Súčasné klinické aplikácie in vivo génovej terapie s AAV, časť 1

Dedičné choroby sú spôsobené mutáciami v génoch a viac ako 7000 zriedkavých chorôb postihuje viac ako 30 miliónov Američanov.

Genetické choroby sú choroby spôsobené génovými mutáciami, ako je vrodená hluchota, degenerácia mozgu atď. Výskyt týchto ochorení je podmienený genetickými faktormi a pamäť je dôležitá kognitívna schopnosť, ktorú musíme využívať v každodennom živote.

Genetické choroby však nemusia nutne poškodzovať pamäť. Mnohé štúdie ukázali, že aj keď existuje určitá súvislosť medzi niektorými genetickými ochoreniami a pamäťou, mnohé genetické faktory nemajú na pamäť niektorých ľudí žiadny vplyv.

Štúdie napríklad ukázali, že niektorí ľudia môžu byť nositeľmi génu pre Alzheimerovu chorobu, no aj v neskoršom veku si môžu zachovať normálnu pamäť a kognitívne schopnosti. Aj keď sú títo ľudia vystavení riziku vzniku Alzheimerovej choroby, nie sú nevyhnutne postihnutí touto chorobou.

Okrem toho mnohé genetické faktory môžu mať pozitívny vplyv na pamäť človeka. Niektoré štúdie napríklad ukázali, že niektorí ľudia s génmi krátkozrakosti si lepšie zapamätajú umiestnenie statických objektov. Títo ľudia majú špeciálne kognitívne schopnosti, ktoré môžu súvisieť s ich génmi krátkozrakosti.

Navyše, niektorí ľudia môžu byť nositeľmi niektorých génových mutácií, ktoré ľuďom uľahčujú zapamätanie a videnie vecí. Tieto genetické faktory dávajú týmto ľuďom vynikajúce kognitívne schopnosti.

Preto aj keď medzi dedičnými chorobami a pamäťou existuje určitá súvislosť, mali by sme tento vzťah vnímať pozitívne. Pamäť je dôležitá kognitívna schopnosť a možno ju zlepšiť správnym tréningom. Možno môžeme považovať dedičné choroby za výzvu, aby sme si zlepšili pamäť, prekonali ťažkosti a zlepšili svoje kognitívne schopnosti. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť našu pamäť a Cistanche môže výrazne zlepšiť našu pamäť, pretože Cistanche je tradičná čínska medicína s mnohými unikátnymi účinkami, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinnosť Cistanche pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu mnohými spôsobmi.

Kliknite na položku Poznať krátkodobú pamäť, ako sa zlepšiť

Už viac ako 30 rokov stovky výskumníkov tvrdia, že genetické modifikácie by poskytli účinnú liečbu mnohých zdedených ľudských chorôb a ponúkli trvalé a možno aj liečebné klinické výhody jedinou liečbou.

Tento prehľad je obmedzený na génovú terapiu s použitím adeno-asociovaného vírusu (AAV), pretože gén dodávaný týmto vektorom sa neintegruje do genómu pacienta a má nízku imunogenicitu.

V súčasnosti je na komercializáciu schválených a v súčasnosti dostupných päť liečebných postupov, tj Luxturna, Zolgensma, terapie dvoma chimerickými antigénovými receptorovými T bunkami (CAR-T) (Yescarta a Kymriah) a Strimvelis (gammaretrovírus schválený pre kombinovanú imunodeficienciu ťažkú ​​adenozín deaminázu [ADA-SCID ] v Európe). Desiatky ďalších liečebných postupov sú podklinickými skúškami.

Prehľadový článok predstavuje široký prehľad v oblasti terapie in vivo prenosom génov. Preskúmali sme genoterapiu neuromuskulárnych porúch (spinálna svalová atrofia [SMA]; Duchennova svalová dystrofia [DMD]; X-viazaná myotubulárna myopatia [XLMTM]; a ochorenia centrálneho nervového systému vrátane Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby, Canavanovej choroby, aromatického L - deficit dekarboxylázy aminokyselín [AADC] a obrovská axonálna neuropatia), očné poruchy (Leberova kongenitálna amauróza, vekom podmienená makulárna degenerácia [AMD], choroiderémia, achromatopsia, retinitispigmentosa a X-viazaná retinoschíza), porucha krvácania, hemofília a lyzozomálne ukladanie poruchy.

