmienky analýzy
Roztoky EOs a roztoky ich príslušných frakcií sa pripravili v cyklohexánáte s koncentráciou 5 0 mg/ml a analyzovali sa pomocou GC-MS. Citral, citronelal, -myrcén a limonén boli kvantifikované v každom EO a zodpovedajúcich izolovaných frakciách použitím externej štandardnej kalibračnej metódy. Vhodné kalibračné hladiny boli pripravené v cyklohexáne a analyzované pomocou GC-MS. Tridekán (C13) 1.0 mg/ml sa použil ako vnútorný štandard na normalizáciu signálov analytu. Tabuľka 2 sumarizuje uvažovaný koncentračný rozsah pre každú kvantifikovanú zlúčeninu.
GC-MS analýzy sa uskutočnili pomocou viacúčelového vzorkovača Gerstel MPS{1}} (Mülheim an der Ruhr, Nemecko) nainštalovaného na Agilent 689{14}} N GC pripojenom k 5975 MSD a vybavenej ChemStation verzia E. 02.0Systém na spracovanie údajov 2.1431 (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA). Podmienky GC: teplota vstrekovača: 250 ◦C; vstrekovací režim: rozdelený; pomer: 1/20; nosný plyn: hélium; konštantný prietok: 1 ml/min; kolóny: Mega5 (95 percent polydimetylsiloxán, 5 percent fenyl) df 0,25 um, dc 0,25 mm, dĺžka 25 m, od MEGA (Legnano, Taliansko). Teplotný program: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C (5 min). Podmienky MSD: MS prevádzkované v režime EI (70 eV); rozsah skenovania: 35 až 350 amu; doba zotrvania 40 ms; teplota iónového zdroja: 230 ◦C; štvorpólová teplota: 150 ◦C; teplota prenosovej linky: 280 ◦C. Markery EO boli identifikované porovnaním ich lineárnych retenčných indexov (IT), vypočítaných oproti zmesi uhľovodíkov C9-}C25, a ich hmotnostných spektier buď s autentickými vzorkami, alebo z komerčne dostupných hmotnostných spektrálnych knižníc (Adams, 2007). EO chirálne analýzy sa uskutočnili použitím rovnakých podmienok analýzy na 2,3-di-O-metyl-6-ot-butyldimetylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS-CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, dĺžka 25 m od MEGA. Teplotné programy: 40 ◦C(1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).
GC-FID analýzy sa uskutočňovali na rovnakom prístroji. Podmienky GC: teplota vstrekovača: 250 ◦C; režim vstrekovania: split; pomer: 1/20; nosný plyn: vodík; prietok: 1 ml/min. Teplotné programy: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).
4. Závery
Účelom tohto skúmania bolo (1) komplexne preskúmať hubu in vitrotyrozinázainhibičné aktivity Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis a Verbena officinalis EO a (2) určiť, či sa ich biologická aktivita pripisuje iba ich citralovému obsahu alebo či existujú ďalšie bioaktívne monoterpény, ktoré prispievajú k skúmanej biologickej aktivite použitím biotestom riadený frakcionačný prístup. Táto štúdia zistila, že v L. cubeba a V. officinalis EO, -myrcén prispieva k inhibičným aktivitám EOs napriek jeho malému množstvu a ukázalo sa, že má väčšiu inhibičnú silu na citral. Druhým hlavným zistením bolo, že (plus)-citronellal zosilnil citralovú hubutyrozinázainhibičná sila, potenciálne viasynergická interakcia, keďže sama o sebe nevykazovala žiadnu aktivitu. Posledné zistenie vysvetlilo, prečo v EO M. officinalis, ktoré nesú zanedbateľné množstvá (plus)-citronellalu, boli inhibičné aktivity v súlade s ich obsahom citralu, zatiaľ čo opak bol pravdou pre EO M. officinalis s relatívne vysokým výskytom (plus)-citronellalu. aj keď sú stále potrebné ďalšie štúdie na presné definovanie typu interakcií, ktoré sa vyskytujú medzi -myrcénom a citralom a medzi citronellalom a citralom, a na posúdenie inhibičných aktivít týchto EO a jednotlivých zlúčenín na človeka.tyrozinázaVýsledky tejto štúdie môžu pomôcť racionálne navrhnúť zmesi EO alebo obohatených EO, ktoré zlepšujú ich biologickú účinnosť a zvyšujú ich potenciál ako adjuvancií pri liečbe hyperpigmentácie.
