Kombinácia infúzie adoptívnych NK buniek s peptidom uvoľňujúcim dopamín redukuje starnúce bunky u starých myší

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

ÚVOD

Starnutie je jedným z hlavných rizikových faktorov mnohých chorôb [1] a vývoj metód na zásah do starnutia výrazne zníži riziko série chorôb súvisiacich s vekom, ako sú kardiovaskulárne a cerebrovaskulárne choroby [2, 3], rakovina. [4] a Alzheimerova choroba [5]. Senescentné bunky (SNC) sa postupne hromadia v tkanivách počas procesu starnutia a sú považované za hlavnú príčinu chorôb súvisiacich s vekom [6-8]. Ukázalo sa, že odstránenie SNC na myších modeloch zabraňuje alebo odďaľuje dysfunkciu tkaniva a predlžuje zdravý život [9, 10]. Naproti tomu transplantácia malých množstiev SNC spôsobuje u mladých myší fyziologickú dysfunkciu [1]. Tieto štúdie otvorili dvere pre vývoj metód, ktoré sa zameriavajú na odstránenie SNC na zlepšenie chronických chorôb súvisiacich s vekom.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Cielený klírens SNC, nazývaný "senolytiká", bola prvá chemoterapia úspešne testovaná v predklinickom in vivo modeli a v súčasnosti existuje niekoľko senolytických činidiel [12]. Mnohé z týchto liekov sa zameriavajú na up-regulované antiapoptotické dráhy v SNC, aby selektívne vyčistili určité typy SNC a preukázali potenciál predĺžiť životnosť a zlepšiť telesné funkcie [13, 14].Cistanche Extract Anti RadiationNapriek úspešnému zvráteniu patológie súvisiacej s vekom na zvieracích modeloch môžu existovať určité prekážky pri používaní senolytických liekov u ľudí v dôsledku heterogenity SNC a vysokého rizika toxicity [15]. Preto by sa mala preskúmať alternatívna metóda, ktorá môže bezpečne eliminovať široké spektrum SNC u ľudí.

SNP môžu byť rozpoznané a odstránené imunitným systémom [16]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že SNC aktivujú prirodzené zabíjačské (NK) bunky upreguláciou hlavného aktivačného ligandu proteínu A a B súvisiaceho s reťazcom I. triedy histokompatibility [17]. S pribúdajúcim vekom však účinnosť imunitného systému klesá, čo môže viesť k imunitnému úniku SNC [18]. Metódy na prekonanie imunitného úniku spôsobeného zníženou imunitnou funkciou boli skúmané v terapii rakoviny [19]. Nedávny pokrok sa dosiahol v adoptívnom prenose NK buniek na elimináciu nádorov, čo preukázalo určitú účinnosť [20]; bolo teda rozumné predpokladať, že adoptívna infúzia NK buniek môže spôsobiť cytotoxicitu v SNC.

Nervový a imunitný systém sú dva najdôležitejšie adaptívne systémy tela. Niekoľko štúdií ukázalo, že dopamín (DA) ako imunitný regulátor je kľúčom k neuroimunitnej komunikácii [21]. DA plní svoje biologické funkcie interakciou a aktiváciou dopamínových receptorov (DR), ktoré sa delia na 2 podskupiny, D1-podobné (D1 a D5) a D2-podobné (D2, D3, a D4). Pokiaľ ide o ich rôzne funkcie, zapojenie D1-ako DR stimuluje produkciu cAMP, zatiaľ čo zapojenie D2-ako DR inhibuje produkciu cAMP [22]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že D1-ako DR stimulácia zvyšuje cytotoxicitu NK buniek in vitro [23] aj in vivo [24]. Hladiny DA však klesajú so zvyšujúcim sa vekom [25]. Predpokladali sme teda, že dopaminergné lieky by mohli zvýšiť cytotoxicitu adoptívnej infúzie NK buniek.

