Porovnanie medzi QPCR a RNA-seq odhaľuje výzvy kvantifikácie expresie HLA, časť 2

Normalizácia

Použili sme odhady expresie v prepisoch na milión (TPM), čo je štandardná normalizácia produkovaná Salmonom a zodpovedá relatívnemu množstvu daného transkriptu vo vzorke. Pre každý daný gén je odhad jednoducho súčtom TPM pre jeho transkripty. V niektorých prípadoch, keď zobrazujeme štandardné normálne transformované odhady, sme vykonali rank normal transformáciu údajov RNAseq pomocou balíka GenABEL R (Aulchenko et al. 2007), ktorý sa zvyčajne používa napríklad v lineárnych modeloch mapovania eQTL (Delaneau a kol., 2017).

QTL mapovanie je metóda na štúdium regulačného mechanizmu génovej expresie porovnaním asociácie medzi génovou expresiou a génovým polymorfizmom v populácii. Lineárny model je bežne používaná metóda mapovania eQTL, ktorá môže použiť lineárny regresný model na odhadnutie korelácie medzi génovou expresiou a génovým polymorfizmom.

Imunitný systém je komplexný biologický systém, ktorý chráni telo pred infekciami a chorobami, ako je rakovina. Regulácia génovej expresie hrá dôležitú úlohu v imunitnom systéme a môže ovplyvniť vývoj, diferenciáciu a funkciu imunitných buniek.

Preto je možné použiť lineárne modely mapovania eQTL na analýzu vzťahu medzi regulačnými mechanizmami génovej expresie a imunitou. Napríklad štúdium korelácie medzi určitým genotypom a expresiou kľúčového imunitného génu v populácii môže odhaliť vplyv tohto genotypu na reguláciu expresie imunitných génov. Takýto výskum môže poskytnúť dôležité poznatky pre liečbu a prevenciu imunitných ochorení. To ukazuje dôležitosť imunity, preto musíme svoju imunitu zlepšovať každý deň. Mleté mäso má tiež antivírusové, protirakovinové a iné účinky, ktoré môžu posilniť imunitu Schopnosť systému odolávať a zlepšiť imunitu organizmu.

Kliknite na zdravotné prínosy cistanche

Prečítajte si zarovnanie s referenčným genómom

Na analýzu pokrytia čítania v génoch HLA uvádzaných na obr. S7 sme údaje zarovnali s referenčným genómom GRCh38 s STAR v2.7.3a (Dobin et al. 2013) pomocou anotácií génu Gencode v37. Na kontrolu skreslenia mapovania v génoch HLA sme ďalej spracovali súbory BAM pomocou hlamapper v4.3 (Castelli et al. 2018).

Simulácia

Pravdivé údaje

Aby sme vygenerovali simulované údaje, najprv sme spustili Salmon v1.3.0 (Patro a kol. 2017) na skutočnej vzorke #66K00003, aby sme sa naučili úrovne expresie prepisov Gencode v37. Potom sme použili balík Polyester (v1.26.0) na vytvorenie 50 syntetických vzoriek s identickými hladinami expresie v celom transkriptóme, s výnimkou HLA-A, -B a -C. Úrovne expresie pre tieto gény boli založené na 50 náhodne vybraných jedincoch z našich skutočných údajov (pre ktoré máme k dispozícii údaje o alelách HLA). Pre každý gén HLA sme vybrali izoformy, ktoré predstavovali aspoň 90 percent celkovej expresie transkriptu kódujúceho proteín v behu lososa na skutočnom súbore údajov (čo viedlo k iba 1 transkriptu na gén) a personalizovali sme transkriptové sekvencie podľa Alely HLA prenášané každým jednotlivcom.

Tento postup nám umožnil synteticky vygenerovať 50 jedincov s identickými hladinami expresie pozadia, ale s variabilnou expresiou HLA a s polymorfizmom HLA zabudovaným do simulovaných hodnôt.

Aby sme odzrkadľovali naše skutočné údaje, bolo pre každého jednotlivca simulovaných tridsať miliónov 126 bp párovaných koncových čítaní s priemernou veľkosťou fragmentu 261 bp s použitím predvolených hodnôt pre ostatné parametre polyesteru (napr. štandardná odchýlka dĺžky fragmentu=25 bp, chybovosť=0.005, rovnomerné rozloženie čítaní a žiadna odchýlka). Polyesterové výstupy FASTA súbory, z ktorých sme vyrobili FASTQ súbory s konštantným skóre kvality (zodpovedajúci symbol "F").

