Analýza zloženia a imunologické aktivity oligosacharidov izolovaných z Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Abstraktné.Oligosacharid (CDOS) sa získal zCistanche deserticolaalkalickou (pH{0}}) extrakciou, vyzrážaním etanolom a frakcionáciou na dve purifikované frakcie (tj CDOS-1 a CDOS-2) pomocou Sephadexu G-100 a Sephadex G-25 kolónová filtračná chromatografia. Monosacharidové zloženie CDOS bolo testované vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Zistilo sa, že CDOS-1 pozostával iba zo sacharózy a CDOS-2 pozostával hlavne zo sacharózy, ramnózy a manitolu s molárnym pomerom 1:0,73:3,61. Imunologické testy ukázali, že CDOS predstavoval významný účinok na index sleziny u myší, pričom zvýšil fagocytóznu aktivitu makrofágov a stimuloval proliferáciu buniek produkujúcich protilátky. Očakáva sa, že CDOS sa rozvinie na funkčné potraviny alebo lieky.

Kľúčové slová:Cistanchedeserticola, oligosacharid, purifikácia, zloženie, imunologické aktivity.

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

1. Úvod

Cistanchedeserticola YCMa. (čeľaď Orobanchaceae) je nízka parazitická rastlina pôvodom zo severozápadu Číny. Celá sušená rastlina (bez kvetov) je známa ako tonikum a nazýva sa "Rou Congrong". V orientálnej medicíne je klasifikovaná ako sladká a slaná chuť, teplá v prírode a pripisuje sa kanálom obličiek a hrubého čreva, s funkciaosviežujúciaobličkya doplnenie esencie, zvlhčenie čreva a uvoľnenie čriev [1]-[3]. Moderná farmakologická štúdia ukázala, že môže urýchliť syntézu DNA a oddialiť proces starnutia, zvýšiť antioxidačné [4] , predchádzať a liečiť kardiovaskulárne ochorenia [3]. Okrem toho môže spôsobiť aj analgetické aanti-zápalovéúčinky [5], zlepšujú učenie a pamäť indukciou nervových rastových faktorov [6]. Niektoré štúdie ukázali, že extrakty C. deserticola by mohli aktivovať fagocytárnu funkciu intraabdominálnych makrofágov u myší [7]-[9] azlepšiťtelo's imunita[10]. Podľa predchádzajúcich štúdií táto rastlina obsahuje viacero aktívnych zložiek, medzi ktoré patria fenyletanoidové glykozidy, iridoidy, lignany, sacharidy, alkaloidy atď. [11] Ako C.deserticolafenyletanoidglykozidya polysacharidy sú uznávané ako hlavné aktívne zložky, početné štúdie sa v posledných desaťročiach zamerali na ich štruktúry a bioaktivity [12]-[17]. Čo sa týka cenných oligosacharidov vC. deserticola, prehľady sú dosť obmedzené. Oligosacharidy, sacharidy s krátkym reťazcom obsahujúce homo- alebo hetero-cukry, sú dobre známe pre svoje priaznivé účinky na ľudský život a už dlho sa vo veľkej miere využívajú [18]. Funkčné oligosacharidy, ktoré majú fyziologickú funkciu, ako je nízka kariogenita a rastový faktor bifidobaktérií [19], zlepšujú zdravie ľudí a zvierat. Používali sa ako potravinová zložka. Nedávno boli zaznamenané nové funkcie oligosacharidov, ktoré majú schopnosť modulovať imunitný systém u ľudí, zvierat a rýb [20]. V tomto článku uvádzame prvú časť výsledkov výskumného programu, frakcionáciu celkových oligosacharidov získaných z alkalického extraktu C. deserticola kombináciou ultrafiltrácie a gélovej permeačnej chromatografie a analýzu ich zloženia pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Okrem toho uvádzame aj imunologické aktivity oligosacharidov C. deserticola. Pokiaľ je nám známe, existuje len málo publikovaných správ o štúdiách imunostimulačnej aktivityC. deserticolaoligosacharidy.