Cistanche môže proti starnutiu

Tu navrhujeme použitie nonapeptidu aceínu, ktorý interagoval s enzýmom konvertujúcim angiotenzín (ACE I) na vyvolanie sekrécie DA [26], v kombinácii so systémovou terapiou NK bunkami na elimináciu SNC. Výsledky in vitro ukázali, že NK bunky odstránili SNC nezávisle od induktorov starnutia a typov buniek.cistanche herbaV modeli starnúcej myši terapia NK bunkami v kombinácii s aceínom významne znížila počet buniek pozitívnych na galaktozidázu (SA- -gal) asociovaných so starnutím vo viacerých tkanivách, znížila expresiu génov spojených so starnutím v hlavných orgánoch a zmiernenie sekrečných fenotypov spojených so starnutím (SSP). Výsledky tejto štúdie poskytujú pohľad na možné obnovenie imunitného dohľadu nad chronickými SNC pomocou NK bunkovej terapie v kombinácii s Ace.

VÝSLEDKY

Adoptívna infúzia NK buniek znižuje senescentné CD3 plus T bunky v periférnej krvi

Do štúdie bolo prijatých 26 dobrovoľníkov, ktorí dostali infúziu NK buniek. Charakteristiky a vlastnosti NK buniek dobrovoľníkov sú uvedené v tabuľke 1. Časový interval na odber krvi po transfúzii NK buniek bol približne 37 (25-57) dní. Podiel (obr. 1A) a absolútny počet (obr. 1B) NK buniek v periférnej krvi boli nepriamo úmerné veku dobrovoľníkov. Prekvapivo čistota NK bunkového produktu reinfúzovaného do každého jedinca tiež nepriamo korelovala s vekom dobrovoľníkov (obr. 1C).rast penisu cistancheMôže to byť spôsobené postupným znižovaním počtu NK buniek s pribúdajúcim vekom. Aby sa odrážal účinok podávania NK buniek proti starnutiu, pred a po infúzii NK buniek boli detegované viaceré starnúce markery v CD3 plus T bunkách periférnej krvi, ktoré do značnej miery odrážajú fenotyp tela súvisiaci s vekom [27]. V porovnaní s markermi starnutia a SASP faktorom CD3 plus T buniek v periférnej krvi pred a po autológnej infúzii NK buniek sa podiel SA- -gal-pozitívnych T buniek po infúzii významne znížil (obr. 1D). Hladiny mRNA P16, P21 a inhibítora aktivátora plazminogénu 1 (Pai1) boli výrazne znížené, zatiaľ čo zmeny v hladinách mRNA monocytového chemoatraktantného proteínu-1 (MCP-1) a IL-6 neboli významné (obr. 1E). Neexistoval žiadny významný rozdiel v biochemických indexoch (doplnková tabuľka 1) v periférnej krvi.

Ľudské NK bunky redukujú markery starnutia tukového tkaniva a sekréciu prozápalových cytokínov

Tukové tkanivo bolo odobraté od troch obéznych jedincov, pretože obezita má tendenciu spôsobiť akumuláciu SNC [28]. Okrem toho sa tukové tkanivo kultivovalo v upravenom médiu z SNC, aby sa ďalej indukovalo starnutie tukového tkaniva. Tukové tkanivo kultivované v upravenom médiu z non-SNC sa považovalo za kontrolu. Expresia perforínu (obr. 2A) a CD69 (obr. 2B) v NK bunkách bola významne zvýšená po koinkubácii so starnúcim tukovým tkanivom v porovnaní so spoločnou inkubáciou s kontrolným tukovým tkanivom. Expresia senescentných markerov p16 a p21in

starnúce tukové tkanivo bolo významne znížené po liečbe NK bunkami (obr. 2C, doplnkový obrázok 1A, B). Tiež sme zistili, že kľúčová zložka SASP v kondicionovanom médiu po koinkubácii s NK bunkami v senescentnej skupine bola významne znížená (obr. 2D). Tieto výsledky naznačujú, že NK bunky by mohli eliminovať SNC z tukového tkaniva a redukovať fenotyp SASP.

