Expresia Clr-f reguluje imunitnú a metabolickú homeostázu obličiek Ⅱ

Tubulárne a glomerulárne lézie obličiek u myší s deficitom Clr-f.

Počiatočné vyšetrenieClr-f−/− rezy obličiek odhalili niekoľko zmien v obličkovej kôre. Vyhodnotiťhistopatologické lézie, Rezy obličiek zafarbené PASod štyroch 12-týždňových WT aClr-f-/- myši boli hodnotené zaslepeným spôsobom (obr.2A). Premenlivá prítomnosť proximálnych a distálnych tubulárnych lézií bola pozorovaná vClr-f-/- obličky, ktoré zahŕňali výkrm tubulárnych epiteliálnych buniek, posunutie jadra a stratu kefových lemov (obr.2A; horné panely). V zriedkavých prípadoch bola v niektorých skúmaných oblastiach zistená tubulárna nekróza vo forme akumulácie luminálnych nekrotických zvyškov a úplnej straty epitelu. TheClr-f−/− obličky tiež vykazovaliglomerulárne patológie(Obr.2A; spodné panely), s oblasťami fokálneho zhrubnutia glomerulárnych tufov, minimálnou proliferáciou periglomerulárnych fibroblastov spojenou s miernou intersticiálnou fibrózou a závažnejšími léziami s mesangiolýzou, kapilárnymi aneuryzmami, ktoré progredovali do výrazného narušenia glomerulov a konštantnou prítomnosťou nekrotizujúceho bunkového odpadu v Bowmanových priestoroch . Skóre glomerulárnej patológie odhalilo významný početglomerulárne lézieu myší s deficitom Clr-f v porovnaní s WT súrodencami (obr.2B). Elektrónová mikroskopia odhalila vážne poškodenie podocytov, vymazanie výbežku podocytovej nohy a výrazné zhrubnutie podocytov.glomerulárneho suterénumembrána (GBM) (obr.2C,D).

Click to cistanche herba pre ochorenie obličiek

Na posúdenie, či boli prítomné depozity imunoglobulínu v obličkách, ktoré sú charakteristicky spojené s pozorovanými patológiami, sme zafarbili rezy obličkovej kôry WT a Clr-f-/- obličiek na prítomnosť IgA, IgM a IgG protilátok pomocou IF (obr. 2E ). Obličky Clr-f−/− vykazujú jasné dominantné IF farbenie glomerulárnych IgA depozitov sprevádzané výraznými depozitmi IgM a menšou, ale konzistentnou prítomnosťou depozitov IgG. Podobne sme detegovali podobné vzory tubulointersticiálnych depozitov IgA, IgM a IgG v obličkách Clr-f-/-. Komplementový proteín C3 bol tiež široko detekovaný v obličkách Clr-f-/-, ale nie v obličkách WT (obr. 2F).

Clr-f je potrebný pre správnu funkciu obličiek.

Na vyhodnotenie vplyvu patológií Clr-f-/- na funkciu obličiek sme analyzovali zloženie krvi a moču od 12-týždňových samcov Clr-f-/- a WT súrodencov. Zistili sme mierny, ale štatisticky významný nárast pomeru moču a bielkovín ku kreatinínu (UP/CR) u Clr f -/- myší v porovnaní s WT myšami, so zvýšeným sérovým kreatinínom, ale podobnými hladinami bielkovín v moči v porovnaní s WT myšiam, ako aj podobné frakčné vylučovanie sodíka (FENa) (obr. 2G). Vzhľadom na tubulárnu expresiu Clr-f sme hodnotili, či bol ovplyvnený krvný tlak Clr-f-/- myší u 12-týždňových a 24-týždňových myší Clr-f-/-. Clr-f-/-myši vykazovali marginálny, ale štatisticky nevýznamný pokles krvného tlaku v porovnaní s WT súrodencami (obr. 2H). Tieto výsledky ukazujú, že normálna filtrácia obličiek je zmenená v neprítomnosti Clr-f, ale Clr-f nevykazuje žiadne významné úlohy v homeostáze renálnych elektrolytov alebo regulácii krvného tlaku.

Transkriptóm obličiek Clr‑f−/− vykazuje dysreguláciu metabolizmu.