Metriky pre presnosť

TPM boli vypočítané na simulovaných počtoch vzhľadom na dĺžky transkriptov a priemernú veľkosť fragmentu 261 bp. Pomer „odhadovaný TPM/skutočný TPM“ sa používa na hodnotenie výkonu pri obnove simulovaných úrovní expresie a umožňuje nám pozorovať pokles alebo nadhodnotenie.

Grafika

Všetky grafy v tomto článku sme pripravili pomocou balíka ggplot2 v3.3.2 (Wickham 2016) v R.

Výsledky

Presnosť kvantifikácie RNA-seq HLA

Vzhľadom na absenciu metódy, ktorú možno považovať za experimentálny zlatý štandard pre kvantifikáciu expresie HLA z údajov RNA-seq, sme pôvodne hodnotili presnosť metód kvantifikácie RNA-seq pre HLA pomocou simulovaných údajov, kde sú známe skutočné hladiny expresie, pretože sú generované. v počítači napodobniť skutočné experimenty. Toto sa uskutočnilo s cieľom vybrať najlepší výpočtový prístup medzi metódami založenými na RNA-seq, čo umožňuje následný kontrast s prístupmi bez RNA-seq.

Simulovali sme experiment RNA-seq pre 50 jedincov pomocou balíka Polyester (Frazee et al. 2015). Títo syntetickí jedinci majú rovnaké úrovne expresie pre všetky gény v genóme, okrem HLA-A, -B a -C, pre ktoré sme menili úrovne expresie. Tiež sme personalizovali anotované HLA transkriptové sekvencie z Gencode v37, aby sme zaviedli skutočnú genetickú variáciu pozorovanú u náhodne vybraných jedincov zo súboru údajov 96 jedincov (ktorí boli genotypovaní HLA pomocou Sangerovho sekvenovania, ako je opísané nižšie). Výsledné personalizované transkripty mali strednú sekvenčnú identitu s referenciou väčšou ako 95 percent pre všetky HLA lokusy.

Porovnali sme odhady expresie HLA získané dvomi bioinformatickými metódami: (1) „Ref transkriptóm“, ktorý používa Salmona (Patro et al. 2017) na zarovnanie hodnôt so štandardným referenčným transkriptómom, kvantifikujúc množstvo transkriptov a (2) „Personalizované,“ ktorý tiež používa lososa, ale mapy číta na personalizované HLA transkripty, odrážajúce HLA genotyp jedinca (obr. 1). „Personalizovaný“ prístup rozširuje našu predchádzajúcu stratégiu (Aguiar et al. 2019) použitím personalizovaného prepisu, a nie jedinej kanonickej kódujúcej sekvencie pre každú alelu prenášanú jednotlivcom.

Metóda "Ref transkriptóm" podcenila hladiny expresie, najmä pre alely s väčším podielom sekvenčných rozdielov týkajúcich sa referenčného genómu (obr. 1). Očakáva sa to, pretože vyššia miera nesúladu medzi hodnotami a referenciou negatívne ovplyvňuje zosúladenie (Brandt et al. 2015). Tento prístup tiež precenil HLA-C expresiu pre niektorých jedincov, v dôsledku čítaní z HLA-B je mapovaný na HLA-C referenčné prepisy (obr. S1). Na druhej strane „Personalizovaný“ prístup kontroluje skreslenie mapovania a dosahuje optimálnu presnosť.

Aj keď naša simulácia poskytuje povzbudivé výsledky týkajúce sa kvantifikácie expresie HLA pomocou RNAseq, musíme zvážiť niektoré výhrady. Modifikovali sme sekvenciu anotovaných izoforiem podľa individuálnych alel HLA s použitím jedinej sady izoforiem pre všetky alely v danom géne HLA. Tieto sekvencie boli použité ako pri simulácii čítaní, tak aj pri kvantifikácii expresie; preto očakávame optimálnu presnosť. V skutočnom scenári môžu byť rôzne alely HLA spojené s rôznymi izoformami. Ďalej v tomto článku diskutujeme o konkrétnom príklade, ktorý sme pozorovali pre HLA-A, v súlade s hypotézou, že určité izoformy sú exkluzívne pre konkrétne alely. Napriek tomu, vzhľadom na to, že nás zaujímajú hlavne odhady expresie na úrovni génov a alel HLA, očakávame, že personalizované sekvencie predstavujú zlepšenie oproti jedinému referenčnému transkriptómu znížením skreslenia mapovania.

Odhad expresie HLA zo skutočných údajov RNA-seq

Uskutočnili sme odhad expresie na údajoch RNA-seq celého transkriptómu pre 96 jedincov, pre ktorých sa predtým odhadovali hladiny povrchovej expresie HLAA, -B a -C a HLA-C (Kulkarni et al. 2013; Ramsuran et al. 2015, 2017) a mohli by sa použiť na porovnanie s výsledkami RNAseq (pozri obr. S2 pre analýzy QC na údajoch RNA-seq).