Myšie NK bunky môžu byť aktivované proti SNC a prejavovať cytotoxicitu

Najprv sme indukovali starnutie myších tukových progenitorových buniek ožiarením alebo adriamycínom, ako už bolo opísané [29]. Aby sa určilo, či boli NK bunky špecificky aktivované SNC, neožiarené kontrolné bunky alebo ožiarené SNC boli koinkubované s NK bunkami počas 24 hodín. Prietoková cytometria ukázala, že hladiny expresie CD69 (obr. 3A) a IFN-y (obr. 3B) v NK bunkách boli významne upregulované v SNC cieľových bunkách v porovnaní s kontrolnými cieľovými bunkami. Medzitým, po spoločnej inkubácii s NK bunkami, bola apoptotická hladina SNC významne vyššia ako hladina kontrolných buniek (obr. 3C). Ďalej sme detegovali expresiu NK buniek aktivujúcich a inhibičných ligandov v SNC. Výsledky qPCR ukázali, že hladina expresie aktivačných ligandov v NK bunkách bola výrazne upregulovaná v porovnaní s kontrolnými bunkami a hladina expresie niektorých inhibičných ligandov, ako je beta 2 mikroglobulín (2m), bola v porovnaní s kontrolnými bunkami znížená (obr. .3D). Tiež sme skúmali schopnosť NK buniek eliminovať SNC in vivo.výhody cistanche salsaKontrolné bunky značené DiR a SNC značené DiR sa transplantovali do brušnej dutiny myší a NK bunky sa podávali cez chvostovú žilu. Výsledky zobrazovania in vivo ukázali, že intenzita fluorescencie u myší s transplantovanými SNC po ošetrení NK bunkami bola výrazne slabšia ako u myší s transplantovanými kontrolnými bunkami (obr. 3E). To naznačuje, že schopnosť NK buniek zabíjať SNC bola významne vyššia ako schopnosť SNC in vivo. Ďalej sme určili, či cytotoxicita NK buniek proti SNC bola závislá od dávky a bunkovo ​​špecifická. Súčasne sme tiež použili doxorubicínom indukovanú starnutie, aby sme určili, či cytotoxicita NK buniek proti SNC bola obmedzená na indukciu žiarenia. Výsledky ukázali, že NK bunky mali významnú cytotoxickú aktivitu proti SNC spôsobom závislým od dávky, ale malú cytotoxicitu proti kontrolným bunkám. Rôzne metódy stimulácie starnutia nemali žiadny vplyv na schopnosť NK buniek zabíjať SNC (obr. 3F). Tieto výsledky naznačujú, že NK bunky by mohli byť špecificky aktivované SNC a produkovať významnú cytotoxicitu proti SNC in vitro a in vivo.

DA zvyšuje cytotoxicitu myších NK buniek proti SNC prostredníctvom D1-podobných receptorov

Vzhľadom na dôležitú neuroimunitnú komunikačnú funkciu DA [30] sme hodnotili, či DA môže zvýšiť cytotoxicitu myších NK buniek proti SNC. NK bunky boli koinkubované s radiáciou indukovanými SNC a do média boli pridané rôzne koncentrácie DA. Výsledky ukázali, že DA môže zvýšiť cytotoxicitu NK buniek proti SNC (obr. 4A, B). Na charakterizáciu signálnej dráhy, ktorou DA zosilnil zabíjací účinok NK buniek na SNC, sa hodnotili zmeny v expresii DR, obsahu cAMP a fosforylácii proteínu viažuceho prvok cAMP (CREB) v NK bunkách. V NK bunkách koinkubovaných s SNC spolu s DA sa obsah cAMP (obr. 4C) a hladina fosforylácie CREB (obr. 4D, doplnkový obr. 2A) významne zvýšili v porovnaní s NK bunkami a koinkubáciou SNC bez DA. Aby sme objasnili, prečo DA zvyšuje zabíjaciu aktivitu NK buniek proti SNC, porovnali sme zmeny DR na NK bunkách po koinkubácii NK buniek s SNC alebo kontrolnými bunkami. Výsledky ukázali, že hladina expresie D1 a D5 DR bola významne zvýšená po koinkubácii NK buniek s SNC v porovnaní s kontrolnými bunkami (obr. 4E). Ďalej, DA a D1-ako antagonisty receptorov alebo D{16}}ako