Dedičné choroby sú spôsobené mutáciami v génoch. Existuje viac ako 7000 zriedkavých chorôb, ktoré postihujú 30 miliónov Američanov, tj približne 10 % populácie. Podľa National Organization for RareDisorders je na svete niekoľko stoviek miliónov pacientov. Dve tretiny pacientov sú deti. V súčasnosti neexistujú žiadne účinné terapie pre viac ako 95 percent týchto pacientov.

Niekoľko liekov na báze liekov schválených pre genetické choroby najlepšie zvláda alebo upravuje symptómy. Neriešia však základnú genetickú príčinu ochorenia.

Preto sa tieto lieky musia podávať doživotne. Stovky výskumníkov zasvätili svoje životy honbe za tým, čo sa spočiatku javilo ako nesplniteľný sen: vývoju génových terapií pre dedičné choroby, tj jednorazovej liečebnej opravnej zmene postihnutého génu jednotlivca, ktorý minimalizuje alebo dokonca odstraňuje symptómy počas celého života pacienta.

Tento sen je teraz realitou: génová terapia výrazne zlepšuje vyhliadky na momentálne nevyliečiteľné dedičné choroby! Tento prehľad je obmedzený na génovú terapiu pomocou adeno-asociovaného vírusu (AAV), pretože gén dodávaný týmto vektorom sa neintegruje do genómu pacienta.

Glybera bola schválená americkým Úradom pre potraviny a liečivá (FDA) v októbri 2012 ako prvá génová terapia sprostredkovaná AAV, ktorá dosiahla tento míľnik. Glybera korigovala dedičnú nedostatočnosť lipoproteínovej lipázy (LPLD), ktorá sa prejavuje ako pankreatitída, opakujúca sa bolesť brucha a erupčné škvrny naplnené tukom, ktoré sú výsledkom veľmi vysokých hladín triglyceridov.

Zriedkavosť ochorenia (1 na milión), náklady pre pacienta a náklady na udržanie terapeutickej pripravenosti spoločnosti však veľmi sťažili pokračovanie komerčnej dodávky génov. Táto forma génovej terapie už nebola dostupná po roku 2018, vtedy sa liečilo len 31 ľudí na svete.

V súčasnosti je na komercializáciu schválených päť liečebných postupov, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii, tj Luxturna, Zolgensma, terapie dvomi chimérickými antigénovými receptorovými T bunkami (CAR-T) (Yescarta a Kymriah) a Strimvelis (gammaretrovírus schválený pre kombinovanú imunodeficienciu ťažkú ​​adenozín deaminázu [ADA-SCID] v Európe). Desiatky ďalších liečebných postupov sú v štádiu klinických skúšok.

Prehľadový článok predstavuje široký prehľad v oblasti terapie in vivo génovým prenosom, ktorý je založený na priamom podaní vektora génovej terapie do tela a nie na transplantácii génovo upravených buniek.

Tu preskúmame in vivo génovú terapiu neuromuskulárnych porúch (spinálna svalová atrofia [SMA]; Duchennova svalová dystrofia [DMD]; X-viazaná myotubulárna myopatia [XLMTM]; a ochorenia centrálneho nervového systému [CNS] vrátane Alzheimerovej choroby [AD] , Parkinsonova choroba [PD], Canavanova choroba [CD], deficit aromatickej L-aminokyseliny dekarboxylázy [AADC] a obrovská axonálna neuropatia [GAN], očné poruchy (Leberova kongenitálna amauróza [LCA], vekom podmienená degenerácia makuly [AMD ], choroiderémia, achromatopsia [ACHM], retinitis pigmentosa a X-viazaná retinoschíza [XLRS]), porucha krvácania, hemofília a poruchy lyzozomálneho ukladania (LSD).

V každej z týchto oblastí je pokrok fantastický, prebiehajú klinické skúšky a v niektorých prípadoch je liečba schválená regulačnými agentúrami a komercializovaná.