2. Experimentálne

2.1. Materiály

C. deserticola bola pestovaná a zozbieraná z Alxa League (Vnútorné Mongolsko, Čína). Myši Kunming (Grade II, šesť týždňov staré) boli zakúpené od Farmakologického experimentálneho centra Univerzity Vnútorného Mongolska. Sephadex G-100,Sephadex G-25, kyselina trifluóroctová (TFA), 1-fenyl-3-metyl-5-pyrazolón (PMP), D-glukóza, D- galaktóza, D-fruktóza, D-xylóza, D-manóza, kyselina D-galakturónová, kyselina D-glukurónová, sacharóza, ramnóza, manitol, fukóza, ramnóza, boli zakúpené od Sigma (St. Louis, MO, USA). Stredné RPMI{12}} bolo zakúpené od Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Všetky ostatné chemikálie boli analytickej kvality.

2.2. Extrakcia oligosacharidov

Vysušené telá C. deserticola boli narezané na menšie kúsky a ďalej rozomleté ​​na prášok v mlyne boli extrahované bezvodým etanolom (3 x 5000 ml) pri 70 stupňoch počas 3 hodín za atmosférického tlaku. Na odstránenie lipidov bol pripevnený spätný chladič. Zostávajúci zvyšok sa potom trikrát extrahoval alkáliou (pH =10) pri 60 stupňoch (vždy 2 hodiny). Po centrifugácii (2000 g počas 15 minút, pri 20 stupňoch) sa supernatant skoncentroval na jednu desatinu objemu v rotačnej odparke za zníženého tlaku pri 50 stupňoch a prefiltroval. Potom bol filtrát deproteinovaný pomocou činidla Sevag [21] a odfarbený aktívnym uhlím.

2.3. Izolácia a čistenie oligosacharidov

Lyofilizované surové oligosacharidy sa rozpustili v destilovanej vode, odstredili a potom sa supernatant čistil pomocou kolóny Sephadex G-100 (1 x 50 cm), ekvilibrovanej ultračistou vodou. Po nanesení vzorky sa kolóna eluovala ultračistou vodou pri prietoku 5 ml/min. Rôzne frakcie sa odoberali pomocou skúmaviek. Celkový obsah sacharidov v každej skúmavke sa meral pri 490 nm metódou fenol-H2SO4 [22]. Roztok eluovaný vodou sa rozdelil na dve frakcie CDOS{10}} a CDO{11}}. Dve frakcie sa ďalej purifikovali na kolóne Sephadex G-25 (2,7 x 85 cm) s použitím ultračistej vody (pri prietoku 1 ml/min). Po zbere purifikovanej frakcie bola táto lyofilizovaná.

2.4. Analýza zloženia monosacharidov

Monosacharidové zloženie CDO sa dosiahlo analýzou HPLC. CDO (2 mg) sa hydrolyzovali najskôr bezvodým metanolom obsahujúcim 2 M HCl pri 80 stupňoch počas 16 hodín pod atmosférou dusíka a potom s 2 M TFA pri 120 stupňoch počas 1 hodiny. Po odstránení TFA odparením boli hydrolyzáty následne derivatizované s PMP podľa opísanej metódy [23] a analyzované pomocou HPLC. HPLC separácia sa uskutočnila na systéme EF-2002 HPLC (spoločnosť KNAUER, Nemecko). Deriváty PMP sa chromatografovali s použitím objemu Sugar-PAK (6,5 x 300 mm, Glass of Water Company, Amerika) a absorbancia sa merala pri 245 nm. Objem nástreku bol 20 ul a mobilná fáza zložená z PBS (rozpúšťadlo A) a acetonitrilu (rozpúšťadlo B) sa použila na izokratickú elúciu v objemovom pomere 82 percent (A) ku 18 percentám (B). Celkový čas HPLC bol 40 minút a prietoková rýchlosť bola 0,5 ml/min.

