Konjugát dendrimer-tesaglitazar indukuje fenotypový posun mikroglií a zvyšuje -amyloidnú fagocytózu† Časť 2

In vitro biologické testy

Bunková kultúra. BV2 myšacia mikrogliálna bunková línia bola získaná z Children's Hospital of Michigan Cell Culture Facility.

V posledných rokoch vedci zistili, že bunková kultúra úzko súvisí s ľudskou pamäťou. Štúdie ukázali, že prostredníctvom štúdia bunkovej kultúry možno objaviť molekulárne mechanizmy v procese pamäti a učenia, čím sa zlepší ľudská kognitívna schopnosť a pamäť.

Bunková kultúra označuje proces umiestňovania biologických buniek do kultivačného média obsahujúceho základné živiny na rast a reprodukciu v podmienkach in vitro. Bunky sú základnými jednotkami života a bunková kultúra poskytuje vedcom platformu na štúdium bunkového správania a životných aktivít. Prostredníctvom štúdia buniek vedci objavili množstvo informácií o raste neurónov a synaptickom spojení. Tieto zistenia môžu nielen pomôcť ľuďom lepšie pochopiť, ako funguje mozog, ale tiež pomôcť pri vývoji nových liečebných postupov a liekov.

Výskumy posledných rokov ukázali, že bunková kultúra úzko súvisí aj s ľudskou pamäťou. Vedci zistili, že tvorba a udržiavanie ľudskej pamäte si vyžaduje veľa molekulárnej regulácie a prenosu signálov. Tieto mechanizmy prenosu signálu a regulácie majú veľa podobností s mechanizmami v bunkovej kultúre. Štúdiom mechanizmu prenosu signálu a regulácie v bunkovej kultúre môžu vedci lepšie pochopiť ľudskú pamäť a mechanizmy učenia.

Okrem toho niektoré štúdie tiež ukázali, že bunková kultúra môže určitými spôsobmi zlepšiť ľudskú pamäť a schopnosť učiť sa. Napríklad pomocou metódy nazývanej „elektrická stimulácia“ možno stimulovať aktivitu buniek a spojenie medzi neurónmi, čím sa zlepší ľudská kognitívna schopnosť a efekt učenia. Hoci je táto metóda stále v štádiu laboratórneho výskumu, očakáva sa, že sa v budúcnosti stane novou kognitívnou tréningovou metódou.

Stručne povedané, existuje úzke spojenie medzi bunkovou kultúrou a ľudskou pamäťou. Prostredníctvom štúdia buniek môžeme lepšie pochopiť ľudský kognitívny mechanizmus a pamäťový mechanizmus a tiež pomôcť pri vývoji nových liečebných metód a metód kognitívneho tréningu. Tešme sa na prínos technológie bunkovej kultúry pre ľudstvo v budúcnosti! Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche má antioxidačné, protizápalové účinky a účinky proti starnutiu, čo môže pomôcť znížiť oxidačné a zápalové reakcie v mozgu, čím chráni zdravie mozgu. nervový systém. Okrem toho môže Cistanche tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónových sietí. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, schopnosť učenia a rýchlosť myslenia a môžu tiež zabrániť výskytu kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Bunky BV2 sa kultivovali v médiu Dulbecco's Modified EaglesMedium (DMEM) s 10 % tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (HI FBS) a 1 % penicilínom/streptomycínom (P/S) pri 37 stupňoch a 5 % C02.

Keď bunky dosiahli konfluenciu v kultivačnej banke, bunky sa pasážovali do novej banky s použitím 0,05 % kyseliny trypsín-etyléndiamíntetraoctovej (EDTA). Pre experimenty sa bunky BV2 naočkovali v DMEM s 5 % HIFBS a 1 % P/S. O 24–48 hodín neskôr boli bunky stimulované 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) LPS počas 3 hodín, aby sa bunkám umožnilo vstúpiť do prozápalového (M1) fenotypu na simuláciu neurozápalového prostredia prítomného pri mnohých neurologických ochoreniach.

Bunky sa potom spoločne ošetrili s LPS a buď voľným Tesa alebo D-Tesa v rôznych koncentráciách pre 48 rúk, potom sa supernatant a bunky zhromaždili na spracovanie. Bunky nikdy neošetrené LPS (bez LPS) a bunky ošetrené len LPS vždy (len LPS) slúžili ako kontrolné skupiny. Voľné zásobné roztoky Tesa a D-Tesa boli sterilizované s použitím poly(étersulfónov) 0,2 um filtrov.