Klinická génová terapia pri neuromuskulárnych poruchách

Klinická génová terapia vo svojich rôznych formách sa rýchlo vyvíja a ponúka záblesk nádeje, na ktorý širšia komunita zriedkavých porúch dlho očakávala. Najsľubnejším vírusovým vektorom na prenos génov pre neuromuskulárne ochorenia je AAV, ktorý má vynikajúci bezpečnostný profil a účinnosť pri translácii.

Tu uvádzame tri sľubné klinické prístupy génovej terapie AAV, ktoré sú sľubné pre pacientov s ťažkými a oslabujúcimi neuromuskulárnymi ochoreniami.

SMA

SMA je devastujúce neurodegeneratívne ochorenie vyplývajúce z progresívnej straty motorických neurónov.1

Táto autozomálne recesívna porucha je výsledkom mutácie v géne SMN1 motorického neurónu prežitia s incidenciou približne 1:10, 000 živonarodených detí, z ktorých 60 % má SMA typu 1.2,3 Ľudský gén SMN je invertovaný duplikačný onchromozóm 5q13 .2.

SMN1 je telomerický a vysoko homológny SMN2, ktorý leží v centromerickej polohe.1,4 Bodová mutácia exónu 7- génu SMN2 vedie k zostrihu exónu a vylúčeniu z konečného transkriptu, čo vedie k nestabilnému degradovateľnému proteínu.5

Funkčný proteín SMN plnej dĺžky je primárne zodpovedný za SMN1 s malým príspevkom SMN2.6 V neprítomnosti SMN1 je počet kópií SMN2 hlavným determinantom klinického fenotypu.7

U postihnutých dojčiat s 2 kópiami SMN2 je pravdepodobné, že sa u nich vyvinie závažný typ 1 (SMA1), charakterizovaný rýchlo progresívnou slabosťou, neschopnosťou samostatne sedieť, respiračnou insuficienciou s progresiou do smrti alebo trvalou ventiláciou pred dosiahnutím veku 2.8 Pri príprave na pokusy na ľuďoch bol dôležitý krok demonštrujúce, že AAV9 dosiahol nervové bunky mozgového kmeňa a miechy.

It was confirmed in SMA murine models that systemically delivered self-complementary AAV9 (scAAV9) crossed the blood-brain barrier and achieved high levels of neuronal transduction.9,10 Preclinical studies, delivering scAAV9-SMN to SMA pups, demonstrated positive effects on survival, growth, and neuromuscular transmission.11,12 Two key observations from these studies worth noting were both time of intervention and dose-response effects on survival. Early treatment at postnatal day 2 extended the lifespan from 15 days to >250 dní.11

Skúmaný nový liek (IND) zabezpečil otvorenú klinickú štúdiu génovej terapie so zvyšujúcou sa dávkou, ktorá sa začala 13. mája 2014. Štúdia s rozsahom dávok scAAV9.kurací b-aktin (CB).SMN (štúdia START) pri nízkej ( n=3 bola schválená 6,7 1013 mg/kg) a vysoká (n=6; 3,3 1014 mg/kg). pri absencii trvalého vetrania. Na začiatku pokusu nebol prednizolón zahrnutý do protokolu.

Na 9. deň po podaní génu SMN prvému pacientovi chemické analýzy séra ukázali, že alanínaminotransferáza (ALT) sa zvýšila 16 > normálne. Na základe týchto zistení boli FDA predložené zmeny protokolu a zahŕňali prednizón v dávke 1 mg/kg denne, ktorá sa začala 24 hodín pred dodaním génu a ako bezpečnostné opatrenie znížila vírusovú záťaž pri vysokej dávke z 3,3 1014 vg. /kg až 2,0 1014vg/kg.

Toto sa teraz považuje za „terapeutickú dávku“ a používa sa pre ďalšie klinické štúdie génovej terapie. Výsledky štúdie génovej terapie SMA možno prekonali očakávania 15 zaradených subjektov s SMA (nízka dávka n=3; vysoká dávka n=12) .

Na záver štúdie (december 2017) boli všetky dojčatá nažive a všetkých 12 pacientov liečených terapeutickou dávkou nemalo trvalú ventiláciu.14 Prínos liečby bol rýchly: Detský test neuromuskulárnych porúch vo Philadelphii v detskej nemocnici vo Philadelphii (CHOPINTEND) sa zvýšil o 9,8 bodu za 1 mesiac a 15,4 bodu za 3 mesiace.