2.5. Imunobiologické aktivity

2.5.1. Fagocytárna funkcia monocytov-makrofágov

Šesťdesiat myší Kunming (stupeň II, šesť týždňov staré) sa zakúpilo z Farmakologického experimentálneho centra univerzity Inner Mongolia a pred použitím sa aklimatizovali 1 týždeň. Všetky myši boli náhodne rozdelené do štyroch skupín, ktoré pozostávali z kontrolnej skupiny s fyziologickým roztokom, skupiny s vysokou dávkou CDO, skupiny so strednou dávkou a skupiny s nízkou dávkou CDO. Myšiam sa intraperitoneálne injikoval roztok 0,5 ml oligosacharidov raz denne počas 5 dní. Skupina s vysokou, strednou alebo nízkou dávkou CDO dostala 1 0{{10}}, 50 alebo 25 mg/kg/BW CDO; a kontrolnej skupine sa vstreklo 0,5 ml fyziologického roztoku. Siedmy deň sa uskutočnil experiment odstraňovania uhlíkových častíc podľa Hou [24] a meral sa index sleziny a týmusu. V stručnosti, 0,05 ml/10 g/bw indického atramentu sa vstreklo do každej myši cez vena caudalis, potom sa získalo 20 ul krvi z vena orbitalis posterior 3 a 7 minút po injekcii. Vzorky krvi sa umiestnili do skúmaviek s 2 ml 0,1 percenta Na2C03 a hodnoty OD sa merali pri 600 nm. Index klírensu (K), fagocytárny index ( ) a index imunitného orgánu sa vypočítali nasledovne (1), t2 a t1 znamená 7 minút a 3 minúty.

2.5.2. Proliferácia buniek produkujúcich protilátky

Skupiny myší Kunming (päť na skupinu) boli imunizované intraperitoneálnou injekciou 2 x 107 SRBC v 1,0 ml PBS s pridaným 50 ug testovaných materiálov (žiadne v kontrole). O týždeň neskôr sa splenocyty (106 buniek na 2 ml na jamku) z myší Kunming kultivovali s testovacími materiálmi alebo bez nich počas 72 hodín v 10 percentnom médiu RPMI 1640 pod 5 percentami CO2 vo vzduchu, v troch opakovaniach pre každú kultúru. Stanovil sa počet PFC proti SRBC na 106 splenocytov [25], [26].

2.6. Štatistická analýza

Údaje boli vyjadrené ako stredné hodnoty ± SD. Rozdiel medzi testovanými skupinami a kontrolou sa analyzoval Studentovým t-testom. P < 0.05="" sa="" považovalo="" za="">

3. Výsledky a diskusia

3.1. Izolácia a čistenie oligosacharidov

CDO boli izolované z alkalického extraktu sušených tiel C. deserticola s výťažkom 3,{14}}7 percent. Dve frakcie CDOS-1 a CDOS-2 boli izolované z eluátu destilovanej vody pomocou kolóny Sephadex G-100 (obr. 1). Purifikované frakcie CDOS-1 a CDOS-2 vykazovali jediný vrchol na kolóne Sephadex G-25, čo naznačuje, že vo vzorke neboli prítomné žiadne iné oligosacharidy. Výsledky monosacharidových kompozícií ukázali, že CDOS-1 bol zložený iba zo sacharózy (obr. 2) a CDOS-2 bol zložený hlavne zo sacharózy, ramnózy a manitolu (obr. 3) s molárnym pomerom z 1:0,73:3,61.

3.2. Imunobiologické aktivity CDO

Veľa dôkazov in vivo a in vitro preukázalo, že prirodzené oligosacharidy prejavujú imunomodulačnú funkciu stimuláciou bunkových aj humorálnychimúnny odozvy[27], [28]. V tomto dokumente 100 mg/kg/BW CDO zvýšilo index myšacej sleziny, ale neboli žiadne významné rozdiely v indexe týmusu medzi liečenými skupinami a kontrolnými skupinami (tabuľka 1). Makrofágy sú dôležitou súčasťou obrany hostiteľa proti vírusovej infekcii inhibíciou intracelulárnej replikácie vírusov a zabíjaním buniek infikovaných vírusom [29]. Pri aktivácii sa z makrofágov uvoľňujú rôzne kyslíkové alebo dusíkové medziprodukty a cytokíny a podieľajú sa na rôznych dôležitých biologických funkciách, ako sú protizápalové a protinádorové aktivity [30]-[32]. Preto je fagocytárna aktivita makrofágov dôležitým indikátorom imunitných funkcií organizmu. V tejto štúdii mierne a vysoké dávky CDO zvýšili aktivitu fagocytózy makrofágov (tabuľka 1). Proliferácia buniek produkujúcich protilátky indukovaná CDO sa študovala skúmaním zvýšenia hemolytického PFC v slezinách myší Kunming, ktoré boli imunizované SRBC plus testovaná vzorka. Výsledky ukázali, že stredné a vysoké dávky CDO významne zvyšujú proliferáciu buniek produkujúcich protilátky (tabuľka 2). Vysoké dávky CDO spôsobili vysoko významné zvýšenie počtu PFC (P <>