antagonisty receptora sa pridali spolu do koinkubačného systému NK buniek a SNC. V porovnaní s pridaním samotného DA bola hladina apoptózy SNC znížená po pridaní DA plus SCH-23300 (D1-podobný receptorový antagonista) (obr. 4F, G). Medzitým sa obsah cAMP (obr. 4H) a hladina fosforylácie CREB (obr. 41, doplnkový obrázok 2B) v NK bunkách znížili. Naproti tomu pridanie DA plus haloperidol (antagonista receptora D2) významne nezmenilo hladinu apoptózy SNC, obsah cAMP a fosforyláciu CREB v NK bunkách v porovnaní s pridaním samotného DA. Tieto výsledky ukázali, že DA zosilnil zabíjaciu aktivitu myších NK buniek proti SNC prostredníctvom D1-ako Dr.

Ace v kombinácii s myšacími NK bunkami významne zvyšuje klírens SNC in vivo

Predchádzajúca štúdia ukázala, že dopamín u ľudí klesá s vekom [22]. Najprv sme merali periférnu hladinu dopamínu u mladých a starých myší. Výsledky ukázali, že plazmatické hladiny dopamínu u starých myší boli nižšie ako u mladých myší (obr. 5A). Ďalej sa u starých myší skúmalo periférne uvoľňovanie dopamínu po intraperitoneálnej injekcii aceínu. Zistili sme, že hladiny dopamínu v plazme sa významne zvýšili po injekcii 10 mg / kg aceínu (obr. 5B, doplnkový obrázok 3). Vzhľadom na to sme vykonali myšie NK bunky kombinované s aceínom na liečbu starých myší. Zistili sme stav NK buniek v periférnej krvi myší po liečbe a zistili sme, že počet NK buniek v periférnej krvi pri infúzii NK buniek samotných alebo NK buniek v kombinácii s aceínom bol významne vyšší ako v skupine liečenej Ace a PBS, zatiaľ čo počet NK buniek sa významne nelíšil medzi skupinou ošetrenou NK bunkami a NK bunkami kombinovanými so skupinou ošetrenou aceínom (obr. 5C, D).cistanche tubulosa dávkovanie redditĎalšia detekcia aktivačnej hladiny NK buniek ukázala, že hladina expresie CD69 v periférnych krvných NK bunkách v kombinovanej liečenej skupine bola významne zvýšená v porovnaní so skupinou liečenou NK bunkami (obr. 5E). Ďalej sme hodnotili SNC v tkanive. Zistili sme, že infúzia samotných NK buniek znížila expresiu niektorých starnúcich markerov v porovnaní so skupinou liečenou PBS a skupinou liečenou aceínom, zatiaľ čo infúzia NK buniek v kombinácii s aceínom významne znížila SA- -gal-pozitívne bunky (obr. 5F ), ako aj hladiny expresie P16 a P21 (obr. 5G, doplnkový obrázok 4A, B) v tukovom tkanive v porovnaní s liečbou samotnými NK bunkami. Počet buniek Ki67BrdU v tukovom tkanive sa tiež významne zvýšil (obr. 5H), čo ďalej dokazuje, že obsah SNC v tukovom tkanive bol nižší v kombinovanej liečenej skupine. Farbenie SA- -gal pečene, pľúc, obličiek a tukových rezov tiež ukázalo najnižšiu hladinu SNC v kombinovanej liečenej skupine (doplnkový obrázok 5A-D). Tieto výsledky ukázali, že NK bunky v kombinácii s aceínovou terapiou zvýšili hladinu aktivácie NK buniek u myší a spôsobili významnú elimináciu SNC in vivo.