V terapeutickej dávke 11 sedelo bez pomoci, 9 sa prevracalo, 11 kŕmilo perorálne a mohlo hovoriť a 2 sa prebúdzalo nezávisle.13 Obrázok 1 ukazuje priemerné skóre CHOP-INTEND počas 24 mesiacov u pacientov s SMA liečených terapeutickou dávkou v porovnaní s prirodzenou anamnézou. Tieto motorické míľniky sú u dojčiat SMA1 bezprecedentné a boli jasným dôkazom robustnej rozšírenej transdukcie motorických neurónov.

Kľúčovým klinickým pozorovaním, ktoré odlišovalo pacientov liečených terapeutickými dávkami, bolo zachovanie a obnovenie respiračných a orálnych motorických schopností. Účinnosť korelovala s včasnou liečbou a vysokým CHOP-INTEND.15

Jediný pacient liečený po 7,9 mesiacoch nereagoval na liečbu. Zvýšené sérové ​​aminotransferázy boli pozorované u 4 pacientov a boli oslabené kortikosteroidmi.

V apríli 2018 spoločnosť Novartis uzavrela zmluvu o kúpe AveXis a pokračovala v sledovaní 15 subjektov zaradených do štúdie. V máji 2019 získal onasemnogén abeparvovec (Zolgensma) schválenie FDA ako vôbec prvá systémovo podávaná AAV génová terapia. Po schválení patrí medzi pozoruhodné udalosti pokračujúce dlhodobé sledovanie subjektov zaradených do štúdie START.

Pri poslednom zostrihu údajov 31. decembra 2019 prežilo 11 z 12 pacientov liečených v prvom skúšaní terapeutickou dávkou bez potreby trvalej ventilácie. Boli zdokumentované nové míľniky a skóre CHOP-INTEND sa zvýšilo o 24,5 bodu.

Dvaja ďalší pacienti získali míľnik státia s asistenciou. Pri strihaní údajov mal najstarší pacient, ktorý dostával terapeutickú dávku, 5,6 roka, teraz 5,2 roka od prenosu génov.

Na ďalšie posúdenie vplyvu včasnej intervencie sa začala nová multicentrická štúdia presymptomatických dojčiat (vo veku % 6 týždňov) s 2 alebo 3 kópiami SMN2 (SPR1NT).

Treatment at a mean age of 20 days shows improvement in CHOP-INTEND scores >50 u všetkých jedincov s prežitím do 18 mesiacov (obrázok 2). V roku 2019 bol SMA pridaný do odporúčaného jednotného skríningového panelu (RUSP) a mnohé štáty prijali túto génovú terapiu na tvorbu politiky dostupnú pre novorodencov v priebehu prvých týždňov po narodení.

V Ohiu sa onasemnogeneabeparvovec liečilo 5 presymptomatických pacientov, pričom najstarší má teraz 12 mesiacov. Budúcnosť pre pacientov s SMA vyzerá jasne. Úspech génovej terapie SMA typu 1 sa rozšíril na pacientov so SMA od 6 mesiacov do<5 years with three copies of SMN2, and eligibility required the ability to sit independently in the absence of walking without support. 

Tri dávky scAAV.CB.SMN sa mali podať intratekálne. Skupiny s nízkou a strednou dávkou dokončili registráciu, ale vysoká dávka bola čiastočne pozastavená FDA.

Bolo to v reakcii na predklinickú štúdiu nahlásenú AveXis na primátoch (NHP), ktoré dostávali intratekálne vektory. Zistili zápal mononukleárnych buniek dorzálnych koreňových ganglií (DRG), niekedy sprevádzaný degeneráciou alebo stratou tela neurónových buniek. Thehold neovplyvnil intravenózne klinické štúdie Zolgensmy. Nedávne štúdie z Wilsonovho laboratória18 poskytujú ďalšie informácie.

