Analýza zloženia a imunologické aktivity oligosacharidov izolovaných z Cistanche Deserticola
Mar 02, 2022
Ako zlepšiť pamäť bez liekov?
Pre viac informácií prosím kontaktujteali.ma@wecistanche.com
Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1College of Food Science And Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Čína
Abstrakt:Oligosacharid (CDOS) sa získal zCistanche deserticolaalkalickou (pH{0}}) extrakciou, vyzrážaním etanolom a frakcionáciou na dve purifikované frakcie (tj CDOS-1 a CDOS-2) pomocou Sephadexu G-100 a Sephadex G-25 kolónová filtračná chromatografia. Monosacharidové zloženie CDOS bolo testované vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Zistilo sa, že CDOS-1 pozostával iba zo sacharózy a CDOS-2 pozostával hlavne zo sacharózy, ramnózy a manitolu s molárnym pomerom 1:0,73:3,61. Imunologické testy ukázali, že CDOS predstavoval významný účinok na index sleziny u myší, čím sa zvýšila fagocytózová aktivita makrofágov a stimulovala proliferácia buniek produkujúcich protilátky. Očakáva sa, že CDOS sa rozvinie na funkčné potraviny alebo lieky.
Kľúčové slová:Cistanche deserticola, oligosacharid, purifikácia, zloženie, imunologické aktivity.
Kliknutím získate výhody produktov cistanche
1. Úvod
Cistanche deserticolaYCMa.(RodinaOrobanchaceae) je krátka parazitická rastlina pôvodom zo severozápadu Číny. Celá sušená rastlina (bez kvetov) je známa ako tonikum a nazýva sa „Rou Congrong".V orientálnej medicíne sa klasifikuje ako sladká a slaná chuť, teplá povahy a pripisuje sa kanálom obličiek a hrubého čreva, s funkciou povzbudzovania obličiek a dopĺňania esencií, zvlhčovania čreva a uvoľňovania čriev [1] -[3]. Moderná farmakologická štúdia ukázala, že môže urýchliť syntézu DNA a oddialiť proces starnutia, zvýšiť antioxidačné [4], predchádzať a liečiť kardiovaskulárne choroby [3]. Okrem toho môže spôsobiť analgetické a anti -zápalové účinky [5], zlepšujú učenie a pamäť indukciou nervových rastových faktorov.Niektoré štúdie to naznačiliC. deserticola extrakty by mohli aktivovať fagocytárnu funkciu intraabdominálnych makrofágov u myší [7]-[9] a zvýšiť imunitu organizmu. Podľa predchádzajúcich štúdií obsahuje táto rastlina viacero aktívnych zložiek, medzi ktoré patria fenyletanoidové glykozidy, iridoidy, lignany, sacharidy, alkaloidy atď. [11]C. deserticola fenyletanoidové glykozidy a polysacharidy sú uznávané ako hlavné aktívne zložky, početné štúdie sa v posledných desaťročiach zamerali na ich štruktúru a bioaktivitu [12]-[17]. Čo sa týka cenných oligosacharidov vC. deserticola, prehľady sú dosť obmedzené. Oligosacharidy, sacharidy s krátkym reťazcom obsahujúce homo- alebo hetero-cukry, sú dobre známe pre svoje priaznivé účinky na ľudský život a už dlho sa vo veľkej miere využívajú [18]. Funkčné oligosacharidy, ktoré majú fyziologickú funkciu, ako je nízka kariogenita a rastový faktor bifidobaktérií [19], zlepšujú zdravie ľudí a zvierat. Používali sa ako potravinová zložka. Nedávno boli zaznamenané nové funkcie oligosacharidov, ktoré majú schopnosť modulovať imunitný systém u ľudí, zvierat a rýb [20]. V tomto článku uvádzame prvú časť výsledkov výskumného programu, frakcionáciu z celkových oligosacharidov získaných z alkalického extraktu zC. deserticolakombináciou ultrafiltrácie a gélovej permeačnej chromatografie a analýzou ich zloženia pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Okrem toho uvádzame aj imunologické aktivityC. deserticolaoligosacharidy. Pokiaľ je nám známe, existuje len málo publikovaných správ o štúdiách imunostimulačnej aktivityC. deserticola oligosacharidy.