Ace v kombinácii s NK bunkami znižuje fenotypy súvisiace s vekom u starých myší

Na ďalšie potvrdenie fenotypov súvisiacich s vekom u myší sa zhromaždili tkanivá pečene, pľúc, obličiek, tuku a oka, aby sa detegovali rôzne senescentné markery vrátane faktorov P16, P21 a SASP. Tieto vzorky boli vybrané, pretože tieto tkanivá s väčšou pravdepodobnosťou podliehajú starnutiu s vekom [31]. V každom tkanive boli po samotnej infúzii NK buniek hladiny mRNA faktorov P16, P21 a SASP významne nižšie ako v kontrolnej skupine, zatiaľ čo hladiny markerov starnutia v tkanivách pečene, tuku a predvečera v kombinovanej liečbe skupina bola ďalej znížená v porovnaní so skupinou liečenou samotnou infúziou NK buniek (obr. 6A). Podobne sme tiež detegovali hlavný faktor SASP v sére myší a výsledky boli v súlade s výsledkami v tkanivách (obr. 6B). Okrem toho sme skúmali aj hladiny NAD v pečeni a tukovom tkanive, ktoré sú spojené so starnutím [32]. Zistili sme, že infúzia NK buniek samostatne alebo v kombinovanej terapii významne zvýšila obsah NAD v pečeni a tukovom tkanive, pričom úroveň zlepšenia bola výrazne vyššia v skupine s kombinovanou terapiou (obr. 6C). Niektoré sérové ​​biochemické indexy vrátane ALT, AST, CREA, UA, CHOL a BUN súvisia s úrovňami starnutia [33]. Zistili sme, že iba UA bola významne znížená v sére myší v skupine liečenej kombináciou, zatiaľ čo ostatné kľúčové biochemické indexy neboli

MATERIÁL A METÓDY Infúzia ľudských NK buniek

Autológnu infúziu NK buniek vykonala Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Shanghai, Čína) a všetky protokoly schválila ich etická komisia (č. 05, 2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). Všetci dobrovoľníci poskytli podpísaný informovaný súhlas na odber periférnej krvi. Stručne, 50 ml periférnej krvi sa extrahovalo z každého jedinca, potom sa izolovali periférne krvné mononukleárne bunky (PBMC) a preniesli sa do banky T75 s ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) obsahujúcim 1 x Cloudz CD2/NKp46. , Rekombinantný ľudský IL-2(27 ng/ml), rekombinantný ľudský L-12 (10 ng/ml), rekombinantný ľudský IL-18 (10 ng/ml a rekombinantný ľudský L{{ 13}}(10 ng/ml) (R&D Systems, USA) na 48 hodín a potom nahradené aktivovaným médiom (270 ng/ml rekombinantného ľudského IL-2, 20 ng/ml rekombinantného ľudského IL-12 20 ng/ml rekombinantného ľudského IL-18 a 20 ng/ml rekombinantného ľudského IL-21) na ďalšiu kultiváciu. Hustota buniek sa udržiavala na 1x10 stupňoch buniek/ml. Na 28. deň kultivácie sa odobral malý počet autológnych NK buniek na kontrolu kvality a intravenózne sa reinjektovali spolu s autológnymi NK bunkami v hustote 4,15 × 10 stupňov (3.76-5 0,87 × 10) buniek, s časom infúzie 30 minút Experimentálny proces bol uskutočnený v súlade so správnou klinickou praxou. Časový interval pre druhý odber krvi bol približne 37 (25-57) dní.