Vzhľadom na vyššiu presnosť personalizovaného prístupu v simulácii porovnávame túto metódu odhadov expresie založenej na RNA-seq s metódami iných prístupov, ktoré nie sú RNA-seq, ale poskytujeme výsledky pre prístupy založené na referenčnom transkriptóme v časti „Doplnkové informácie. " Transkriptové sekvencie sme personalizovali vzhľadom na jednotlivé genotypy HLA získané Sangerovým sekvenovaním. Spustili sme HLApers (Aguiar et al. 2019) a Kourami (Lee a Kingsford 2018), aby sme odvodili alely priamo z údajov RNA-seq a potvrdili Sangerove volania (pozri „Materiály a metódy“).

Odhady expresie na úrovni génov ukazujú, že HLA-B má najvyššiu expresiu medzi HLA lokusmi v našom súbore údajov, po ktorom nasledujú HLA-C a HLA-A (obr. 2A). Toto poradie je v súlade so súborom údajov o plnej krvi GTEx (GTEx Consortium 2020) a s predchádzajúcou metódou zachytávania HLA RNAseq aplikovanou na PBMC (Yamamoto et al. 2020). Tento vzor sa však líši od vzoru, ktorý videli Boegel et al (2018), ktorí pozorovali podobné úrovne v génoch pomocou inej stratégie na riešenie mapovania čítaní do viacerých lokusov, čo môže prispieť k nedostatku rozdielov medzi lokusmi, pokiaľ ide o úroveň expresie. ). Budúce štúdie budú musieť oddeliť príspevok rozdielov v metodológii alebo zložení bunkového typu k týmto rozdielom.

Porovnanie RNA-seq a qPCR na skutočných údajoch

Ďalej sme porovnali odhady expresie RNA-seq s odhadmi získanými pomocou qPCR (obr. 2B). Hoci korelácia medzi expresiou RNA-seq a qPCR bola štatisticky významná pre všetky gény (p=0.024, 0.002, 0,000000016, pre HLA-A, -B a -C, v tomto poradí; Spearmanov test na pozitívnu asociáciu), veľkosť korelácií bola mierna pre HLA-A a -B a vyššia pre -C. Použitie personalizovanej referencie pre RNA-seq mierne zvýšilo koreláciu s qPCR v porovnaní so štandardnou referenciou (obr. S3). To súhlasí s naším predchádzajúcim pozorovaním, že odhady expresie na úrovni génov sa podstatne nelíšia medzi prístupmi založenými na referenčnom genóme alebo personalizovanými prístupmi pre gény HLA triedy I (Aguiar et al. 2019), pričom hlavnou výhodou personalizovaných prístupov sú odhady na Úroveň alely HLA, ktorú skúmame nižšie. Použitie korekcie zaujatosti u lososa (vychýlenie GC, vychýlenie špecifické pre sekvenciu a vychýlenie špecifické pre polohu) zlepšuje koreláciu s qPCR s najvyšším dopadom na HLA-B (porovnaj obr. 2B a S4 pre opravené a nekorigované údaje, v uvedenom poradí).

Porovnanie hladín mRNA s povrchovou expresiou

Pretože expresia RNA je informatívna o počiatočných krokoch bunkovej signalizácie a odozvy na stimuly, analýza jej vzťahu k následným molekulárnym fenotypom (ako je expresia proteínov na bunkovom povrchu) nám môže pomôcť pochopiť úlohu posttranskripčnej a posttranslačnej regulácie HLA výraz. Očakávajú sa rozdiely medzi množstvom RNA a proteínov, pretože podliehajú odlišným režimom regulácie. Technické efekty môžu tiež priniesť rozdiely, pretože techniky RNA a proteínov sa líšia a sú ovplyvnené nekorelovanými typmi chýb (Li a Biggin 2015; Kaur a kol. 2017; Carey a kol. 2019). Okrem toho v prípade našej štúdie bola génová expresia meraná na celkových PBMC, zatiaľ čo expresia proteínu bola meraná na triedených CD3 plus bunkách. S ohľadom na tento rozdiel sme merali mieru, do akej možno proteín HLA na bunkovom povrchu predpovedať expresiou mRNA. Táto analýza bola vykonaná výhradne pre HLA-C, pretože je to jediný lokus, pre ktorý je dostupná protilátka, ktorá sa môže viazať na všetky alely s rovnakými afinitami. Je zaujímavé, že medzi mRNA a expresiou proteínu bola vysoká korelácia pre HLAC, s mierne vyššou koreláciou pre RNA-seq (obr. 2C).