2. Experimentálne
2.1. Materiály
TheC. deserticola bol kultivovaný a zozbieraný z Alexa League (Vnútorné Mongolsko, Čína). Myši Kunming (Grade II, šesť týždňov staré) boli zakúpené od Farmakologického experimentálneho centra Univerzity Vnútorného Mongolska. Sephadex G-100, Sephadex G-25, kyselina trifluóroctová (TFA), 1-fenyl-3-metyl-5-pyrazolón (PMP), D-glukóza, D- galaktóza, D-fruktóza, D-xylóza, D-manóza, kyselina D-galakturónová, kyselina D-glukurónová, sacharóza, ramnóza, manitol, fukóza, ramnóza, boli zakúpené od Sigma (St. Louis, MO, USA). Stredné RPMI{12}} bolo zakúpené od Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Všetky ostatné chemikálie boli analytickej kvality.
2.2. Extrakcia oligosacharidov
Sušené teláC. deserticola boli narezané na menšie kúsky a ďalej rozomleté na prášok v mlyne boli extrahované bezvodým etanolom (3 x 5000 ml) pri 70 stupňoch počas 3 hodín za atmosférického tlaku. Na odstránenie lipidov bol pripevnený spätný chladič. Zostávajúci zvyšok sa potom trikrát extrahoval alkáliou (pH =10) pri 60 stupňoch (vždy 2 hodiny). Po centrifugácii (2000 g počas 15 minút, pri 20 stupňoch) sa supernatant skoncentroval na jednu desatinu objemu v rotačnej odparke za zníženého tlaku pri 50 stupňoch a prefiltroval. Potom bol filtrát deproteinovaný pomocou činidla Sevag [21] a odfarbený aktívnym uhlím.
2.3. Izolácia a čistenie oligosacharidov
Lyofilizované surové oligosacharidy sa rozpustili v destilovanej vode, odstredili a potom sa supernatant čistil pomocou kolóny Sephadex G-100 (1 x 50 cm), ekvilibrovanej ultračistou vodou. Po nanesení vzorky sa kolóna eluovala ultračistou vodou pri prietoku 5 ml/min. Rôzne frakcie sa odoberali pomocou skúmaviek. Celkový obsah sacharidov v každej skúmavke sa meral pri 490 nm pomocou fenolu-H2SO4metóda [22]. Roztok eluovaný vodou sa rozdelil na dve frakcie CDOS-1 a CDO-2. Dve frakcie sa ďalej purifikovali na kolóne Sephadex G-25 (2,7 x 85 cm) s použitím ultračistej vody (pri prietoku 1 ml/min). Po zbere purifikovanej frakcie bola táto lyofilizovaná.
2.4. Analýza monosacharidu zloženie
Monosacharidové zloženie CDO sa dosiahlo analýzou HPLC. CDO (2 mg) sa hydrolyzovali najskôr bezvodým metanolom obsahujúcim 2 M HCl pri 80 stupňoch počas 16 hodín pod atmosférou dusíka a potom s 2 M TFA pri 120 stupňoch počas 1 hodiny. Po odstránení TFA odparením boli hydrolyzáty následne derivatizované s PMP podľa opísanej metódy [23] a analyzované pomocou HPLC. HPLC separácia sa uskutočnila na systéme EF-2002 HPLC (spoločnosť KNAUER, Nemecko). Deriváty PMP sa chromatografovali s použitím objemu Sugar-PAK (6,5 x 300 mm, Glass of Water Company, Amerika) a absorbancia sa merala pri 245 nm. Objem nástreku bol 20 ul a mobilná fáza zložená z PBS (rozpúšťadlo A) a acetonitrilu (rozpúšťadlo B) sa použila na izokratickú elúciu v objemovom pomere 82 percent (A) ku 18 percentám (B). Celkový čas HPLC bol 40 minút a prietoková rýchlosť bola 0,5 ml/min.
2.5. Imunobiologické Aktivity
2.5.1. Fagocytárna funkcia monocytov-makrofágov
Šesťdesiat myší Kunming (stupeň II, šesť týždňov staré) sa zakúpilo z Farmakologického experimentálneho centra univerzity Inner Mongolia a pred použitím sa aklimatizovali 1 týždeň. Všetky myši boli náhodne rozdelené do štyroch skupín, ktoré pozostávali z kontrolnej skupiny s fyziologickým roztokom, skupiny s vysokou dávkou CDO, skupiny so strednou dávkou a skupiny s nízkou dávkou CDO. Myšiam sa intraperitoneálne injikoval roztok 0,5 ml oligosacharidov raz denne počas 5 dní. Skupina s vysokou, strednou alebo nízkou dávkou CDO dostala 1 0{{10}}, 50 alebo 25 mg/kg/BW CDO; a kontrolnej skupine sa vstreklo 0,5 ml fyziologického roztoku. Siedmy deň sa uskutočnil experiment odstraňovania uhlíkových častíc podľa Hou [24] a meral sa index sleziny a týmusu. V stručnosti, 0,05 ml/10 g/bw indického atramentu sa vstreklo do každej myši cez vena caudalis, potom sa získalo 20 ul krvi z vena orbitalis posterior 3 a 7 minút po injekcii. Vzorky krvi sa umiestnili do skúmaviek s 2 ml 0,1 percenta Na2CO3a hodnoty OD sa merali pri 600 nm. Index klírensu (K), fagocytárny index ( ) a index imunitného orgánu sa vypočítali nasledovne (1), t2a t1znamená 7 minút a 3 minúty.