Izolácia T-buniek a NK buniek ľudskej periférnej krvi Čerstvá krv bola získaná od zdravých dobrovoľníkov po poskytnutí informovaného súhlasu a protokol bol schválený inštitucionálnou revíznou radou Čínskej farmaceutickej univerzity (číslo povolenia: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Kanada) sa použil na izoláciu ľudských PBMC. Ľudské CD3 plus T bunky sa získali z PBMC s použitím magnetických guľôčok na triedenie ľudských CD3 T buniek (Miltenyi Biotec, Nemecko) v súlade s protokolom výrobcu. NK bunky boli izolované z periférnej krvi pomocou RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) podľa protokolu výrobcu

Separácia a expanzia myších NK buniek in vitro

NK bunky myšacej sleziny sa izolovali pomocou súpravy NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, získali sa myšie sleziny, bunky sleziny sa filtrovali pomocou 70 μm bunkového filtra a lymfocyty sleziny sa získali centrifugáciou v hustotnom gradiente s použitím súpravy na separáciu lymfocytov myšacej sleziny (Solarbio, Čína). Lymfocyty sleziny sa odobrali, aby sa získali vysoko čisté NK bunky s použitím magnetických guľôčok na oddelenie myších NK buniek. Izolované NK bunky sleziny sa kultivovali v udržiavacom médiu RPMI-1640 doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra (FBS), 1 percentom L-glutamínu, 1 percentom penicilínu/streptomycínu, 1 percentom minimálneho esenciálneho média (MEM) bez esenciálna aminokyselina, 1% kyselina pyruvát sodný a 50 uM merkaptoetanol (všetky od Life Technologies, USA). Okrem toho sa do stredná. Potom sa odobrali 10-stupňové NK bunky a 10-stupňové ožiarené slezinové lymfocyty a 5 ml amplifikačného média (udržiavacie médium doplnené 1000 IU/ml rlL-2, 10ng/ml ml-15 a 30ng/ml anti -NKp46 protilátka (PA5-46986,Invitrogen,USA)).

Obr. 3 SNC aktivujú NK bunky a boli usmrtené NK bunkami. Prietoková cytometria na detekciu expresie (A) CD69 a (B) IFN-y sa uskutočnila po 24 hodinách spoločnej inkubácie s myšacími NK bunkami a preadipocytmi alebo ožiarením indukovanými preadipocytmi. n =3. Údaje sú prezentované ako priemer ± SD. Rozdiely boli hodnotené dvojstranným nepárovým neparametrickým t-testom. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Extrakcia preadipocytov a svalových satelitných buniek

Preadipocyty boli extrahované, ako už bolo opísané [11]. Stručne povedané, ľudský alebo myší tuk sa odstránil za sterilných podmienok a narezal sa na kúsky 1-2 mm, dvakrát sa premyl PBS a štiepil sa kolagenázou II (Solarbio) pri 37 stupňoch počas 1 hodiny. Potom sa bunky prefiltrovali pomocou 100 μm bunkového filtra, centrifugovali pri 300 g počas 5 minút a zhromaždili. Adherujúce bunky sa kultivovali v a-MEM doplnenom 20 percentami FBS počas 12 hodín a štiepili sa trypsínom, aby sa zhromaždili adherentné bunky. Svalové satelitné bunky boli izolované, ako už bolo opísané [34]. Štvorhlavý sval sa narezal na 1-2 mm kúsky a pridalo sa 5 ml kolagenázy II na trávenie pri 37 °C počas 12 minút. Zmes sa premiešala pipetou a po ďalšom štiepení počas 12 minút sa pridalo 5 ml kompletného média. Bunky boli filtrované pomocou 70 μm bunkového filtra a centrifugované pri 300 g počas 5 minút. Potom boli bunky

kultivované s 5 ml média pridávaného denne počas 4 dní. Adherujúce bunky boli odfúknuté pipetou a centrifugované pri 2000 x g počas 5 minút. Po štiepení trypsínom pri 37 stupňoch počas 5 minút boli bunky centrifugované pri 2000 x g počas 5 minút a zozbierané. Potom sa pridalo 5 ml F-10 Hamovho média doplneného 20 percentami FBS a 4 ng/ml základného fibroblastového rastového faktora (PeproTech).