Expresia na úrovni alely HLA

HLA gény obsahujú regulačné elementy spojené s konštitutívnou transkripciou a dynamicky aktivovanou transkripciou (René et al. 2016). Výsledkom je, že expresia HLA sa v tkanivách líši a môže byť modulovaná regulačnými sieťami spúšťanými rôznymi stimulmi (Anderson 2018; Carey et al. 2019). Rastie záujem o pochopenie toho, či sú odlišné alely HLA spojené s rôznymi bazálnymi hladinami expresie a regulačnými programami (Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020) a či táto variácia prispieva k fenotypom ochorenia alebo výsledkom transplantácie (Petersdorf et al. a kol. 2014, 2015; René a kol. 2016; Bettens a kol. 2022; Johansson a kol. 2022). Preto sa porovnávali odhady expresie na úrovni alely HLA pre qPCR a RNA-seq. Pretože jednotlivé alely sú v súbore údajov často dosť zriedkavé, zoskupili sme ich podľa alelických línií (tj skupín alel, ktoré sú fylogeneticky definované vzťahom exónov) (Elsner et al. 2002).

Zoradili sme línie podľa ich úrovní expresie na základe údajov RNA-seq a qPCR a posúdili sme zhodu hodnotení medzi metódami (obr. 3). Náš personalizovaný prístup RNA-seq priamo poskytuje odhady na úrovni alel, pretože sekvencie alel HLA sa používajú na indexovanie zarovnaní, takže sme alelické línie zoradili podľa ich stredných hladín expresie. Pretože naše odhady expresie qPCR sú na úrovni génov a neposkytujú priamo odhady na úrovni alel, zoradili sme alelické línie podľa ich účinkov v lineárnom modeli hladín expresie vysvetlených genotypom HLA (pozri Ramsuran et al. 2015). Na obr. 3 sú hodnoty expresie vynesené dvakrát pre každú úroveň pre každú alelu jedinca a pre qPCR je to jednoducho dvakrát vynesená expresia na úrovni génu, ktorá odráža prítomnosť dvoch alel.

Poradie odhadov expresie je podobnejšie medzi RNA-seq a qPCR pre HLA-C ako pre -A a -B (priemerný absolútny rozdiel v poradí, kde rozdiel v poradí sa vzťahuje na pozorovaný rozdiel v pozíciách v rámci zoradeného poradia hodnôt expresie , medzi RNA-seq a qPCR kvantifikáciou, 2,3 pre HLA-C, 3,1 pre -A a 3,9 pre -B), podľa podobného vzoru zhody ako pri expresii na génovej úrovni, pre ktorú sme našli najvyššiu koreláciu medzi RNA-seq a qPCR pre HLA-C.

Medzi líniami s najväčším rozdielom medzi RNA-seq a qPCR je A*11. Merali sme povrchovú expresiu na podskupine heterozygotov pre A*03 alebo A*11 pomocou protilátky, ktorá má rovnakú afinitu pre obe línie, a pozorovali sme, že qPCR silnejšie koreluje s expresiou týchto dvoch alotypov na bunkovom povrchu ako RNA-seq (obr. S5). Ďalej uvádzame rozsiahlejšie hodnotenie usporiadania alel prostredníctvom porovnania s predchádzajúcimi štúdiami expresie HLA mRNA.

Zatiaľ čo existuje záujem o porovnanie rozdielov v expresii medzi alelami HLA, rôzne štúdie ukazujú, že variácie v expresii v rámci alely alebo alelickej línie sú často dosť vysoké a rozdiely medzi alelami rôznych úrovní sú často malé a nevýznamné. V dôsledku toho môže byť nereálne očakávať udržiavanie radov naprieč viacerými alelami a môže byť vhodnejšie porovnať odhady expresie pre alely na extrémoch expresie.

Pre naše údaje o RNA-seq porovnávame naše odhady s odhadmi z dvoch predchádzajúcich prístupov RNA-seq prispôsobených HLA na PBMC. Celkovo existuje dobrá zhoda s Yamamotom a kol. (2020), kde A*24, A*02, C*04 a C*06 sú vysoko exprimované a A*03, C*03 a B*15 sú exprimované na nízkych úrovniach, hoci vidíme aj rozdiely ako napr. čo sa týka B*35, čo by viac súhlasilo s našimi údajmi qPCR. Keď porovnáme naše údaje RNA-seq s Johanssonom a kol. (2021) však vidíme oveľa viac rozdielov, hoci majú veľmi malé vzorky pre mnohé línie.