2.5.2. Bunka produkujúca protilátky šírenie
Skupiny myší Kunming (päť na skupinu) boli imunizované intraperitoneálnou injekciou 2 x 107SRBC v 1.0 ml PBS pridaný s 50 ug testovaných materiálov (žiadne v kontrole). O týždeň neskôr splenocyty (106bunky na 2 ml na jamku) z myší Kunming boli kultivované s testovacími materiálmi alebo bez nich počas 72 hodín v 10 percentnom médiu RPMI 1640 pod 5 percentami CO2vo vzduchu, trojmo pre každú kultúru. Počet PFC proti SRBC na 106splenocytov.
2.6. Štatistické analýza
Údaje boli vyjadrené ako stredné hodnoty ± SD. Rozdiel medzi testovanými skupinami a kontrolou sa analyzoval Studentovým t-testom. P < 0.05="" sa="" považovalo="" za="">
3. Výsledky a Diskusia
3.1. Izolácia a čistenie oligosacharidov
CDO boli izolované z alkalického extraktu sušených tielC. deserticola o výnos 3.{14}}7 percent . Dve frakcie CDOS-1 a CDOS-2 boli izolované z eluátu destilovanej vody pomocou kolóny Sephadex G-100 (obr. 1). Purifikované frakcie CDOS-1 a CDOS-2 vykazovali jediný vrchol na kolóne Sephadex G-25, čo naznačuje, že vo vzorke neboli prítomné žiadne iné oligosacharidy. Výsledky monosacharidových kompozícií ukázali, že CDOS-1 bol zložený iba zo sacharózy (obr. 2) a CDOS-2 bol zložený hlavne zo sacharózy, ramnózy a manitolu (obr. 3) s molárnym pomerom z 1:0,73:3,61.
3.2. Imunobiologické aktivity CDO
Veľa dôkazov in vivo a in vitro preukázalo, že prirodzené oligosacharidy vykazujú imunomodulačnú funkciu stimuláciou bunkových aj humorálnych imunitných odpovedí [27], [28]. V tomto dokumente 100 mg/kg/bw CDO zvýšilo index myšacej sleziny, ale neboli žiadne významné rozdiely v indexe týmusu medzi liečenými skupinami a kontrolnými skupinami (tabuľka 1). Makrofágy sú dôležitou súčasťou obrany hostiteľa proti vírusovej infekcii inhibíciou intracelulárnej replikácie vírusov a zabíjaním buniek infikovaných vírusom [29]. Pri aktivácii sa z makrofágov uvoľňujú rôzne kyslíkové alebo dusíkové medziprodukty a cytokíny a podieľajú sa na rôznych dôležitých biologických funkciách, ako sú protizápalové a protinádorové aktivity [30]-[32]. Preto je fagocytárna aktivita makrofágov dôležitým indikátorom imunitných funkcií organizmu. V tejto štúdii mierne a vysoké dávky CDO zvýšili aktivitu fagocytózy makrofágov (tabuľka 1). Proliferácia buniek produkujúcich protilátky indukovaná CDO sa študovala skúmaním zvýšenia hemolytického PFC v slezinách myší Kunming, ktoré boli imunizované SRBC plus testovaná vzorka. Výsledky ukázali, že stredné a vysoké dávky CDO významne zvyšujú proliferáciu buniek produkujúcich protilátky (tabuľka 2). Vysoké dávky CDO spôsobili vysoko významné zvýšenie počtu PFC (P <>
Referencie
[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Rozpoznanie zmiešaného biologického signálu na základe analýzy vlniek. In: Y. Jiang, et al (eds).Proc. britsko-čínskeho športového inžinierskeho workshopu. Liverpool: Svetová akademická únia. 2007, str. 1-8.
[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao a kol. Účinky prvkov vzácnych zemín na rastCistanche deserticolabuniek a produkciu fenyletanoidných glykozidov.JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134
[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian a kol. Nový prírodný produkt odCistanche deserticolaYCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,1999, 8(2):61-63.
[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioxidačné pôsobenie glykozidovCistanchev tkanive myší.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.