Po infúzii vektora AAV do subarachnoidálneho priestoru u NHP je patológia v DRG konzistentným nálezom prakticky u všetkých zvierat. Podobné nálezy boli pozorované, dokonca aj v niektorých štúdiách, keď sa vyššie dávky podávali systémovo. Avšak v týchto NHP je pozoruhodná absencia akýchkoľvek klinických následkov pri použití terapeutických transgénov.

V kontexte rizika a prínosu teda odpoveď na pôrod pri klinickom ochorení SMA13 prevažuje nad obavami zo zápalového infiltrátu pozorovaného pri DRG. DMDDMD je X-viazaná degeneratívna svalová dystrofia spôsobená mutáciami v géne DMD.19

Génový produkt, dystrofín, je integrálnym cytoskeletálnym proteínom, ktorý ukotvuje kontraktilné aktínové vlákna k sarkoléme buniek kostry a hladkého svalstva.

Strata dystrofínu počas celého ochorenia vedie k lámavosti membrány, cyklom nekrózy a regenerácie, zníženej regeneračnej kapacite a nahradeniu svalov fibrózou.20 Klinicky progresívna svalová slabosť vedie k strate schopnosti chôdze vo veku 914 rokov a kardiorespiračnej nedostatočnosti. smrť v druhej alebo tretej dekáde.21

Elevácia svalovej kreatínkinázy (CK) indikujúca pretrvávajúcu dystrofickú patológiu je evidentná už pri narodení.22 CK klesá u nechodiacich pacientov, keďže kostrové svalstvo je nahradené fibrózou.

Veľká veľkosť génu DMD ho robí náchylným na spontánne mutácie. Incidencia je 1:5, 000 narodení mužov.22,23 Produkcia funkčného dystrofínu v rôznom množstve je výsledkom cielenia špecifických mutácií prístupných preskoku exónu.24 Hoci niektoré antisense oligonukleotidové (AON) terapie majú schválenie FDA,25 použiteľný pacient populácia a zachovanie funkcie zostávajú obmedzené. Génová substitučná terapia je potenciálne vylepšená stratégia zameraná na širšiu kohortu pacientov s DMD.

Hlavnou prekážkou bolo balenie veľkého génu DMD do vektorov AAV s obmedzením na<5 kb. To circumvent this challenge, designs for miniaturizing the dystrophin gene have been developed. 

Prijatie skrátenej verzie dystrofínu ako možnej liečby DMD je založené na pacientovi s Beckermuskulárnou dystrofiou, ktorý zostal ambulantný sedem desaťročí napriek vymazaniu takmer polovice jeho génu DMD.26

V súčasnosti transgény zahŕňajúce rôzne počty spektrínových opakovaní (SR) a pántov a dodávanie pomocou rôznych sérotypov AAV podstupujú hodnotenie bezpečnosti a účinnosti v simultánnych štúdiách systémovej génovej terapie (tabuľka 1) sponzorovaných Sarepta Therapeutics, Pfizer a Solid Biosciences, zhrnuté nižšie .Sarepta Therapeutics nedávno oznámila výsledky svojej fázy 1/2 otvorenej štúdie bezpečnosti a znášanlivosti, ktorá sa uskutočnila v NationwideChildren's Hospital (ClinicalTrials.gov: NCT03375164).27 Zaradených boli 4 chlapci s DMD, priemerný vek 4,8 roka, s mutáciami medzi exóny 18 a 58, užívajúci prednizolón počas R12 týždňov, ktorí dostali rAAVrh74.

MHCK7.micro-dystrophin (SRP-9001) delivered through an extremity vein. Subjects with AAVrh74 total binding antibody titers >1:400 boli vylúčené. Protokol zahŕňal jednu dennú dávku prednizónu, 1 mg/kg, začínajúcu 1 deň pred dodaním génu a pokračujúcu 30 dní (alebo viac, ak je to potrebné). Bola podaná jedna dávka SRP9001, 2,0 1014 mg/kg. Sérotyp AAVrh74 v kombinácii s tkanivovo špecifickým promótorom MHCK7 s a-myozínenhancerom predpovedali vysoké hladiny expresie v kostrovom aj srdcovom svale.