Naše výsledky tiež porovnávame s výsledkami z dvoch predchádzajúcich štúdií qPCR, ktoré aplikovali alelovo špecifické priméry. Bettens a kol. (2014) použili alelovo špecifické priméry pre niektoré línie HLAC a videli, že C*04 a C*06 sú vysoko exprimované, zatiaľ čo C*07 a C*03 boli exprimované na nízkych úrovniach, v súlade s tým, čo máme pre obe RNA-sekv. a qPCR. René a spol. (2015) aplikovali alelovo špecifické priméry pre HLA-A a pozorovali A*02 (vysoké) a A*29 (nízke) pri extrémoch expresie, čo viac súhlasí s našimi výsledkami RNAseq ako s naším qPCR; avšak vidíme veľa rozdielov v iných alelických líniách

V niektorých prípadoch môžeme vyhodnotiť aj súhlas s funkčnými štúdiami. Napríklad predchádzajúce analýzy väzbových miest pre transkripčný faktor (TFBS) a aktivity promótora (preskúmané v Anderson 2018) a štúdie o regulácii miRNA (Kulkarni et al. 2011) ukazujú, že C*03 a C*07 sú slabo exprimované alely, čo súhlasí s našimi pozorovaniami pre RNA-seq aj qPCR.

Možné zdroje rozdielov

Ďalej sme skúmali, či spracovanie vzoriek použitých pre RNA-seq mohlo prispieť k rozdielom medzi odhadmi expresie získanými pomocou qPCR a RNA-seq.

Jedným zo špecifických problémov bola dĺžka času, počas ktorého boli vzorky skladované v mrazničke –80 stupňov (približne 4 roky medzi testami qPCR a RNA-seq), ako aj ďalšie kroky špecifické pre experiment RNA-seq vrátane rozmrazovania vzoriek. Aby sme to vyriešili, vykonali sme druhý experiment RNAseq na čerstvej krvi prekreslenej od 11 jedincov, ktorí sú podskupinou 96 analyzovaných v tejto štúdii, a porovnali sme odhady expresie medzi dvoma časovými bodmi. Aj keď tento druhý test nesie technické aj biologické rozdiely týkajúce sa prvého experimentu RNA-seq (obr. S6A a B), korelácia celého transkriptómu v odhadoch expresie medzi časovými bodmi je vysoká (obr. S6C).

Hoci posúdenie korelácie s 11 jednotlivcami môže byť hlučné, korelácie v génoch HLA patria medzi najväčšie génové korelácie medzi týmito dvoma vzorkami (obr. S6D a F). Vypočítali sme tiež pomery alel v rámci jednotlivých jedincov, čo je pomer expresie medzi dvoma alelami HLA heterozygotného jedinca, a porovnali sme ich medzi časovými bodmi. Korelácia bola väčšia ako 0,94 pre HLA-A, -B a -C (obr. S6E). Preto sme nevideli žiadny dôkaz o významnom príspevku degradácie RNA na vysvetlenie nízkej korelácie medzi RNA-seq a qPCR v našej pôvodnej vzorke.

Ďalším možným príspevkom k rozdielom medzi RNA-seq a qPCR je to, že špecifická alela HLA môže byť v jednej alebo druhej metóde viac zaujatá, v takom prípade by jedinci nesúci takéto alely prispeli k veľkým rozdielom. Napríklad u jedincov nesúcich A*03 alebo u homozygotov pre C*07 existuje negatívny vzťah medzi qPCR a RNA-seq (obr. 4A).

Ďalším zdrojom rozdielov medzi metódami môže byť skutočnosť, že v našom prístupe RNA-seq personalizujeme všetky transkripty anotované Gencode pre každú alelu HLA; avšak skutočná diverzita transkriptov a jej asociácia so špecifickými alelami HLA nie sú dobre pochopené. Napríklad Kulkarni a kol. (2017) ukázali, že A*01 a A*11 produkujú kratšie 3′-UTR. Aby sme zistili, či dokážeme replikovať toto financovanie v našich údajoch o RNA-seq, zmapovali sme údaje do referenčného genómu a opravili sme na mapovanie skreslenia v génoch HLA pomocou hla-mapovača (Castelli et al. 2018). V skutočnosti, pre jedincov nesúcich A * 01 alebo A * 11, pokrytie čítania na 3 '-UTR HLA-A ukazuje prudký pokles na ~ 120 bp pred anotovaným koncom génu (obr. S7).

Pretože hodnoty transkriptu na milión (TPM) sa počítajú s ohľadom na referenčnú dĺžku, použitie odkazu, ktorý je dlhší ako skutočný prepis, vedie k podhodnoteniu expresie. Pokúsili sme sa kontrolovať možnosť takýchto kratších transkriptov zahrnutím verzie každého prepisu HLA-A so skráteným 3'-UTR do nášho indexu na zarovnanie čítania. Nenašli sme však žiadne dôkazy o expresii kratšej izoformy (obr. S8), pravdepodobne preto, že tieto kratšie izoformy sú obsiahnuté v izoformách s normálnou dĺžkou a Salmonova implementácia priraďuje všetky hodnoty väčšej izoforme. Zaujímavé je, že expresia na úrovni izoforiem odhaľuje izoformu s dlhším 5'-UTR exkluzívnym pre A * 11, čo prispieva veľkou časťou k celkovej expresii pre túto alelu (obr. S8).