Cytotoxicita myších slezinných NK buniek voči SNC bola detekovaná testom laktátdehydrogenázy

SNC boli indukované 0,2 μM Adriamycínom （MedChemExpress, USA） počas 24 hodín alebo kontinuálnou kultiváciou počas 20 dní po 10 Gy röntgenovom žiarení. Potom sa 5000 SNC umiestnilo na platňu a pridali sa NK bunky sleziny (životaschopnosť buniek: 93.5-97,1 percenta) v pomere efektora k cieľovému číslu 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25: 1,3,125:1 a 1,563:1. Supernatanty sa odobrali po spoločnej kultivácii pri 37 °C počas 24 hodín a na detekciu sa použila súprava na detekciu cytotoxicity laktátdehydrogenázy (LDH) (Cayman Chemical, USA). Cytotoxicita sa vypočítala podľa nasledujúceho vzorca: cytotoxicita ( percentá )= (experiment so zmesou – spontánna cieľová bunka – spontánna efektorová bunka)/(maximálna cieľová bunka – spontánna cieľová bunka) × 100.

Živé zobrazovanie

Dvanásť 10-týždňových myší C57BL/6 bolo zakúpených od Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Čína). Potom 1 × 10 stupňov 1,1'-oktadecyl-3,3,3',3'-tetrametylindokarbocyanín jodid (DiR) (Invitrogen)-označená kontrola

preadipocyty alebo radiáciou indukované starnúce preadipocyty boli resuspendované v 200 ul fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a injikované do brušnej dutiny myší ihlou 22 gauge. Po troch dňoch sa cez chvostovú žilu injikovalo 5 x 10 stupňov alogénnych NK buniek (životaschopnosť buniek: 93.6-96,2 percent) v 100 ul PBS. Na 10. deň boli myši anestetizované izofluránom. Fluorescencia sa detegovala pomocou MS 100 Series In Vivo Imaging System (PerkinElmer, MA, USA).

Prietoková cytometria

Na detekciu apoptózy SNC koinkubovaných s DiR-značenými slezinovými NK bunkami (životaschopnosť buniek: 91.8-93,2 percenta ), boli 1×10 stupňové SNC štiepené s presnosťou pri 37 stupňoch počas 10 minút a potom zafarbené so súpravou na farbenie anexínu V a propidium jodidu (PI) apoptózy (Multisciences Biotech Co, Ltd., Čína) podľa protokolu výrobcu. SNC boli hradlované v DiR-negatívnej polohe. Na testovanie aktivácie NK buniek boli myšie NK bunky zozbierané a zafarbené mNK1.{11}}alofykokyanínom (APC)(S17016D) a myšacím klastrom diferenciácie 69-R-fykoerytrín-cyanín7 (mCD{{{{101} 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) pri 4 stupňoch počas 30 minút. Potom boli bunky spracované pomocou súpravy CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, USA) a zafarbené myším interferónom gama-brilantná fialová 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) pri 4 stupňoch počas 30 minút. Farbenie ľudských NK buniek Perforin-APC(S16009A) sa uskutočnilo pomocou rovnakého protokolu, aký sa použil na extracelulárne farbenie (CD56-fluoresceín izotiokyanát [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) a intracelulárne farbenie (perforín-APC) (Biolegend).

Na detekciu NK buniek periférnej krvi sa odobralo 100 ul antikoagulačnej krvi. Pre periférnu krv myší boli pridané CD3-FITC, NK1.1-APC a CD69-PE-Cy7. V prípade ľudskej periférnej krvi sa pridali CD3-BV421 (OKT3) a CD56-FITC a inkubovali sa 20 minút pri teplote miestnosti.