Mikro-dystrofínový transgén obsahuje SR 13, ktoré sa viažu na sarkolemu, čo vedie k zlepšeniu väzby na sarkolemu a produkcii sily, ako aj SR 24 a pánty 1, 2 a 4,28 Po 12 týždňoch biopsia svalu gastrocnemius v porovnaní s východiskovou hodnotou ukázala priemernú mikro- expresia dystrofínu 81,2 % svalových vlákien, s priemernou intenzitou 96 %.

Western blot (WB) ukázal priemernú expresiu 74,3 % bez úpravy na tuk alebo fibrózu a 95,8 % s úpravou. CK v sére zostala znížená u všetkých subjektov (rozsah 46 % 85 %) s funkčným zlepšením v priemere o 5,5 bodu v hodnotení North Star Ambulatory Assessment (NSAA) po 1 roku.

Došlo tiež k zlepšeniu času na vyšliapanie 4 schodov a beh/chôdza 100. Histologické nálezy odhalili chýbajúcu centrálnu nukleáciu a prstencové svalové vlákna a zníženie percenta obsahu kolagénu vo svaloch po liečbe v porovnaní s východiskovou hodnotou (priemer 26,7 % ± 8,4 %).

Profil nežiaducich udalostí (AE) bol minimálny. Traja pacienti mali prechodné zvýšenie g-glutamyltransferázy, ktoré ustúpilo kortikosteroidmi. Celkovo 18 udalostí sa považovalo za súvisiace s liečbou; najčastejšie bolo vracanie (50 %).

Príčina zvracania je nejasná, ale nekoreluje s imunitou AAV. Profil bezpečnosti a účinnosti podporil dlhodobé sledovanie a prebiehajúcu fázu 2, randomizovanú, placebom kontrolovanú, 96-týždňovú rozšírenú štúdiu s väčšou vzorkou (ClinicalTrials.gov: NCT03769116).

Farmaceutická spoločnosť Pfizer poskytla výsledky svojej pokračujúcej skúšky bezpečnosti a znášanlivosti PF-06939926 na nedávnom stretnutí American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT), ktoré sa konalo 15. mája 2020. rAAV9.mini-dystrophin bol podaný 9 chlapcom s DMD vo veku 6,2 až 12,8 rokov; všetci užívali denne glukokortikoidy bez už existujúcich neutralizujúcich protilátok AAV9.

Schéma zvyšovania dávky zahŕňala 1.0 1014 mg/kg (n=3) alebo 3,0 1014 mg/kg (n=6). Svalové biopsie na začiatku porovnávali mini-dystrofínový tonormálny stav pomocou kvapalinovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie (LCMS): 2 mesiace 20 % a po 12 mesiacoch 24 % (n=3).

Pri vysokej dávke bola expresia 35 % (n=6) a 52 % (n=3) v 2. a 12. mesiaci. Výsledky imunofluorescencie (IF) boli v rovnakom rozsahu pre vzorky testované pri vysokých a nízkych dávkach s miernym poklesom po 12 mesiacoch. NSAA pre 3 subjekty po 1 roku vykázala zvýšenie mediánu o 3,5 bodu oproti východiskovej hodnote.

Tuková frakcia odhadnutá pomocou MRI po 12 mesiacoch vykázala zníženie o 8 % pri vysokej dávke (n=3) a pri nízkej dávke sa nezmenilo. AE profil bol komplexnejší.

Viac ako 40 % účastníkov zažilo vracanie, nevoľnosť, zníženú chuť do jedla a pyrexiu. Vzhľadom na hlásenie akútneho poškodenia obličiek s atypickým hemolytickým uremickým syndrómom (aHUS) s aktiváciou komplementu vyžadujúcou hemodialýzu a ekulizumab, štúdiu pôvodne zaviedla spoločnosť Pfizer. umožniť zmeny protokolu (jún 2019).

U iného pacienta si trombocytopénia s aktiváciou komplementu podobnou HUS vyžadovala transfúziu krvných doštičiek a ekulizumab. Spoločnosť Pfizer oznámila plánovanú fázu 3, randomizovanú, multicentrickú, dvojito zaslepenú, placebom kontrolovanú štúdiu zahŕňajúcu 99 subjektov (C3391003) zaregistrovaných v ClinicalTrials.gov: NCT04281485.

For more information:1950477648nn@gmail.com