Testovali sme aj normalizáciu našich odhadov expresie, v ktorej sme upravili dĺžky čítania vzhľadom na pokrytie čítania podporujúce proximálny alebo distálny 3'-UTR koniec (vážený priemer dĺžok prepisu s použitím pokrytia čítania ako váh). Hoci pozorujeme až 20-percentný nárast hladín expresie u jedincov nesúcich A*01 a/alebo A*11, po tejto úprave vidíme len malé zlepšenie v korelácii s qPCR (z rho=0. 20 na obr. 2 až rho=0.24 na obr. 4B).

A*01 a A*11 patria medzi alely s najväčšími rozdielmi v poradí medzi RNA-seq a qPCR (obr. 3) a nedokonalá reprezentácia ich pridružených transkriptov v anotácii môže spôsobiť skreslenie v našich odhadoch RNA-seq.

Nakoniec, normalizačné metódy používané na získanie konečných odhadov expresie zo surových údajov qPCR môžu byť tiež zdrojom rozdielov medzi odhadmi qPCR a RNA - pozri. Kvantitatívne testy PCR pre gény HLA triedy I zvyčajne amplifikujú oblasti v rámci exónov 1 až 4 a štandardizácia sa zvyčajne vykonáva pomocou expresie génu pre domácnosť, ako je B2M (2-mikroglobulín) (ako tomu bolo v tejto štúdii ). Zdôvodnenie tohto postupu je, že ak sú úrovne expresie štandardizované stabilne vyjadrenou referenciou, odhady pre rôznych jednotlivcov sa dajú na rovnakú stupnicu, čo umožňuje porovnanie medzi jednotlivcami.

B2M kóduje ľahký reťazec v molekule HLA triedy I a je pravdepodobné, že gény B2M a HLA triedy I majú určitú koordináciu expresie, pretože zdieľajú podobnú architektúru promótora (Kobayashi a van den Elsen 2{{1{12} }}} 12; Vijayan et al. 2019) a môžu byť regulované zdieľanými transkripčnými faktormi (napríklad NLRC5/CITA indukuje expresiu HLA triedy I a B2M v bunkových líniách Jurkat (Meissner et al. 2{{20}}10). Normalizácia expresie génu HLA pomocou korelovaných hodnôt môže vniesť skreslenie do našich odhadov qPCR, najmä pre HLA-B, pre ktoré vidíme vysokú korelácia s výrazom B2M (obr. 4C). Škálovanie premennej pomocou inej, ale korelovanej premennej môže spôsobiť poruchu privedením extrémnych hodnôt do stredu distribúcie a znížením rozptylu; v súlade s touto hypotézou sú variačné koeficienty pre údaje qPCR 0,61 a 0,50 pre HLA-A a -C, v uvedenom poradí, ale klesne na 0,17 pre HLA-B (na porovnanie, CV pre údaje RNA-seq sú 0,20, 0,14 a 0,29 pre HLA-A, -B a -C , respektíve). Avšak s použitím rovnakého dizajnu qPCR Ramsuran et al. (2017) normalizovali expresiu HLA-B buď génom B2M, GAPDH, 18 s a b-Aktín, a pozorovali veľmi konzistentné výsledky, čo nepodporuje vplyv normalizácie B2M na odhady qPCR.

Diskusia

Spoľahlivé odhady expresie HLA transkriptu môžu prispieť k rôznym výskumným otázkam, a hoci sa výsledok ochorenia často skúma v kontexte variácií HLA kódovania, úrovne expresie pravdepodobne vysvetľujú aj variácie v klinických výsledkoch (prehľad v Dendrou et al. 2018; a v Johansson a kol., 2022). Úrovne expresie majú tiež potenciál informovať o rozhodnutiach pri plánovaní transplantácie hematopoetických kmeňových buniek; napríklad, ak pri selekcii alogénnych darcov nie je k dispozícii dokonalá zhoda, zdá sa byť prospešné vybrať tie, ktoré sa nezhodujú v alelách s nízkou expresiou (Petersdorf et al. 2014, 2015). Spoľahlivé odhady expresie transkriptu môžu tiež pomôcť pri identifikácii eQTL, ktoré sú základom kontroly expresie HLA, ktoré by mohli byť integrované do zistení GWAS, dotazovaním sa, či sa známe zásahy v oblasti MHC zhodujú s eQTL pre gény HLA (pozri napr. S6 v Aguiar et al., 2019). Všeobecnejšie povedané, vylepšené odhady expresie HLA transkriptu nám pomôžu pochopiť genetickú architektúru regulácie HLA, identifikujúc relatívny príspevok cis-pôsobiacich variantov (tj tých v susedstve génu HLA, ktoré regulujú) a transakčných variantov (tie vo vzdialených genómové umiestnenia, vrátane na iných chromozómoch). To poskytne informácie o tom, do akej miery je variácia v expresii HLA alelovo špecifickou vlastnosťou v porovnaní s interindividuálnou charakteristikou nezávislou od alelickej identity (pozri Bettens et al. 2022).