Preskúmať základné transkripčné procesy zodpovedné za Clr-f-/-obličkové patofenotypysme vykonali sekvenovanie RNA na obličkách 7-, 13- a 24-týždňových myší WT a Clr-f−/−. Rozdielne exprimované gény (DEGs) u Clr-f-/- myší v porovnaní s WT myšami boli skúmané analýzou funkčného obohatenia a analýzou transkripčného patotypu (obr. 3A). Zmapovali sme interakčné siete obohatených biologických procesov z analýzy obohatenia génovej sady (GSEA) DEG identifikovaných v každom veku (obr. 3B). Naša analýza ukázala obohatenie génov súvisiacich s bunkovým cyklom upregulovaných v obličkách 7-týždňových myší Clr-f−/−. Po 13 týždňoch boli metabolické procesy, transport, bunková smrť a reakcie na toxické látky obohatené o DEG so zvýšenou expresiou v obličkách Clr-f-/-, zatiaľ čo nepohyblivé zostavenie riasiniek, transkripcia DNA a spracovanie boli obohatené z DEG o znížená expresia. Obličky 24-týždňových Clr-f−/− myší tiež vykazovali obohatenie metabolických procesov a transportu medzi DEG so zvýšenou expresiou, ako aj procesov, ktoré regulujúkrvný obeh, zatiaľ čo bunková smrť, imunita a procesy regulácie signalizácie transformujúceho rastového faktora-beta (TGF) boli obohatené o DEG so zníženou expresiou.

Aby sme zachytili procesy súvisiace s vekom, ktoré sú základom defektov obličiek Clr-f-/-, analyzovali sme gény patriace do štyroch dynamických vzorcov diferenciálnej expresie: DEG, ktoré sa zvyšujú s vekom, znižujú sa s vekom alebo sa prechodne zvyšujú alebo znižujú vo veku 13 týždňov. Funkčná analýza obohatenia biologických procesov, molekulárnych funkcií a definovaných dráh medzi týmito skupinami odhalila, že DEG so zvyšujúcou sa expresiou od 7 do 24 týždňov veku v obličkách Clr-f-/- boli nadmerne zastúpené v metabolických dráhach lipidov, zatiaľ čo DEG súvisiace s bunkami adhézia substrátu sa znížila v expresii od 7 do 24 týždňov veku (obr. 3C). DEG s prechodným zvýšením expresie vo veku 13 týždňov boli väčšinou spojené s mitochondriálnym dýchaním, zatiaľ čo DEG s prechodným znížením expresie mapované na dráhy bunkového cyklu. V rámci týchto štyroch kategórií dynamickej expresie boli tri podskupiny, ktoré predstavujú rozdielne vzorce expresie, v ktorých veľkosť zmeny expresie medzi 7. a 13. týždňom bola buď podobná, vyššia alebo nižšia ako stupeň zmeny medzi 13. a 24. týždňom veku. (obr. 3C). Obohatené biologické procesy a molekulárne funkcie z každého podklastra génov boli do značnej miery odlišné v štyroch hlavných vzorcoch dynamickej expresie, ktoré boli identifikované, ale odrážali prekrývajúce sa alebo súvisiace bunkové procesy v rámci každej skupiny. Celkovo transkripčný profil obličiek Clr-f-/- odhaľuje dynamickú a vyvíjajúcu sa dysreguláciu bunkového metabolizmu, funkcie a homeostázy.

Clr‑f−/− myši hromadia tuk.

Identifikované zvýšenie DEG súvisiace s vekom súvisiace s metabolizmom lipidov nás viedlo k testovaniu údajov o expresii myší WT a Clr-f-/- pre známe gény spojené s lipidmi. Väčšina z týchto génových transkriptov bola zvýšená u Clr-f-/- myší (obr. 4A) a zosúladená s nárastom abdominálnych a perirenálnych tukových usadenín u Clr-f-/- myší vo veku 24 týždňov (obr. 4B). Hoci Clr-f-/- a WT myši vykazovali podobnú telesnú hmotnosť (obr. 4C), hmotnosť abdominálneho tuku u Clr-f-/- myší bola výrazne vyššia, čo naznačuje, že tukové tkanivo predstavovalo zvýšený podiel Clr-f −/− telesná hmotnosť myši (obr. 4D). Tiež sme detekovali ektopickú akumuláciu lipidov v obličkách Clr-f-/- myší, o čom svedčí zvýšené ORO farbenie Clr f-/- myších obličiek (obr. 4E). Keďže perirenálny tuk a prítomnosť intersticiálneho tuku v obličkách sú spojené s metabolickými rizikovými faktormi CKD21, predpokladali sme, či Clr-f chráni protietiológie diabetualebosúvisiace metabolické poruchySpojené sCKD.