D-Tesa bola rozpustná v bunkovom médiu. Tesa bola solubilizovaná použitím dimetylsulfoxidu (DMSO) v konečnej koncentrácii nižšej ako 0,1 % (v/v). Cytotoxicita, test oxidu dusnatého a TNF-ELISA. Na test cytotoxicity boli bunky ošetrené tak, ako je opísané vyššie, v 96-jamkovej doštičke, a potom bola cytotoxicita voľnej Tesa a D-Tesa hodnotená testom MTT podľa pokynov výrobcu.

Pre test oxidu dusnatého boli bunky ošetrené tak, ako je opísané vyššie, v 12-jamkových doštičkách a potom boli zozbierané supernatanty z ošetrených buniek a okamžite boli kvantifikované hladiny oxidu dusnatého podľa protokolu výrobcu pre Griessovo činidlo.

Pre TNF-ELISA boli bunky ošetrené tak, ako je opísané vyššie, v 12-jamkových platniach a potom boli supernatanty z ošetrených buniek zozbierané a uskladnené pri -80 stupňoch, kým neboli pripravené na ďalšie spracovanie.

Potom sa vzorky rozmrazili na ľade a vykonala sa TNF-ELISA podľa protokolu výrobcu. Pre tieto štúdie sa D-Tesa aj voľná Tesa sonikovali a vortexovali, kým neboli úplne rozpustné. Na solubilizáciu voľnej Tesa sa najprv solubilizoval v DMSO pred zriedením, kde konečná koncentrácia DMSO bola pod 0,1 % (obj./obj.) pre všetky voľné vzorky Tesa.

Pretože D-Tesa bol rozpustný v médiu na kultiváciu buniek, DMSO sa do týchto vzoriek nepridával. Pre allin vitro štúdie bolo na bunky v oboch skupinách voľnej Tesa a D-Tesa aplikované ekvivalentné množstvo voľného alebo konjugovaného liečiva.

Kvantitatívna real-time PCR (qRT-PCR). Bunky boli ošetrené tak, ako je opísané vyššie, v 12-jamkových platniach a po zozbieraní supernatantu boli bunky zozbierané v Invitrogen™ TRIzol™ Reagent (od Fisher Scientific) a RNA bola extrahovaná podľa protokolu výrobcu. Koncentrácia a čistota výslednej RNA sa analyzovala s použitím Nanodropu.

Ekvivalentné množstvá RNA z každej vzorky sa konvertovali na cDNA podľa protokolu výrobcu pre vysokokapacitnú cDNA reverznú transkripčnú súpravu (od Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific).

Výsledná cDNA sa použila na analýzu qRT-PCR s použitím zeleného činidla FAST-SYBR a podľa protokolu výrobcu. Hodnoty Ct boli vypočítané strojom a dáta boli analyzované s použitím metódy 2-AACt.

Pre každý odlišný marker sa vypočítala hodnota ACt odčítaním ACt pre skupinu bez LPS od ACt pre každú vzorku. Hodnota ACt bola hodnota Ct pre záujmový gén mínus Ct pre GAPDH pre každú danú vzorku.

Keď sa vypočítal 2−ΔACt pre všetky skupiny, všetky sa potom normalizovali na skupinu bez LPS, čím sa pre skupinu bez LPS získala relatívna úroveň expresie 1.0 pre všetky markery. Dopredné a spätné sekvencie primérov sa použili pre qRT -PCR sú uvedené v tabuľke nižšie. Všetky sekvencie sa píšu od 5′→3′.

Okrem toho boli komerčne dostupné priméry zakúpené od spoločnosti BIORAD pre iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017345}), 01mmuCID0017345} ILSO{101} (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide (qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1 (qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CDqmmucid{060q, CDqm608q 404) a PPAR (qmmucid0018821). Test fagocytózy.

Vplyv voľnej Tesa a D-Tesa na fagocytózu -amyloidu bol stanovený pomocou predtým opísanej metódy.47 Stručne, múka HiLyte™ 488-označená -amyloid1–42 (od Anaspec Inc.) bola rozpustená v DMSO (konečná koncentrácia DMSO pod 0,5 % (v/v)) a zriedené na 5 ug ml-1 v PBS.