Kvantitatívne techniky PCR nám umožnili odhaliť asociácie medzi expresiou HLA a fenotypmi chorôb. Nedávno sa RNA-seq stala metódou voľby na hodnotenie génovej expresie vo veľkých súboroch údajov s celým transkriptómom rôznych populácií. Schopnosť extrahovať presné informácie o expresii HLA z takýchto údajov je dôležitou výzvou a na dosiahnutie tohto cieľa bolo navrhnutých mnoho metód. Miera, do akej sa výsledky vyplývajúce z analýz RNA-seq zhodujú s výsledkami získanými pri použití qPCR, však v súčasnosti nie je známa. Hoci sa tieto metódy zameriavajú na rovnaký molekulárny fenotyp (množstvo RNA), výrazne sa líšia v použitých experimentálnych technikách, formách analýzy a normalizácie údajov, bioinformatických postupoch a predsudkoch, ktorým podliehajú.

Pokiaľ je nám známe, predchádzajúce štúdie porovnávajúce prístupy RNA-seq prispôsobené HLA s qPCR zahŕňali malé vzorky. Napríklad Johansson a kol. (2021) potvrdili svoje HLA-zacielené RNA-seq pomocou qPCR iba na 5 vzorkách na HLA-C, pričom financovali Pearsonov korelačný koeficient 0,9, čo nebolo významné (p=0,08) .

V tejto štúdii sme porovnávali kvantitatívne odhady expresie PCR a RNA-seq pre klasický gén HLA I. triedy HLA-A, -B a -C v zhodnej skupine 96 jedincov. Zistili sme mierne, ale významné korelácie v expresii na vzorke 96 jedincov. Vzhľadom na neexistenciu zlatého štandardu, s ktorým by sa dali porovnať tieto odhady, môžu k celkovému výsledku prispieť chyby v odhadoch a skreslenia spojené s oboma metódami.

Skúmali sme účinky rôznych faktorov, ktoré môžu vysvetľovať nízku koreláciu medzi odhadmi RNA-seq a qPCR, ako je napríklad zlý odhad expresie pre špecifické alely HLA a normalizácia pomocou jediného housekeeping génu v qPCR. Naše výsledky nemožno zovšeobecniť na každý návrh qPCR alebo RNA-seq potrubie, pre ktoré existuje široká škála rôznych prístupov. Podľa našich vedomostí je to však prvé priame porovnanie medzi qPCR a RNA-seq na odhad expresie HLA.

Naša štúdia navrhuje oblasti, ktoré si vyžadujú zlepšenie v určovaní expresie HLA transkriptu. Porovnania medzi RNA-seq a qPCR by napríklad mali využívať jednotné spracovanie vzoriek naprieč metódami (napr. rovnaký protokol izolácie RNA, čas skladovania/rozmrazovania, integrita RNA), aby sa obmedzili artefakty spojené s týmito metódami. Mapovanie krátkych čítaní na jednotlivé referenčné genómy alebo transkriptómy generuje predsudky a sú potrebné stratégie, ktoré mapujú čítania zohľadňujúce polymorfizmus HLA. Vzhľadom na to, že existuje niekoľko stratégií na dosiahnutie tohto cieľa (Boegel a kol. 2012; Lee a kol. 2018; Aguiar a kol. 2019; Gutierrez-Arcelus a kol. 2020; Darby a kol. 2020), bude kľúčové porovnať relatívna presnosť týchto prístupov.

Je tiež potrebné vyvinúť metódy, ktoré primerane zohľadnia variácie izoforiem, nielen na poskytnutie ďalšej vrstvy informácií, ale aj na presnejšie odhady expresie, pretože normalizácia počtov čítaní nesprávnou dĺžkou prepisu je potenciálnym zdrojom chýb. V tomto kontexte môžu byť dlho čítané dáta, ktoré priamo generujú úplné informácie o prepise, silným nástrojom (Cornaby et al. 2022). Nakoniec by sa pri kvantifikácii hladín expresie mala brať do úvahy aj variácia počtu kópií, známa vlastnosť pre určité lokusy HLA (napr. DRB).