[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRAntinociceptívna a protizápalová aktivita spôsobenáCistanche deserticolau hlodavcov.J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.
[6] Choi, JG; Mesiac, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MSCistanches Herbazlepšuje učenie a pamäť indukciou nervového rastového faktora.Behaviorálny výskum mozgu. 2011, 216 (2): 652–8.
[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Porovnanie medziCistanche deserticolaYC Ma a C,tubulosa(Shenk) Wight na niektoré farmakologické akcie.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.
[8] He W, Shu XF, Zeng GZ a kol. Štúdia zvyšovania sexuálnej potencieC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.
[9] Zeng GZ, He W, Wu GL a kol. Porovnania medziCistanche deserticolaYC Ma a C. tubulosa zavážili niektoré farmakologické účinky.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.
[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Imunomodulačné účinky polysachariduCistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.
[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Pokroky vo výskume chemických zložiek a liečivá aktivita Cistanche.Čínske divoké rastlinné zdroje, 2010, 29(1):7-11.
[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Izolácia a identifikácia fenyletanoidových glykozidov zCistanche deserticola.
Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.
[13] Lu NS, Liu JL Stanovenie fenyletanoidných glykozidov vCistanche deserticolamakrovezikulárnou živicovou spektrofotometriou.Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.
[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T a kol. Inhibícia oxidu dusnatého fenyletanoidmi v aktivovaných makrofágoch.
European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.
[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan a kol. Štrukturálna analýza vo vode rozpustného polysacharidu SPA izolovaného zo stonky Cistanche Deserticola Ma.Chemický časopis čínskych univerzít, 2005, 26(3):461-463.
[16] Wang Xiangyan. Štúdium imunitnej farmakológie a absorpčného charakteru polysacharidovCistanche deserticola. 2011, č. S1,Medicína a zdravotníctvo, E057-235-1-70.
[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektívna aktivita fenyletanoidov zCistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.
[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (vyd. The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)
[19] Araya, S. (ed.) Proceedings of the 5thKonferencia o zubnom kaze a spojovacom cukre (v japončine), Národný inštitút zdravia, Tokio (1980)
[20] Kodo Otaka. Funkčný oligosacharid a jeho nový aspekt ako modulácia imunity.J. Biol. Macromol. 2006, 6
(1), 3-9.
[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysacharidy z extraktov horúcej vody z pražených zŕn Coffea arabica: Izolácia a charakterizácia. Carbohydr.Polym.1999, 40:71–81.
[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrická metóda na stanovenie cukrov a príbuzných látok.Anal. Chem. 1956, 28:350–356.
[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analýza monosacharidových zložiek v polysacharidoch Angelica pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.
[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan a kol. Extrakcia a čistenie lektínu z červenej fazule a predbežné štúdie imunitnej funkcie lektínu a štyroch čínskych bylinných polysacharidov.Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.
[25] Cunningham, AJ a A. Szenberg. Ďalšie vylepšenia plakovej techniky na detekciu jednotlivých buniek tvoriacich protilátku.Imunológia.1968, 14:599-600.
[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura a kol. Imunobiologické aktivity porínovej frakcie izolovanej z Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infekcia a imunita. 1988, 56(4): 855-863.
[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Imunomodulačná aktivita CVT-E002: patentovaný extrakt zo severoamerického ženšenu (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.
[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Štruktúry a vzťahy medzi štruktúrou a aktivitou troch mitogénnych a komplement fixujúcich pektínové arabinogalaktány z malijských protivredových rastlínCochlospermum tinctoriumA. Bohatý aVernonia kotschyanaSch Bip. bývalý Walp.Biomakromolekuly. 2006, 7:71–79.
[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim a J.-K. Hwang, Imunomodulačná aktivita Arabinogalaktánu a Fucoidanu in vitro.Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.
[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian a kol. Hodnotenie a porovnanie imunoregulačnej aktivity štyroch vo vode rozpustných frakcií Angelica Sinensis in vitro na peritoneálnych makrofágoch u ICR myší.Medzinárodná imunofarmakológia. 2010, 10:422–430.
[31] YS Lee, OK Han, CW Park a kol. Expresia prozápalového cytokínového génu a regulácia oxidu dusnatého vo vodnom extrakte Astragali radix v bunkách makrofágov RAW 264.7.Journal of Ethnopharmacology. 2005, 100(3): 289–294.
[32] KY Lee a YJ Jeon. Polysacharid izolovaný z Poria cocos sklerotium indukuje aktiváciu NF-KB/Rel a expresiu iNOS v myších makrofágoch.Medzinárodná imunofarmakológia. 2003, 3(10-11):1353–1362.