Referencie

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Rozpoznanie zmiešaného biologického signálu na základe analýzy vlniek. In: Y. Jiang, et al (eds). Proc. britsko-čínskeho športového inžinierskeho workshopu. Liverpool: Svetová akademická únia. 2007, str. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao a kol. Účinky prvkov vzácnych zemín na rast buniek Cistanche deserticola a produkciu fenyletanoidných glykozidov. JB io-technol, 2003, 102 (2): 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian a kol. Nový prírodný produkt od Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioxidačné pôsobenie glykozidov Cistanche v tkanive myší. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRAnti-nociceptívna a protizápalová aktivita spôsobená Cistanche deserticola u hlodavcov. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Mesiac, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; MS Cistanches Herba zlepšuje učenie a pamäť indukciou nervového rastového faktora. Behaviorálny výskum mozgu. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Porovnanie medzi Cistanche deserticola YC Ma a C, tubulosa (Shenk) Wight na niektorých farmakologických akciách. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ a kol. Štúdia zvýšenia sexuálnej potencie C. deserticola. J Chin Med. 1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL a kol. Porovnania medzi Cistanche deserticola YC Ma a C. tubulosa majú váhu na niektoré farmakologické účinky. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Imunomodulačné účinky polysacharidu Cistanche deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Pokroky vo výskume chemických zložiek a liečivá aktivita Cistanche. Chinese Wild Plant Resources, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Izolácia a identifikácia fenyletanoidných glykozidov z Cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Stanovenie fenyletanoidných glykozidov v Cistanche deserticola makroretikulárnou živicovou spektrofotometriou. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T a kol. Inhibícia oxidu dusnatého fenyletanoidmi v aktivovaných makrofágoch.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan a kol. Štrukturálna analýza vo vode rozpustného polysacharidu SPA izolovaného zo stonky Cistanche Deserticola Ma. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Štúdium imunitnej farmakológie a absorpčného charakteru polysacharidov Cistanche deserticola. 2011, No.S1, Medicine and Health Sciences, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektívna aktivita fenyletanoidov z Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (vyd. The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (ed.) Zborník z 5. konferencie o zubnom kaze a spojovacom cukre (v japončine), Národný inštitút zdravia, Tokio (1980)

[20] Kodo Otaka. Funkčný oligosacharid a jeho nový aspekt ako modulácia imunity. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysacharidy z extraktov horúcej vody z pražených zŕn Coffea arabica: Izolácia a charakterizácia. Sacharid. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrická metóda na stanovenie cukrov a príbuzných látok. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analýza monosacharidových zložiek v polysacharidoch Angelica pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Anal Sci. 2005, 21:1177-1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan a kol. Extrakcia a čistenie lektínu z červenej fazule a predbežné štúdie imunitnej funkcie lektínu a štyroch čínskych bylinných polysacharidov. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ a A. Szenberg. Ďalšie vylepšenia plakovej techniky na detekciu jednotlivých buniek tvoriacich protilátku. Imunológia. 1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura a kol. Imunobiologické aktivity porínovej frakcie izolovanej z Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infekcia a imunita. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Imunomodulačná aktivita CVT-E002: patentovaný extrakt zo severoamerického ženšenu (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515-1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Štruktúry a vzťahy medzi štruktúrou a aktivitou troch mitogénnych a komplement fixujúcich pektínové arabinogalaktány z malijských protivredových rastlín Cochlospermum tinctorium A. Rich a Vernonia kotschyana Sch Bip. bývalý Walp. Biomakromolekuly. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim a J.-K. Hwang, Imunomodulačná aktivita Arabinogalaktánu a Fucoidanu in vitro. Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446-453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian a kol. Hodnotenie a porovnanie imunoregulačnej aktivity štyroch vo vode rozpustných frakcií Angelica Sinensis in vitro na peritoneálnych makrofágoch u ICR myší. Medzinárodná imunofarmakológia. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park a kol. Expresia prozápalového cytokínového génu a regulácia oxidu dusnatého vo vodnom extrakte Astragali radix v bunkách makrofágov RAW 264.7. Journal of Ethnopharmacology. 2005, 100 (3): 289–294.

[32] KY Lee a YJ Jeon. Polysacharid izolovaný z Poria cocos sklerotium indukuje aktiváciu NF-KB/Rel a expresiu iNOS v myších makrofágoch. Medzinárodná imunofarmakológia. 2003, 3(10-11):1353–1362.