Poďakovanie

Ďakujeme Tatiane Torres (University of São Paulo), Yang Luo (Harvard Medical School) a členom Joint Biology Consortium v ​​Bostone za ich užitočné diskusie.

Autorský príspevok

Diogo Meyer, Mary Carrington, Richard M. Single a Vitor RC Aguiar prispeli ku koncepcii a dizajnu štúdie. Prípravu materiálu, zber údajov a experimenty vykonali Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto a Mary Carrington. Analýzu údajov vykonali Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Maria Gutierrez-Arcelus a Diogo Meyer. Rukopis napísali Vitor RC Aguiar a Diogo Meyer. Všetci autori prečítali, prispeli a schválili konečný rukopis.

Financovanie

Finančná agentúra São Paulo (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) poskytla finančné prostriedky spoločnosti DM (2012/18010-0 a 2013/22007-7) a spoločnosti VRCA (2014/{{ 5}} a 2016/24734-1). National Institutes of Health, USA poskytol finančné prostriedky DM (NIH R01 GM075091), ktorý podporil časť postdoc VRCA. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) a Ministerstvo zdravotníctva, Brazília poskytli finančné prostriedky na experimenty RNA-seq a výskumné cestovateľské návštevy ako súčasť spoločného návrhu medzi USA a Brazíliou udelenom spoločnostiam MC a DM (470043/{{13} }). NIH/NIAID R01AI157850 podporuje SK. VR bola financovaná Juhoafrickou radou pre lekársky výskum (SAMRC) z prostriedkov Ministerstva vedy a techniky (DST); a čiastočne podporovaná aj prostredníctvom Subsaharskej africkej siete pre excelentný výskum TB/HIV (SANTHE), iniciatívy pre Afriku DELTAS (Grant č. DEL-15-006) od AAS.

Tento projekt bol financovaný úplne alebo čiastočne z federálnych prostriedkov z Frederick National Laboratory for Cancer Research, na základe zmluvy č. HHSN261200800001E. Obsah tejto publikácie nemusí nevyhnutne odrážať názory alebo politiku Ministerstva zdravotníctva a sociálnych služieb, ani zmienka o obchodných názvoch, komerčných produktoch alebo organizáciách neznamená schválenie vládou USA. Tento výskum bol čiastočne podporovaný Intramurálnym výskumným programom NIH, Frederick National Lab, Center for Cancer Research.

Dostupnosť údajov

Údaje RNA-seq prezentované v súčasnej publikácii boli uložené v databáze dbGaP a sú dostupné v databáze dbGaP pod phs003177.v1.p1.

Referencie

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, et al (2019) Odhad expresie a mapovanie eQTL pre HLA gény s personalizovaným potrubím. PLoS Genet 15:e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M et al (2012) Rizikový variant sklerózy multiplex HLA-DRB1*1501 sa spája s vysokou expresiou génu DRB1 v rôznych ľudských populáciách. PLoS One 7:e29819.

3. Anderson SK (2018) Molekulárna evolúcia prvkov kontrolujúcich expresiu HLA-C: Adaptácia na úlohu ligandu receptora podobného imunoglobulínu zabíjačskej bunky regulujúceho funkciu prirodzených zabíjačských buniek. HLA 92:271-278.

4. Apps R, Meng Z, Del Prete GQ et al (2015) Relatívne úrovne expresie proteínov HLA triedy I v normálnych bunkách a bunkách infikovaných HIV. J Immunol 194:3594-3600.

5. Apps R, Qi Y, Carlson JM, et al (2013) Vplyv hladiny expresie HLA-C na kontrolu HIV. Science 340:87-91.

6. Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmed WS et al (2023) SARS-CoV-2 doplnkové proteíny ORF7a a ORF3a používajú odlišné mechanizmy na zníženie povrchovej expresie MHC-I. Proc Natl Acad Sci USA 120:e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: knižnica R pre celogenómovú asociačnú analýzu. Bioinformatics 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, et al (2018) HLA-C downregulation by HIV-1 sa prispôsobuje genotypu HLA hostiteľa. PLoS Pathog 14:e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) Vysokoalelická variabilita v expresii HLA-C mRNA: asociácia s HLA-rozšírenými haplotypmi. Genes Immun 15:176–181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G et al (2022) Regulácia expresie HLA triedy I nekódujúcimi génovými variáciami. PLoS Genet 18:e1010212

11. Boegel S, Bukur T, Castle JC, Sahin U (2018) In Silico Typing of Classical and Non-classical HLA Alleles from Standard RNA-Seq Reads. Methods Mol Biol 1802:177-191.

For more information:1950477648nn@gmail.com