Potom sa pridalo 400 ul 1 x erytrocytového lyzátu (BD Biosciences) a inkubovalo sa 3 minúty, po čom nasledovali tri premytia PBS. Na detekciu bunkovej proliferácie v tukovom tkanive sa myšiam intraperitoneálne injikovalo 200 ul 10 mg/ml brómdeoxyuridínu (BrdU) 24 a 72 hodín pred eutanáziou. Po eutanázii boli depoty inguinálneho tuku odstránené a narezané na fragmenty, štiepené pri 37 °C počas 30 minút s kolagenázou II a DNázou a filtrované pomocou 100 um bunkového filtra. Bunky boli spracované pomocou súpravy Cytofix/Cytoperm Plus Kit a zafarbené pomocou BrdU-FITC (3D4) a Ki67-PE (16A8). Prietoková cytometria sa uskutočnila na prietokovom cytometri CytoFLEX. LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) sa použila na vylúčenie mŕtvych buniek vo všetkých experimentoch. Údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Kvantitatívna PCR s reverznou transkripciou

RNA sa extrahovala s použitím činidla Trizol a obrátila sa a prepísala do cDNA pomocou súpravy Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, Čína). Kvantitatívna PCR (qPCR) sa uskutočnila s použitím reakčnej zmesi SYBR Green (Yepsen Biotechnology) na systéme ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), pričom GAPDH slúžila ako interná kontrola. Údaje boli analyzované pomocou metódy 2-△ACT. Zoznam sekvencií primérov je uvedený v doplnkovom materiáli (tabuľka 2-3).

Farbenie galaktozidázou spojené so starnutím

Na farbenie buniek boli bunky raz premyté PBS, fixované v roztoku galaktozidázy (SA- -gal) súvisiacej so starnutím (Cell Signaling Technology, USA) pri teplote miestnosti počas 15 minút, trikrát premyté PBS a inkubované cez noc v roztoku na farbenie SA- -gal pri 37 °C. Platňa sa utesnila parafilmom, aby sa zabránilo vyparovaniu farbiaceho média. Bunky

boli premyté PBS a pozorované mikroskopom. Na farbenie zmrazených rezov sa rezy sušili pri 37 stupňoch počas 30min a fixovali pri izbovej teplote v SA- -gal fixačnom roztoku počas 15 min. Rezy sa premyli trikrát PBS a inkubovali sa cez noc v roztoku na farbenie SA- -gal pri 37 °C. Potom sa farbili eozínom počas 1 minúty a oplachovali sa vodou počas 2 minút. Údaje o farbení SA- -gal boli analyzované pomocou softvéru Image-Pro Plus 6.0.

Explantáty ľudského tukového tkaniva

Tukové tkanivo od troch jedincov sa získalo liposukciou. Jeden zo subjektov bol muž a dve boli ženy. Priemerný vek subjektov bol 57.{1}}±7,6 rokov (priemer ±SD: rozsah, 50-65). Priemerný BMI bol 40,5 ± 5,1 kg/m2（priemer ± SD; rozsah, 36.{10}}.2）. Etická komisia Shanghai Mengchao Cancer Hospital (č. 05, 2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital) schválila experimentálnu schému. Pre všetkých dobrovoľníkov bol získaný informovaný súhlas. Tukové tkanivo bolo narezané na malé kúsky s priemerom asi 2 mm. Päť kúskov tkaniva sa umiestnilo do každej jamky 96-jamkovej platne a 200 ul buď preadipocytov alebo kondicionovaného média z radiačne indukovaných senescentných preadipocytov, doplnené 10 percentami ľudského AB séra, 1 percenta L-glutamínu, 1 percent penicilínu/streptomycínu, 1 percento MEM neesenciálnych aminokyselín a 1 percento kyseliny pyruvátu sodného sa pridalo do spoločnej kultúry na 24 hodín. Potom sa médium nahradilo čerstvým médiom obsahujúcim 5 x 10 stupňov autológnych NK buniek (životaschopnosť buniek: 92.3-95,7 percent 6) a kultivovalo sa ďalších 48 hodín, po ktorých sa NK bunky odobrali na prietokovú cytometriu. Tukové tkanivo sa päťkrát premylo PBS a pridalo sa rovnaké médium na ďalšiu kultiváciu počas 48 hodín; supernatant (100 ul) sa použil na multifaktorovú detekciu. Preadipocyty alebo radiáciou indukované senescentné preadipocyty boli odvodené z tukového tkaniva toho istého jedinca.

Tento článok je prevzatý z Cell Death and Disease (2022) 13:305