Referencie
1. Pillaiyar, T.; Maničkam, M.; Namasivayam, V. Činidlá na bielenie kože: perspektíva inhibítorov tyrozinázy z lekárskej chémie.J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]
2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Prehľad látok na bielenie pokožky s pohľadom na nelegálny kozmetický trh v Európe. J. Eur. Akad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]
3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Charakterizácia podozrivých nelegálnych kozmetických prípravkov na bielenie kože. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]
4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonoly z kvetu šafranu: Inhibičná aktivita tyrozinázy a mechanizmus inhibície. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4121-4125. [CrossRef]
5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Chemické zloženie a inhibičná aktivita tyrozinázy esenciálneho oleja Cinnamomum cassia. Bot. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]
6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Účinok tyrozinázových onorto-substituovaných fenolov: Možný vplyv na hnednutie a melanogenézu. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]
7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Inhibítory tyrozinázy z rasce. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338-5341. [CrossRef]
8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tyrozinázová inhibičná aktivita citrusových esenciálnych olejov. J. Agric. Food Chem. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]
9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro bioaktivity esenciálnych olejov používaných na kontrolu akné. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]
10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biologické vlastnosti citralu a jeho potenciálne ochranné účinky proti cytotoxicite spôsobenej aspirínom v bunkách IEC-6. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]
11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; No, YH; Yuk, DY; Hong, JT Inhibičný účinok citralu na produkciu NO potlačením expresie iNOS a aktiváciou NF-KB v bunkách RAW264.7. Arch. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]
12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Účinok esenciálneho oleja Lippia alba (Mill.) NE Hnedý esenciálny olej a jeho hlavné zložky, citral a limonén, na tracheálny hladký sval potkanov. Biotechnol. rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]
13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Tokolytická aktivita esenciálneho oleja Lippia alba a jeho hlavných zložiek, citralu a limonénu, na izolovanú maternicu potkanov. Chem. Biol. Interagujte. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]
14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Vasorelaxačný účinok esenciálneho oleja Lippia alba a jeho hlavnej zložky, citralu, na kontraktilitu izolovanej aorty potkana. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]
15. Sousa, GR; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Esenciálny olej z Lippia alba a jeho hlavná zložka citral blokuje dráždivosť sedacích nervov potkana. Braz. J. Med. Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]
16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Potenciálna kozmetická aplikácia esenciálneho oleja extrahovaného z plodov Litsea cubeba z Číny. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]
17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Komplexný prehľad o inhibítoroch tyrozinázy. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]
18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Kvantitatívna analýza éterických olejov: komplexná úloha. Príchuť Fragr. J. 2008, 23, 382-391. [CrossRef]
19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Esenciálne oleje a prchavé látky: Príprava a analýza vzoriek. A review.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]
20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Hodnotenie variability morfologických a chemických znakov vybraných genotypov medovky lekárskej (Melissa officinalis L.). Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]
21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrozinázová inhibičná aktivita aromatických zlúčenín olivového oleja. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574 – 4578.[CrossRef] [PubMed]
22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Chemické zloženie a anti-melanogénny potenciál rôznych esenciálnych olejov. Príchuť Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]
23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Inhibičný účinok citrónového esenciálneho oleja na aktivitu tyrozinázy húb in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]
24. Rada Európy. European Pharmacopoeia, 10. vydanie; Rada Európy: Štrasburg, Francúzsko, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.
25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Charakterizácia inhibítorov tyrozinázy v vetvičkách Cudrania tricuspidata a štúdia ich vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]
26. Williams, KP; Scott, JE Enzyme Assay Design pre vysokovýkonný skríning. Pri vysokovýkonnom skríningu. Metódy v molekulárnej biológii (metódy a protokoly); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, USA, 2009; Zväzok 565, s. 107–126.
27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Základy enzymatických testov pre HTS. In Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company a National Center for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, USA, 2004