Po ošetrení buniek prípravkom Tesa a D-Tesa podľa schémy ošetrenia uvedenej vyššie sa na bunky na 2 hodiny aplikoval roztok -amyloidu. Potom boli bunky trikrát premyté Hankovým vyváženým soľným roztokom s dvojmocnými katiónmi (vápnik a horčík), odstránené z jamiek pomocou trypsínu a resuspendované vo FACS pufri (od Invitrogen).

Vzorky sa skladovali na ľade a ihneď sa spustili na prístroji Sony Cell Sorter SH800 na prietokovú cytometriu a údaje sa analyzovali pomocou pridruženého softvéru.

Brána bola nastavená pomocou buniek neošetrených fluorescenčným -amyloidom a uvedené výsledky sú percentá buniek z každej skupiny, ktoré vykazovali fluorescenciu nad fluorescenciou pozadia.

Priemerná intenzita fluorescencie (MFA) HiLyte™ 488-značeného -amyloidu bola tiež uvedená pre každú skupinu. Tento test sa uskutočnil v duplikáte. Všetky zobrazené údaje sú výsledkom troch samostatných experimentov, z ktorých každý sa uskutočnil trojmo, pokiaľ nie je uvedené inak. Na vykonanie štatistík sa použili GraphPad Prism 5 a Microsoft Excel.

Boli uskutočnené dvojstranné párové Studentove t-testy s BonferroniCorrection. Na určenie odľahlých hodnôt sa použil Grubbsov test. Na vykreslenie údajov sa použil GraphPad Prism 5 pre Windows (San Diego, CA). Uvedené údaje sú priemer + SEM.

Výsledky a diskusia

Syntéza a charakterizácia D-Tesa

Aby sa umožnilo cielené intracelulárne dodanie do aktivovaných mikrogliálnych buniek v mozgu, Tesa bola kovalentne konjugovaná na povrchu G4-PAMAM-OH so štiepiteľnými esterovými väzbami medzi liečivom a dendrimér-linkerom (obr. 1).

V prvom kroku sa Tesa (1) nechala reagovať s tetrametylénglykolazidom (TEG-azid) (2) za vzniku Tesa-TEG-azidu (3), ktorý má esterovú väzbu medzi liečivom a linkerom (obr. 1A).

HPLC zlúčeniny (3) ukázala retenčný čas 13,4 minúty s čistotou vyššou ako 99 % (obr. S1B†). Hmotnostné spektrum (3) ukázalo vrchol pri 610,13 [M + 1]+ zodpovedajúci molekulovej hmotnosti Tesa-TEG-azidu, čo ďalej potvrdzuje tvorbu produktu (obr. S2†). Oddelene sa G4-PAMAM-OH dendrimér (4) nechal reagovať s 5-hexínovou kyselinou použitím esterifikačnej reakcie za vzniku D-YNE (5) (obr. 1B).

Nakoniec, Tesa-TEG-azid (3) a D-YNE (5) reagovali vysoko účinnou meďou katalyzovanou cykloadíciou (CuAAC) click reakciou za vzniku D-Tesa (6) (obr. 1B).48 1H NMR potvrdila úspešnú syntézu všetkých medziproduktov a konečného produktu; D-Tesa (6) obsahoval charakteristické píky protónov dendriméru a liečiva, čo dokazuje úspešnú syntézu D-Tesa (obr. 2A).

NMR konečného konjugátu D-Tesa odhalilo, že ku každému dendriméru bolo pripojených priemerne desať molekúl Tesa. HPLC potvrdila úspešnú kovalentnú konjugáciu, keďže D-Tesa vykazovala posun od D-YNE aj TesaTEG-azidu (obr. 2B a S1†).

Tesa má zlú rozpustnosť vo vode, odhadovaná na 0,0035 mg ml-1,49 Konjugácia Tesa onhydroxyl dendriméru zlepšila jeho rozpustnosť vo vode o niekoľko rádov od tohto odhadu. D-Tesa bola rozpustná vo vode pri 22 mg ml-1, a keďže Tesa obsahuje ~19 % hmotnosti D-Tesa, bolo rozpustených 4,2 mg ml-1 ekvivalentu Tesa (obr. 3A).

Zvýšená rozpustnosť, ktorú poskytuje dendrimér, zvyšuje jednoduchosť formulácie a odstraňuje potrebu potenciálne toxických pomocných látok.50 Všetky tieto výhody dopĺňajú vynikajúcu schopnosť dendriméru dodávať voľné liečivá cez BBB do mikroglií in vivo a potenciálne znižovať dávka potrebná na dosiahnutie terapeutického účinku.18–28 Napokon, D-Tesa mala priemernú veľkosť 7,75 ± 0,29 nm (obr. S3†) a zeta-potenciál 2.86 ± 0,38 mV (meranie N=5 a N=3).