Obličky myší Clr‑f−/− majú transkripčný profil podobnosti a rozdiely s ochorením obličiek u ľudí.

Ektopická akumulácia lipidov v obličkách je spojená so zápalom, fibrózou, mitochondriálnou dysfunkciou a bunkovou smrťou22,23. Aby sme zhodnotili, či obličky Clr-f-/- pripomínajú definované ochorenia obličiek, porovnali sme transkripčný profil obličiek Clr-f-/- s publikovanými expresnými profilmi obličkového tkaniva a/alebo krvi zľudských darcov s CKD, diabetická nefropatia(DN), lupusová nefritída (LN), prípIgA nefropatia(IgAN) (obr. 5A). Transkripčné profily obličiek Clr-f−/− sa zoskupili s krvou od pacientov s IgAN a glomerulárneho tkaniva pacientov s DN (obr. 5B). Porovnanie profilov expresie pacientov s Clr-f-/- a IgAN analýzou funkčného obohatenia ukázalo paralelné zvýšenie génovej expresie súvisiacej s bunkovými reaktívnymi oxidovými reakciami, bunkovou smrťou, proteolýzou a metabolizmom amidov, ako aj spoločné zníženie génovej expresie spojenej s membránou obchodné procesy, organizácia cytoskeletu, signalizácia PI3K-AKT, bunkový cyklus a metabolizmus DNA/RNA (obr. 5C). Naopak, sady expresie Clr-f-/- obličiek sa líšili od IgAN so zvýšenou expresiou génov patriacich k signálnym dráham AGE-RAGE, ErbB, TNF/MAPK a Rap1 a procesmi vazopresínu regulovanej reabsorpcie vody a aktivity lyzozómov, a znížená expresia génov patrila k spojeniu adherentov, nepohyblivému zostaveniu riasiniek, cyklovaniu buniek, metabolizmu DNA a signalizácii TGF. Tieto zistenia naznačujú, že podobne ako IgAN, bunkové procesy kontroly rastu, homeostázy a opravy sú tiež dysregulované v obličkách Clr-f-/-, zatiaľ čo zmenený metabolizmus, signalizácia stresu aštruktúra epitelua funkcia sú jedinečné pre Clr-f−/− obličky.

Obličky s nedostatkom Clr-f vykazujú zápal a infiltráciu imunitných buniek.

Vzhľadom na známe imunomodulačné úlohy pre proteíny Clr sme skúmali príspevok imunitných buniekClr-f−/− patológia obličiek. Pomocou prietokovej cytometrie sme analyzovali zloženie imunitných buniek 12-týždňových myší WT a Clr-f−/− celých obličiek. Naša analýza odhalila významné zvýšenie počtu neutrofilov, T buniek a B buniek, ale žiadny rozdiel v počte obličkových NK buniek, ILC alebo makrofágov (obr. 6A). Pri analýze periglomerulárnej distribúcie imunitných buniek v obličkovej kôre WT a Clr-f-/- obličiek pomocou IF sme pozorovali glomerulárnu akumuláciu CD45+ buniek (obr. 6B). Označenie CD11c, F4/80, NKp46 a CD3, markerov indikujúcich DC, makrofágy, NK/ILC a T bunky, v danom poradí, odhalilo intraglomerulárnu akumuláciu CD11c+ buniek (obr. 6C) a periglomerulárnu akumuláciu F4/{{ 16}}, NKp46+ a CD3+ bunky v obličkách Clr-f−/− (obr. 6D). Vizuálna kvantifikácia populácií imunitných buniek detegovaných v glomeruloch potvrdila významné zvýšenie prítomnosti každej z týchto populácií imunitných buniek v obličkách myší Clr-f-/- v porovnaní s myšami WT (obr. 6E). Imunitný infiltrát pri autoimunitnom ochorení obličiek je zosilnený tubulárnou sekréciou IL-12, ktorá vyvoláva poškodenie bunkami vylučujúcimi IFN24–26. Preto sme skúmali obličky WT a Clr-f-/- na prítomnosť týchto cytokínov a pozorovali sme farbenie IL-12 aj IFN v bunkách Clr-f−/− obličkového tubulointerstícia (obr. 6F, G).