Uvoľňovanie drog

Navrhli sme D-Tesa na uvoľnenie Tesa intracelulárne v prostredí inendozómov/lyzozómov aktivovaných mikroglií s nízkym pH a vysokou koncentráciou esteráz. Už sme predtým uviedli, že dendriméry PAMAM vstupujú do buniek hlavne endocytózou vo fluidnej fáze a vezikuly, ktoré obsahujú konjugáty, sa transformujú na lyzozómy.

D-Tesa sme inkubovali pri 37 stupňoch v tlmivom roztoku citrátu sodnom (pH 5,5) v prítomnosti esteráz, aby sa napodobnili podmienky lyzozómov, ako sa uskutočnilo predtým.52–54 Tiež sme skúmali uvoľňovanie za podmienok, ktoré napodobňujú plazmatické podmienky (fyziologický roztok tlmený fosfátmi [PBS ] pufor, pH 7,4).

V podmienkach plazmy sa po 48 hodinách uvoľní len asi 1,5 % Tesa a do 25. dňa sa uvoľní menej ako 20 % Tesa, čo naznačuje plazmatickú stabilitu konjugátu (obr. 3B).

V lyzozomálnych podmienkach sa asi 60 % Tesa uvoľní z D-Tesa počas prvých 48 hodín a do 19 dní sa uvoľní takmer 100 % Tesa. Tieto výsledky demonštrujú, že D-Tesa poskytuje trvalé, spúšťané uvoľňovanie voľného liečiva počas prvých dvoch týždňov inkubovaných za fyziologicky relevantných lyzozomálnych podmienok.

Okrem toho je významné minimálne uvoľňovanie Tesa v podmienkach simulovanej plazmy (skupina pH 7,4) počas prvých 48 hodín, pretože toto je typický čas cirkulácie G4-PAMAM-OH pred klírensom obličkami, pravdepodobne sa uvoľní sominimal Tesa z konjugáty predtým, než dosiahnu mikrogliu.24

D-Tesa znížila expresiu M1 markerov a zvýšila M2 markery

Na vyhodnotenie schopnosti D-Tesa indukovať posun fenotypu M1 na M2 sme hodnotili schopnosť D-Tesa meniť expresiu markerov M1 a M2 in vitro pomocou myšacej mikrogliálnej bunkovej línie (BV2).

Bunky BV2 boli vytvorené imortalizáciou myších mikrogliových buniek a ukázalo sa, že sú vhodnou alternatívou k bunkám primárnej mikroglie na štúdium mikrogliálnej zápalovej reakcie.55,56 V našich experimentoch, aby sme napodobnili neurozápalové prostredie prítomné pri viacerých neurologických ochoreniach, sme mikrogliu vopred ošetrili 100 ng ml-1 (300 endotoxínových jednotiek (EU) na ml) LPS počas 3 hodín.

Potom sme bunky spoločne ošetrili LPS a buď voľným Tesa alebo D-Tesa počas 48 hodín, a potom sme odobrali vzorky. Bunky sme ošetrili v koncentráciách 1,5, 15 a 150 uM voľnej Tesa alebo D-Tesa na ekvivalentnej báze liečiva.

Test MTT ukázal, že voľný Tesaor D-Tesa v týchto koncentráciách nespôsobuje cytotoxicitu (obr. S4†). S prípravkami Tesa a D-Tesa sa vykonala počiatočná štúdia na zistenie dávky, aby sa určila najefektívnejšia dávka prípravkov Tesa a D-Tesa.

Ošetrenie s 1,5 a 15 µM voľného Tesa a D-Tesadid nemení sekréciu oxidu dusnatého alebo TNF-, ako sa stanovilo pomocou Griessovho činidla a TNF-ELISA (obr. S5†). Na základe týchto výsledkov sme neanalyzovali tieto nižšie koncentrácie v našich testoch qRT-PCR.

Pri mnohých neurodegeneratívnych ochoreniach je jednou z hlavných neurotoxických funkcií prozápalových mikroglií M1 ich sekrécia reaktívnych foriem kyslíka (napr. oxidu dusnatého), ktoré priamo zabíjajú neuróny.57,58 Následne sa predpokladalo, že jednou potenciálnou terapeutickou stratégiou by bolo zníženie tejto sekrécie týchto molekúl.

Hodnotili sme schopnosť D-Tesa dosiahnuť tento účinok. Po stimulácii LPS D-Tesa znížila hladiny sekrétovaného oxidu dusnatého a indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého (iNOS) mRNA 3.7-násobne (p < 0,0001) a 2-násobne (p {{ 7}}.011), v tomto poradí, v porovnaní s bunkami ošetrenými iba LPS (len LPS) (obr. 4A a B).

Na druhej strane, voľná Tesa znížila vylučovaný oxid dusnatý miernejšie (1,{1}}násobne, p=0,004) a neviedla k významnému zníženiu expresie iNOS mRNA (obr. 4A a B ).

D-Tesa bol oveľa účinnejší ako voľný Tesain potláčajúci sekréciu oxidu dusnatého. Ďalej, v závislosti od toho, či sú mikroglie vo fenotype M1 alebo M2, mikroglie upregulujú buď iNOS alebo arginázu 1 (Arg1), aby metabolizovali L-arginín na produkciu oxidu dusnatého na zabíjanie patogénov M1, orornitín a močovinu na reakciu na hojenie rán M2. 59

V súlade s jeho downreguláciou iNOS, D-Tesa zvýšil hladiny Arg1 mRNA 2-násobne (p=0,011) v porovnaní s kontrolou len LPS, zatiaľ čo voľná Tesa nezvýšila expresiu významne (p=0 40) (obr. 4C).

D-Tesa a v menšej miere bez Tesa zmenili mikroglie z uvoľňovania cytotoxického oxidu dusnatého na metabolizáciu L-arginínu na hojenie rán, čo má dôsledky na zníženie a potenciálne zvrátenie neurotoxicity spôsobenej mikrogliami pri neurodegenerácii.5–7,10

Zníženie hladín iNOS a vylučovaného oxidu dusnatého pri liečbe D-Tesa je výsledkom predchádzajúcej práce, ktorá preukázala, že prirodzený ligand PPAR (15-deoxy-Δ12,14-prostaglandín J2) znížil expresiu a sekréciu iNOS a oxidu dusnatého u liečených LPS primárna mikroglia.60

IL-10, IL{1}} a TGF- 1 sú všetky cytokíny, ktoré sú vylučované alternatívne aktivovanými mikrogliami M2, ktoré môžu vyvolať neuroprotektívne, protizápalové prostredie v mozgu.58,61,62Smerom na tento účel D-Tesa zvýšila expresiu IL-105.{10}}násobne (p=0.011) a IL-4 8.2-násobne (p { {15}}.013) v porovnaní s kontrolou len s LPS (obr. 4D a E).

Bezplatná spoločnosť Tesa výrazne nezvýšila úrovne IL-10 ani IL{1}}, hoci priemery boli 1.7-násobne (p=0,066) a 2.{{7} }-násobne (p=0.11) vyššie pre mikroglie liečené Tesa v porovnaní s kontrolami len s LPS (obr. 4D a E). Okrem toho D-Tesa zvýšila expresiu TGF- 1 2.3-násobne (p=0.015) a voľný Tesa výrazne nezmenil expresiu (obr. 4F).

D-Tesa teda indukuje sekréciu protizápalových cytokínov po liečbe mikroglií LPS, čo môže zmierniť neurotoxické, prozápalové prostredie prítomné pri neurodegeneratívnych ochoreniach.5–7,10

D-Tesa indukovaná expresia markerov podtypu M2-

CD206, Ccl1 a TLR8 sú špecifické markery pre podtypy mikroglií M2a, M2b a M2c.58 D-Tesa upregulovaná CD206 expresia 4.{{10 }}násobok (p < 0,001), Ccl1 3.5-násobok (p < 0,005) a TLR8 5-násobok (p < 0,01), zatiaľ čo voľná spoločnosť Tesa významne nezvýšila expresiu ktorýkoľvek z týchto troch markerov (obr. 5A–C).

Tieto údaje ukazujú, že mikroglie ošetrené D-Tesa demonštrujú signifikantnú upreguláciu markerov všetkých troch podtypov M2, čo súhlasí s pochopením, že fenotyp mikroglie je plastický a nie binárny.63–65

Nomenklatúra M1/M2 príliš zjednodušuje zložitosť, že mikroglie môžu existovať v spektre aktivačných stavov; pozdĺž tohto kontinua boli charakterizované tri odlišné fenotypy M2 (M2a, M2b a M2c) a D-Tesa indukuje expresiu markerov konzistentných s každým z týchto stavov.58,61,63,66,67 M2a mikroglie sa podieľajú na zvýšenej fagocytóze proteíny upreguláciou vychytávacích receptorov, opravou tkaniva a protizápalovými účinkami.

Mikroglie M2b sú ako mikroglie M1 v tom, že exprimujú IL-1, TNF- a IL-6; avšak M2b sa líšia od mikroglií M1 v tom, že exprimujú IL-10 vo vysokých hladinách a znižujú expresiu iNOS. Makrofágy M2b a mikroglie stimulujú Th2 T-bunky, čo svedčí o jednej z úloh M2b pri indukcii protizápalovej odpovede.

M2cmicroglia sa podieľa na hojení rán, remodelácii tkaniva, sekvestrácii železa a aktivácii STAT3, ktorá znižuje prozápalovú signalizáciu.58,61,63,66PPAR aktivita Tesa stimuluje doprednú slučku, ktorá vedie k zvýšenej expresii PPAR a jeho upstreamsignalizačného proteínu (STAT6), čo sú oba markery M2a.58D-Tesa zvýšila expresiu PPAR 2.3-násobne (p=0.0036) a STAT6 3.4- násobne (p < 0,001), zatiaľ čo voľná Tesa zvýšila STAT6 1.8-násobne (p=0,011) bez výrazného zvýšenia expresie PPAR (1,{23}}násobné zvýšenie, p=0.17) (obr. 5D a E).

Zvýšená expresia STAT6 a PPAR vedie k produkcii protizápalových génov a inhibícii prozápalových signálov inhibíciou aktivity NF-KB. Keďže mikroglie M2a môžu byť indukované ošetrením mikroglií pomocou IL-4, ktorý signalizuje prostredníctvom STAT6 a PPAR, upregulácia týchto dvoch downstream signálnych proteínov môže mať za následok spätnú polarizáciu M2a.68

V našich testoch aktivácia LPS zvýšila hladiny IL{0}}, TNF- a IL{2}} a liečba D-Tesa ďalej zvýšila expresiu týchto cytokínov (obr. S6A–D†), čo je pravdepodobné v dôsledku D-Tesa indukujúceho fenotyp M2b (obr. 5B).

Voľný Tesa zvýšil expresiu IL-6 a významne nezmenil expresiu TNF- a IL{2}} (obr. S6A–D†). Zatiaľ čo tieto cytokíny sú vylučované mikrogliami M1, mikroglie M2b tiež exprimujú tieto cytokíny.58,61 CD86 je markerom mikroglií M1 aj M2b a zvyšuje sa pri liečbe D-Tesa (obr. S6E†).

Okrem toho supresor cytokínovej signalizácie (SOCS) je rodina intracelulárnych proteínov, ktoré regulujú fenotypovú polarizáciu mikroglií potlačením viacerých signálnych dráh aktivovaných cytokínmi.69 SOCS1 je jedným členom tejto rodiny a ukázalo sa, že inhibuje LPS/TLR4 sprostredkovaná signalizácia NF-κB a JAK2, čím sa znižuje množstvo TNF-, IL-1 a IL-6 uvoľnené mikrogliou M1 prostredníctvom dráhy LPS/TLR4.

D-Tesa upreguluje expresiu SOCS1 v porovnaní s kontrolou len s LPS (obr. S6F†), čo naznačuje, že zvýšenie IL-6, TNF- a IL-1, ktoré vykazuje D-Tesa, by mohlo byť spôsobené indukciou M2b fenotyp a nie prostredníctvom vylepšenia LPS/TLR4, M1-indukujúceho fenotypu.

Okrem toho signály LPS cez TLR4 a na zabránenie nadmernej bunkovej aktivácii majú mikroglie mechanizmus negatívnej spätnej väzby, pričom aktivácia TLR4 vedie k zníženej expresii TLR4.70

Liečba voľným Tesa a D-Tesa zvýšila TLR4 úrovne 3.6-násobne (p < 0.001) a 3.7-násobne (p < 0,001), v tomto poradí (Obr. 5F), čo naznačuje, že Tesa a D-Tesa zmenili typickú signálnu dráhu negatívnej spätnej väzby LPS/TRL4.

For more information:1950477648nn@gmail.com