Pretože sa predpokladá, že Clr-f je signálom bunkového zdravia pre bunky exprimujúce NKR-P1G, predpokladali sme, že renálna imunitná infiltrácia u Clr-f-/- myší je čiastočne spôsobená zvýšenou prítomnosťou lymfocytov exprimujúcich NKR-P1G. v obličkách. Analýza expresie NKR-P1G na obličkových TCR + T bunkách a NK1.1+ NK bunky u myší WT a Clr f −/− prietokovou cytometriou neukázala žiadny rozdiel v strednej intenzite fluorescencie farbenia NKR-P1G na obličkovej NK bunky, ale zvýšenie NKR-P1G farbenia renálnych T buniek u Clr-f-/- myší (obr. 6H)

Obrázok 5. Porovnanie medzi transkripčnými profilmi myší Clr-f-/- a ľudských CKD. (A) Tabuľka súborov údajov o profile génovej expresie 15 ľudských renálnych porúch oproti 13-týždňovým Clr-f−/− myšiam. Referenčný zdroj pre zdroje súboru údajov o profile ľudskej expresie je označený v stĺpci Štúdia. (B) Matica podobnosti zobrazujúca hierarchické zoskupenie profilov diferenciálnej génovej expresie v paneli (A). Červená prerušovaná čiara v dendrograme označuje úroveň separácie klastrov matrice. (C) Porovnanie 4531° (Log2 FC; Padj.<0.05) of 13-week-old Clr-f−/− mice (group 0) and IgAN patients. Gene set enrichment from 4 DEG clusters: (I) upregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients, (II) upregulated in Clr-f−/− mice and downregulated IgAN patients, (III) downregulated in Clr-f−/− mice, and upregulated IgAN patients, and (IV) downregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients. Heat maps were constructed using Morpheus (https://sofware.broadinstitute. org/morpheus).

Nedostatok Clr-f vedie k autoimunite a patogenéze nezávislej od T- a B. Aby sme objasnili imunitný príspevok k patológii obličiek Clr-f-/- myší, skúmali sme Clr-f-/- myši, ktoré mali tiež nedostatok T- a B-buniek, pomocou Rag1-deficientného myšacieho kmeňa (Rag1-/-Clr-f-/-). Keďže myšiam Rag1-/-Clr-f-/- chýbajú protilátky, mohli sme vyhodnotiť patogenézu spojenú s Clr-f v neprítomnosti depozície imunoglobulínu. Analýza obličiek Rag1-/-Clr-f-/- odhalila glomerulárne lézie svedčiace o miernej proliferatívnej glomerulopatii a oblasti glomerulárnej fibrózy (obr. 7A). Glomerulárna patológia skóre ukázala významne vyšší počet glomerulov s léziami u Rag1-/-Clr-f-/- v porovnaní s Rag1-/- myší (obr. 7B). Bodovanie rezov obličiek Rag1−/−Clr-f−/− identifikovalo zvýšenie endokapilárnej proliferácie, mesiačikov, glomerulosklerózy alebo fokálnej segmentálnej sklerózy a intersticiálnej fibrózy a tubulárnej atrofie, s výrazným zvýšením prítomnosti mezangiálnej celularity (obr. 7C). .

Na posúdenie príspevku T a B buniek k akumulácii lipidov pozorovanej u myší Clr-f-/- sme merali celkovú telesnú hmotnosť a abdominálnu tukovú hmotnosť u myší Rag1-/-Clr-f-/- v porovnaní s myšami Rag1-/-. Telesná hmotnosť Te Rag1-/-Clr-f-/- bola výrazne nižšia ako u kontrol Rag1-/- (obr. 7D), zatiaľ čo hmotnosť abdominálnych lipidov bola významne zvýšená (obr. 7E), aj keď v menšom rozsahu ako u kontrol. Clr-f−/− myši v porovnaní s myšami WT (174 mg získaného tuku oproti 274 mg v priemere).

Nakoniec, aby sme preskúmali imunitných prispievateľov k týmto poruchám obličiek, skúmali sme obličky Rag1-/-Clr-f-/- na prítomnosť IL-12 a IFN a imunitných buniek infiltrujúcich obličky. IF analýza Rag1-/-Clr-f-/- obličiek odhalila zvýšenú prítomnosť IL-12 a IFN (obr. 7F,G). Pozorovali sme tiež rozsiahlu periglomerulárnu akumuláciu CD45+ buniek v obličkách Rag1−/−Clr-f−/− (obr. 7H), o ktorých sa zistilo, že pozostávajú z CD11c+, F4/80+ a Nkp{15}} buniek. Tieto zistenia naznačujú, že mechanizmy nezávislé od T a B buniek sú primárnymi mediátormi renálnej patológie u myší s nedostatkom Clr-f.

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK