Detekcia a charakterizácia mineralo-organických nanočastíc v ľudských obličkách

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* a kol

Ektopická kalcifikácia je spojená s rôznymi ľudskými chorobami, vrátane aterosklerózy, rakoviny,chronickýobličkychoroba, acukrovkamellitus. Hoci boli v kalcifikovaných cievach zistené minerálne nanočastice, povaha a úloha týchto častíc v ľudskom tele zostáva nejasná. Tu po prvýkrát ukazujeme človekaobličkytkaniva získané z konečného štádiachronickýobličkychorobaalebo pacienti s rakovinou obličiek obsahujú okrúhle multilamelárne minerálne častice s veľkosťou 50 až 1 500 nm, zatiaľ čo u zdravých kontrol sa nepozorujú žiadne častice. Minerálne častice sa nachádzajú hlavne v extracelulárnej matrici obklopujúcej stočené tubuly, zberných kanálikoch a slučkách Henleho, ako aj v cytoplazme buniek ohraničujúcich tubuly a pozostávajú z polykryštalického fosforečnanu vápenatého podobného minerálu, ktorý sa nachádza v kostiach a ektopických kalcifikáciách. Theobličkyminerálne nanočastice obsahujú niekoľko sérových proteínov, ktoré inhibujú ektopickú kalcifikáciu v telesných tekutinách, vrátane albumínu, fetuínu-A a apolipoproteínu A1. Keďže minerálno-organické nanočastice sa nachádzajú nielen v kalcifikovaných ložiskách, ale aj v oblastiach bez mikroskopických kalcifikácií, naše pozorovania naznačujú, že nanočastice môžu predstavovať prekurzory kalcifikácie a obličkových kameňov u ľudí.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopická kalcifikácia je spojená s aterosklerózou, rakovinou,chronickýobličkychorobaa diabetes mellitus 1.–3. Nedávne štúdie naznačujú, že ateroskleróza achronickýobličkychorobapacienti s príznakmi vaskulárnej kalcifikácie vykazujú zvýšené riziko morbidity a mortality, čo naznačuje, že ektopická kalcifikácia je škodlivá pre ľudské zdravie1,3. Nežiaduca kalcifikácia sa pozoruje aj u starnúcich jedincov a väčšina ľudí vo veku nad 60 rokov vykazuje známky vaskulárnej kalcifikácie4. Z týchto dôvodov predstavuje dôležité ciele dešifrovanie faktorov, ktoré vyvolávajú ektopickú kalcifikáciu, a vývoj účinnej liečby.

Ektopickú kalcifikáciu možno definovať ako nerovnováhu medzi inhibítormi a induktormi kalcifikácie v tele. Inhibítory kalcifikácie zahŕňajú sérové ​​proteíny, ako je albumín, fetuín-A, osteopontín a matricový GLA proteín, ako aj malé zlúčeniny, ako je pyrofosfát, zatiaľ čo hyperfosfatémia a zápal predstavujú hlavné induktory kalcifikácie5–7. Nedávne štúdie naznačujú, že induktory kalcifikácie aktivujú bunkový proces podobný tvorbe kosti počas vaskulárnej kalcifikácie7,8. Matricové vezikuly podobné tým, ktoré vyvolávajú mineralizáciu vo vyvíjajúcich sa kostiach, boli tiež zistené v kalcifikovaných mäkkých tkanivách7–9. Tieto matricové vezikuly sú pravdepodobne uvoľňované bunkami hladkého svalstva ciev, ktoré sa diferencujú na bunky podobné osteoblastom, ktoré vyvolávajú kalcifikáciu7.

Minerálne nanočastice (NP) boli detegované v mäkkých tkanivách vykazujúcich známky ektopickej kalcifikácie. Price a spol. zistili, že sérum potkanov liečených buď bisfosfonátom etidronátom alebo vitamínom D obsahuje komplexy minerálov a proteínov obsahujúce inhibítory kalcifikácie fetuín-A a matrix GLA proteín10,11. Podobne Jahnen-Dechent a kol. pozorovali, že minerálne komplexy obsahujúce fetuín-A, ktoré sa nazývali kalciproteínové častice (CPP), bolo možné detegovať v ascitickej tekutine pacientov s kalcifikujúcou peritonitídou12. Nedávna štúdia Bertazza et al. preukázali prítomnosť minerálnych NP v aortálnych chlopniach a koronárnych artériách pacientov s aterosklerotickou aj reumatickou horúčkou13. Zatiaľ čo štúdie o tvorbe minerálnych častíc sa zvyčajne zameriavali na ľudský kardiovaskulárny systém, zostáva nejasné, či sa častice môžu nachádzať v iných tkanivách a či tieto entity zohrávajú úlohu v zdraví alebo chorobe.

Už skôr sme pozorovali, že minerálne organické NPS sa spontánne tvoria v telesných tekutinách ľudí a zvierat14–28. Tieto minerálne NP boli pôvodne opísané ako nanobaktérie (NB) a verilo sa, že sú nielen najmenšími bunkami na Zemi29, ale aj možnou prenosnou príčinou mnohých chorôb, vrátane Alzheimerovej choroby, aterosklerózy, rakoviny,obličkykameňtvorba, polycystickáobličkychorobaa prostatitída30–32. Naše výsledky však ukázali, že NB sú v skutočnosti neživé minerálne NP, ktoré napodobňujú bežné baktérie z hľadiska ich morfológie, rastu, proliferácie a subkultúry15, 18, 22. Možnosť, že minerálne častice podobné takzvaným NB sa môžu nachádzať v ľudských tkanivách a či tieto častice zohrávajú úlohu pri chorobe, je potrebné preskúmať.

V tejto štúdii sme vyvinuli nanomateriálový prístup na detekciu a analýzu minerálnych organických NP u chorých ľudíobličkytkanív. Ukazujeme, že obličkové tkanivá od pacientov v konečnom štádiu chronického ochorenia obličiek a pacientov s rakovinou obličiek obsahujú multilamelárne minerálne NP podobné biomimetickým minerálnym časticiam, ktoré sa spontánne zrážajú v telesných tekutinách in vitro. Naše výsledky odhaľujú kritické poznatky týkajúce sa biochemického zloženia, mechanizmu tvorby a biologickej funkcie týchto minerálno-organických častíc a objasňujú mechanizmy ektopickej kalcifikácie a iniciácie chorôb v ľudskom tele.

Výsledky

Skúmali sme obličkové tkanivá chirurgicky odstránené z ľudských pacientov s chronickým ochorením obličiek v konečnom štádiu (n=2) alebo s rakovinou obličiek (n=18; pozri tabuľku 1; pri vzorkách rakoviny obličiek sme sa zamerali na -rakovinová časť tkaniva). Ako zdravé kontroly sme študovali biopsie obličiek získané od pacientov s traumou alebo hematómom, ktorí však predtým nemali abnormálnu funkciu obličiek (n=2; tabuľka 1).

Obličkové tkanivá zdravých jedincov vykazovali normálne histologické znaky a po farbení von Kossa nebola pozorovaná žiadna ektopická kalcifikácia (obr. 1A, B). Na druhej strane obličkové tkanivá získané od chorých jedincov a zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E) vykazovali známky poškodenia tkaniva (obr. 2A-C, označené šípkami) a 80 percent vyšetrených chorých tkanív vykazovalo mineralizované usadeniny, ako sa ukázalo farbením von Kossa (obr. 1C–T, obr. 2E,F, kalcifikácia je viditeľná ako čierny materiál označený čiernymi šípkami; pozri tiež tabuľku 1). V kôre a dreni boli zaznamenané kalcifikované usadeniny, vrátane extracelulárneho priestoru obklopujúceho distálne stočené tubuly, proximálne stočené tubuly, zberné kanáliky a slučky Henle, ako aj cytoplazma buniek ohraničujúcich tubuly a kanáliky (obr. 1C–T a obr. 2E, F). V obličkovom teliesku nebola zistená žiadna kalcifikácia (obr. 2D).

Aby sme preskúmali povahu minerálnych precipitátov, pripravili sme ultratenké rezy obličiek na pozorovanie pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM). Vo vzorkách obsahujúcich mikroskopické ložiská minerálov boli minerálne častice alebo granule detegované v cytoplazme renálnych epitelových buniek, v extracelulárnej matrici pod bazálnou membránou a v lúmene proximálnych a distálnych stočených tubulov (obr. 3A, B, častice sú zväčšené v paneloch A1–A4 a B1–B4). Minerálne NP boli tiež pozorované v bunkách lemujúcich slučky Henle a zberných kanálikov (obr. 3C, D, zväčšené na paneloch C1, C2 a D1). Niektoré častice sa našli v intracelulárnych vezikulách v obličkových bunkách (obr. 3A, panely Al a A2). Použitý prístup elektrónovej mikroskopie nám tiež umožnil vizualizovať vnútro minerálnych častíc; niektoré častice obsahovali elektrón-husté prstence striedajúce sa so svetelnými, elektrón-lucentnými vrstvami (obr. 3A, panely A3 a A4, obr. 3C, panel C1). Niekoľko krvných ciev, ako napríklad vasa recta rents (priame tepny obličiek), sme obklopení veľkým počtom minerálnych NP (obr. 3D, panel D1). Minerálne NP sa teda našli na rôznych miestach vo všetkých ľudských obličkových tkanivách vykazujúcich známky ektopickej kalcifikácie, zatiaľ čo u skúmaných zdravých kontrol sa nenašli žiadne častice.

Minerálne častice nachádzajúce sa v obličkových tkanivách sa zdajú byť veľmi podobné minerálno-organickým NP opísaným spontánne sa tvoriacim v telesných tekutinách v našich predchádzajúcich štúdiách15,17 (a ktoré sme nazvali bióny24). Na overenie tejto možnosti sme pripravili minerálne organické NP (alebo bióny) pomocou metódy zrážania, ako sme už opísali15. Táto metóda pozostáva z pridania precipitujúcich iónov, ako je vápnik a fosfát do bunkového kultivačného média (Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium alebo DMEM) obsahujúceho telesnú tekutinu, ako je ľudské sérum (HS), po čom nasleduje inkubácia v podmienkach bunkovej kultúry (pozri Metódy). Častice vyrobené týmto spôsobom (HS-NPS) boli buď guľovité alebo elipsoidné a vykazovali hladký alebo kryštalický minerálny povrch (obr. 4A–E), podobný časticiam opísaným skôr v telesných tekutinách22,23 ako aj v ľudskom ascite12 a kalcifikované tepny13. Minerálne častice boli veľmi podobné minerálnym NP alebo granulám pozorovaným v tkanivách obličiek, pokiaľ ide o ich celkovú morfológiu, viacvrstvovú štruktúru a povrchové charakteristiky (obr. 4F–J). Veľkosť častíc odvodených od HS a obličkových granúl bola tiež porovnateľná, pohybovala sa od 50 do 1500 nm v priemere (obr. 4A–E,F–J). Ako bolo uvedené vyššie, niektoré obličkové granuly boli obklopené lipidovou membránou, možno predstavujúcou intracelulárne nákladné vezikuly alebo extracelulárne membránové vezikuly (obr. 4H, I, membrány sú označené šípkami); takéto membránové štruktúry chýbali vo vzorkách HS-NP pripravených in vitro (obr. 4A–E). Tieto pozorovania naznačujú, že obličkové granuly sú podobné minerálno-organickým NP zostaveným v sére.

Pomocou vybranej oblasti elektrónovej difrakčnej analýzy sme pozorovali, že minerálna fáza HS-NP pripravených in vitro pozostávala z polykryštalického nanomateriálu (obr. 4E, vložka; všimnite si slabé sústredné krúžky). Podobné výsledky sa získali pre obličkové granuly (obr. 4J, vložka) a pre kosti a ektopické kalcifikácie, ako je opísané v predchádzajúcich štúdiách33,35.

Študovali sme chemické zloženie HS-NP a obličkových granúl pomocou energeticky disperznej röntgenovej spektroskopie (EDX). HS-NP vykazovali hlavné vrcholy uhlíka (C), vápnika (Ca), kyslíka (O) a fosforu (P) (obr. 4K), čo je v súlade s prítomnosťou minerálu fosforečnanu vápenatého. Nízky pík kremíka (Si) bol tiež zaznamenaný v HS-NP (obr. 4K), čo možno predstavuje minoritnú zložku častíc. Obličkové granuly tiež vykazovali vrcholy uhlíka, vápnika, kyslíka a fosforu, čo naznačuje minerál fosforečnan vápenatý, spolu s ďalšími vrcholmi kremíka a železa (Fe) (obr. 4L). Vrcholy uránu (U) boli pripísané octanu uranylu použitému ako kontrastné činidlo počas prípravy vzorky (prítomnosť uránu v niektorých vzorkách minerálnych častíc, ako sú obličkové granule, a jeho neprítomnosť v kontrolnom tkanive na obr. 4M možno pripísať vysokej afinita uránu k fosfátu, ako už bolo uvedené35). Kontrolné EDX spektrá obličkového tkaniva obklopujúceho častice vykazovali vrcholy uhlíka a kyslíka (obr. 4M), čo naznačuje, že vápnik a fosfor sa nachádzali hlavne v minerálnych časticiach.

Pomery vápnika a fosforu (Ca:P) HS-NP a obličkových granúl sa pohybovali od 0,65 do 1,18. Tieto pomery sa líšia od teoretickej hodnoty 1,67 pozorovanej pre stechiometrický hydroxyapatit, ale stále sú v rozsahu pozorovanom skôr pre kryštály fosforečnanu vápenatého a apatitu pozorované pri rôznych stupňoch kryštalizácie15. Tieto zistenia spoločne potvrdzujú, že obličkové granuly pozostávajú z fosforečnanu vápenatého NP.

Zistilo sa, že rôzne proteíny inhibujú ektopickú kalcifikáciu systémovým spôsobom v tele36,37. Okrem toho sa predpokladá, že proteínová koróna nachádzajúca sa na povrchu syntetických NP určuje biodistribúciu a účinky častíc na bunky in vivo38,39. Na druhej strane, proteínové zloženie mineralo-organických NP nachádzajúcich sa v tkanivách ľudských obličiek zostáva neúplne pochopené. Už predtým sme zistili, že albumín, fetuín-A a apolipoproteín-A1 (apo-A1) predstavujú hlavné proteíny, ktoré interagujú s mineralo-organickými NP tvorenými v telesných tekutinách17,20. Tu sme použili značenie imunozlatom na preskúmanie prítomnosti a ultraštrukturálneho umiestnenia týchto proteínov v obličkových granulách.

Na vyšetrenie prítomnosti sérových proteínov v HS-NP a obličkových granulách sme použili polyklonálne protilátky proti ľudskému sérovému albumínu (HSA), ľudskému sérovému fetuínu-A (HSF), ľudskému apo{1}}A a celému HS. Špecifickosť polyklonálnych protilátok (pripravených ako je opísané vyššie25) sa overila pomocou Western blottingu (obr. 5). Každá z polyklonálnych protilátok reagovala pozitívne s HS-NP pripravenými in vitro, ako aj s minerálnymi granulami nachádzajúcimi sa v tkanivách ľudských obličiek (obr. 6A, B, panely A1–A3 a B1–B3; čierne bodky). Protilátky reagovali hlavne s vrstvami s hustotou elektrónov alebo s tmavým jadrom HS-NP a obličkových granúl (obr. 6A, B), čo naznačuje, že tieto tmavé oblasti môžu obsahovať vyššie hladiny proteínov v porovnaní s oblasťami s elektrónmi svetlými. Negatívne kontroly uskutočnené bez primárnej protilátky nevyvolali žiadnu reakciu (obr. 6A, B, panely A4 a B4, kontrola). Dospeli sme k záveru, že obličkové granule predstavujú mineraloorganické NP podobné HS-NP nielen na základe ich morfológie a minerálneho zloženia, ale aj na základe ich väzby na hlavné inhibítory kalcifikácie prítomné v sére.

Imunofluorescenčná mikroskopia sa použila na potvrdenie prítomnosti minerálnych granúl obsahujúcich HSA a HSF v chorých ľudských obličkách. Pomocou tejto techniky ukázali tkanivá ľudských obličiek

pozitívne farbenie na dva proteíny v rôznych oblastiach, vrátane interstícia obklopujúceho renálne tubuly, ako aj cytoplazmy buniek ohraničujúcich tubuly (obr. 7A, panely Al a A2). V týchto oblastiach boli tiež zaznamenané proteínové agregáty obsahujúce albumín aj fetuín-A, aj keď v nižších množstvách v porovnaní s farbením jednotlivých proteínov (obr. 7A a panel A3, spojené farbenie žltou farbou). Pozoruhodne sme si všimli, že farbenie proteínov detegované imunofluorescenciou sa tesne prekrývalo so vzorom ektopickej kalcifikácie pozorovaným použitím von Kossa farbenia (obr. 7A, B, kalcifikácia je viditeľná ako čierny materiál označený šípkami v B). Tieto výsledky poskytujú ďalšiu podporu pre prítomnosť minerálno-organických častíc vo vyšetrovaných ľudských obličkových tkanivách.

Diskusia

Aj keď sa dosiahol pokrok v našom chápaní interakcií medzi syntetickými NP a ľudskými bunkami, vieme oveľa menej o účinkoch minerálnych organických NP, ktoré sa tvoria spontánne v telesných tekutinách. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že tieto častice sa tvoria v biologických tekutinách, keď koncentrácie vápnika a fosfátu prekročia nasýtenie15,16. Tiež sme pozorovali, že tieto častice sú internalizované imunitnými bunkami, ale že iba veľké častice vyvolávajú prozápalové imunitné reakcie23. Distribúcia týchto častíc v ľudských tkanivách a to, či zohrávajú v tele nejakú fyziologickú alebo patologickú úlohu, však doteraz neboli preskúmané.

V tejto štúdii sme prvýkrát detekovali minerálne organické NP v obličkách ľudských pacientov trpiacich buď ochorením obličiek v konečnom štádiu alebo rakovinou obličiek. Detegované mineraloorganické NP obsahujú slabo kryštalizovaný fosforečnan vápenatý podobný minerálu kostí, ako aj albumín, fetuín-A a apo-A1, ktoré pôsobia ako systémové inhibítory kalcifikácie v telesných tekutinách. Naše výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi správami, ktoré popisovali prítomnosť komplexov minerál-proteín vo vaskulárnych tkanivách a telesných tekutinách12,13,34,40. Keďže častice, ktoré sme pozorovali, sa našli v oblastiach bez mikroskopických kalcifikácií, naše pozorovania naznačujú, že častice môžu predstavovať prekurzory ektopickej kalcifikácie v ľudských tkanivách. Vzhľadom na možnosť, že mineralo-organické NP môžu postupne rásť vo veľkosti a podstúpiť konverziu častíc na film za priaznivých podmienok, ako je opísané v našich predchádzajúcich štúdiách15,18, pozorovania tu uvedené naznačujú, že minerálne prekurzory môžu viesť k tvorbe väčších minerálne usadeniny in vivo, ako je Randallov plak a obličkové kamene.

Naše pozorovania, že minerálne ektopické kalcifikácie a mineraloorganické NP sa nachádzajú v rôznych anatomických štruktúrach obličiek, sú v súlade s predchádzajúcimi zisteniami o ektopických kalcifikáciách v tomto orgáne41. Pozorovania Evana a kol. ukázali, že mineralizácia v obličkách pacientov s nefrolitiázou môže začať a vyskytovať sa prevažne v intersticiálnom tkanive slučiek Henle40,42. Títo autori pozorovali, že minerálne usadeniny tvoriace sa v tejto oblasti môžu vyčnievať z bazálnej strany urotelu a viesť k tvorbe obličkových kameňov. Naše pozorovania naznačujú, že okrem slučiek Henle môžu aj iné oblasti obličiek obsahovať minerálne NP, ktoré sa môžu nakoniec vyvinúť a vytvoriť veľké ložiská minerálov v ľudských obličkách. Tiež skúmame možnosť, že minerálne NP, ktoré sa tvoria v krvnom obehu, sa môžu premiestniť do obličkových tkanív a vyvolať ektopickú kalcifikáciu a tvorbu kameňov v obličkách.

Niekoľko obličkových granúl detegovaných v tejto štúdii sa nachádza v intracelulárnych alebo extracelulárnych vezikulách (obr. 4H, I) a tieto sú podobné matricovým vezikulám, u ktorých sa ukázalo, že vyvolávajú kalcifikáciu v kostiach a zuboch7,8. Nedávno sme pozorovali, že vezikuly izolované z ľudského a zvieracieho séra indukujú tvorbu minerálnych NP a mikroskopických precipitátov in vitro25. Schlieper et al.34 tiež pozorovali, že minerálne častice nachádzajúce sa v artériách sú spojené s membránovými štruktúrami a navrhli, že matricové vezikuly alebo apoptotické telieska môžu predstavovať nukleátory minerálnych častíc v týchto tkanivách. Podobne Khan a kol. uviedli, že depozity fosforečnanu vápenatého nájdené v obličkách ľudských pacientov s idiopatickými obličkovými kameňmi sú spojené s kolagénovými vláknami a matricovými vezikulami9. Tieto výsledky naznačujú, že mineralo-organické NP detegované v tkanivách obličiek sa môžu tvoriť prostredníctvom mechanizmu zahŕňajúceho membránové vezikuly, čo je situácia analogická tomu, čo sa pozoruje v aterosklerotických artériách7,8. Na druhej strane nedávna štúdia ukázala, že ektopická kalcifikácia zistená v ženských prsných artériách nebola spojená s osteogénnymi alebo apoptotickými bunkovými markermi43, čo naznačuje, že mechanizmus kalcifikácie môže byť špecifický pre príslušný orgán alebo biologický kontext. Okrem toho, minerálne organické NP, ako sú tie, ktoré sú tu opísané, sa môžu vytvárať aj v tkanivách ľudských obličiek v dôsledku zlyhania pri udržiavaní fyziologických koncentrácií iónov (napr. vápnika a fosforečnanu) a inhibítorov kalcifikácie (napr. albumínu, fetuínu-A a apo -A1) v telesných tekutinách človeka.

Naše výsledky naznačujú, že elektrónovo hustá vrstva a jadro minerálnych organických NP môžu obsahovať vyššie hladiny proteínov a organických molekúl v porovnaní s elektrónovo svetlými oblasťami častíc (obr. 6A, B). Zdá sa, že tieto elektrónovo husté vrstvy sú mineralizované, ako je vidieť z kryštalickej povahy tohto materiálu pod TEM (pozri obr. 4A–J). Iní autori, vrátane Ryall41 a Evan et al.44, navrhli, že elektrónovo priesvitná vrstva môže predstavovať minerály, zatiaľ čo vrstvy s hustotou elektrónov môžu zodpovedať organickým molekulám. Tieto interpretácie môžu byť aspoň čiastočne spôsobené spôsobom, akým boli vzorky spracované a skúmané v každej štúdii, ako aj povahou použitých východiskových tkanív.

Okrem toho, že minerálne a organické častice zohrávajú úlohu pri ektopickej kalcifikácii, môžu vyvolať zápal v tkanivách obličiek. Nedávno sme ukázali, že zatiaľ čo minerálne organické NP nedokážu indukovať sekréciu prozápalového interleukínu-1 ľudskými makrofágmi, minerálne agregáty väčšie ako 1 μm to dokážu23. Ukázalo sa, že uvoľňovanie interleukínu-1 v reakcii na kryštalické materiály závisí od aktivácie intracelulárnych molekulárnych komplexov nazývaných zápaly45–47. Okrem toho boli minerálne častice zistené v obličkách s nádormi a súvislosť medzi rakovinou a zápalom je teraz dobre známa48. Možnosť, že agregované minerálne častice môžu aktivovať zápal a prispieť k rozvoju zápalu a rakoviny v obličkách alebo iných tkanivách, je potrebné preskúmať.

Okrem ektopickej kalcifikácie sa tu opísané minerálne granuly môžu podieľať na iných chorobných procesoch. Napríklad sme už skôr navrhli, že minerálne NP sa môžu viazať na rôzne proteíny v telesných tekutinách a vyčerpať tieto organické molekuly z telesných tekutín20,26. Na druhej strane, ľudské telo môže za normálnych okolností zabrániť tvorbe a akumulácii minerálnych NP spoliehaním sa na prítomnosť inhibítorov kalcifikácie a retikuloendoteliálneho systému (tj makrofágov). Minerálne NP sa tak môžu akumulovať len vtedy, keď je narušená systémová alebo lokálna kalciová homeostáza a keď ochranné mechanizmy v ľudskom tele zlyhajú.

Navrhujeme, aby sa tu vyvinutý nanomateriálový prístup mohol použiť na štúdium tvorby minerálno-organických NP v živočíšnych a ľudských tkanivách. Napríklad protilátky vytvorené proti proteínom inhibujúcim kalcifikáciu, ako je albumín, fetuín-A a apo-A1, sa môžu použiť v kombinácii s minerálnou analýzou na detekciu a charakterizáciu tvorby mineraloorganických NP v tkanivách zvieracích modelov. Výsledky získané použitím tohto prístupu možno použiť na klinické merania uskutočňované na ľudských telesných tekutinách s cieľom identifikovať biologické parametre, ktoré odrážajú stav tvorby minerálnych častíc a ektopickej kalcifikácie v tele. Očakávame, že tieto poznatky môžu viesť k vývoju nových terapeutických stratégií na prevenciu a liečbu ľudských chorôb a stavov spojených s ektopickou kalcifikáciou.

Metódy

Obličkové tkanivá.Použitie ľudských tkanív a experimenty vykonané v tejto štúdii boli schválené Inštitucionálnou revíznou radou nemocnice Chang Gung Memorial Hospital; metódy a experimenty boli vykonané v súlade so schválenými usmerneniami. Od pacientov bol získaný písomný informovaný súhlas. Kontrolné zdravé obličkové tkanivá boli získané z biopsií pacientov s traumou a hematómom bez anamnézy ochorenia obličiek (n=2); obličkové tkanivá sa získali aj od pacientov s rakovinou obličiek (n=20) a od pacientov s ochorením obličiek v konečnom štádiu (n=2), ktorým boli obličky odstránené alebo biopsia počas transplantačnej operácie (tabuľka 1). V prípade tkanív rakoviny obličiek sa v tejto štúdii odrezala a analyzovala nerakovinová časť tkaniva.

Histologická analýza.Obličkové tkanivá boli pripevnené na parafínové bloky. Bloky boli narezané a plátky tkaniva boli zahrievané na horúcej platni pri 70 stupňoch počas 30 minút, aby sa odstránil parafín. Rezy boli ponorené do čerstvého roztoku xylénu trikrát na 15 minút, aby sa úplne odstránil zvyšný parafín. Rezy boli rehydratované 95 percentami, 80 percentami a 70 percentami etanolu zakaždým počas 5 minút. Rehydratované vzorky sa premývali dvakrát destilovanou vodou (ddH20) počas 5 minút. Bunkové jadrá sa farbili hematoxylínom počas 8 minút. Farbivo sa odstránilo zo vzoriek teplou vodou počas 10 minút. Vzorky obličiek sa opláchli v ddH20 a 10-krát sa ponorili do 95 percentného etanolu. Vzorky ošetrené etanolom boli kontrastne zafarbené eozínom Y počas 1 minúty. Vzorky boli dehydratované 95 percentným a 100 percentným etanolom zakaždým 10 minút, po čom nasledoval krok dehydratácie v xyléne počas 10 minút. Konečné vzorky dehydrovaných obličiek sa umiestnili na sklenené podložné sklíčka s 50 percentami glycerolu a pozorovali sa pod svetelným mikroskopom vybaveným digitálnym fotoaparátom.

Deparafinizované a rehydratované vzorky boli pripravené tak, ako je opísané pre farbenie H&E. Rehydratované rezy boli zafarbené dusičnanom strieborným (5 percent), po čom nasledovalo vystavenie UV svetlu počas 20 minút. Roztok sa premýval ddH20 počas 15 minút. Rezy boli zafarbené tiosíranom sodným (5 percent) počas 5 minút, potom nasledovalo premytie ddH20 počas 15 minút. Rezy boli zafarbené jadrovou rýchlou červenou (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) počas 5 minút. Zafarbené vzorky sa dehydratovali postupne 95 percentami a 100 percentami etanolu, každá počas 10 minút, pred dehydratáciou v xyléne počas 10 minút. Vzorky obličiek boli pripevnené na sklenené podložné sklíčka a skúmané, ako je opísané vyššie.

Elektrónová mikroskopia a EDX analýza.Vzorky obličiek sa narezali na malé kúsky s hrúbkou menšou ako 1 mm pomocou mikroskopu na disekciu LGPS (Olympus, Tokio, Japonsko). Tkanivá boli fixované 2,5 percentami glutaraldehydu a 1 percentami paraformaldehydu v 0,1 M kakodylátovom pufri pri 4 stupňoch cez noc. Fixované vzorky sa trikrát premyli 0,1 M kakodylátovým pufrom v 8 percentách sacharózy (pH 7,2) na ľade počas 10 minút. Premyté tkanivá sa inkubovali vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS; 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HP04) s obsahom 1 percenta oxidu osmičelého a 1,5 percenta ferokyanidu draselného počas 2 hodín na ľade. Tkanivá boli trikrát premyté ddH20 na ľade 10 minút. Premyté tkanivá sa farbili na ľade s 1 percentom uranylacetátu v ddH20 počas 1 hodiny a potom sa trikrát premyli s ddH20 na ľade. Obličkové tkanivá boli dehydratované 30, 50, 70, 80 a 90 percentným etanolom vždy 10 minút, s výnimkou prípadov, keď etanol dosiahol 70 percent, v takom prípade sa vzorky skladovali pri 4 stupňoch cez noc. Tkanivá boli zafarbené 1% kyselinou fosfowolfrámovou v 95% etanole počas 15 minút, pred dehydratáciou 95% etanolom počas 5 minút. Vzorky boli ponorené do propylénoxidu pri 40, 57, 67 a 100 percentách v etanole zakaždým na 10 minút, potom nasledovalo ďalšie ponorenie do 100 percentného propylénoxidu na 5 minút. Obličkové tkanivá boli infiltrované 50, 70 a 100 percentami Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) zakaždým počas 1 hodiny. Vzorky obličiek vložené do eponátu sa pripravili dvojnásobnou inkubáciou v 100 percentnom eponáte. Vložené vzorky sa inkubovali v sušiarni pri 60 stupňoch cez noc, aby sa umožnila polymerizácia živice.

Premyté pelety HS-NP získané ako je uvedené vyššie boli fixované glutaraldehydom (2,5 percenta) a paraformaldehydom (1 percento) v ddH20 počas 4 hodín pri 4 stupňoch. Fixované pelety sa premyli ddH20 trikrát vždy 10 minút. Pelety boli dehydratované postupnými inkubáciami v 30, 50, 70, 80, 90, 95 a 100 percentnom etanole, zakaždým 10 minút, s výnimkou prípadu, keď etanol dosiahol 70 percent, kedy sa pelety skladovali pri 4 stupňoch cez noc. Iné etanolové roztoky boli uvedené do kontaktu s peletami iba na 10 minút. Dehydratované pelety boli infiltrované LR bielym zalievacím médiom (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) s použitím rôznych pomerov etanolu a LR média (3:1, 1:1 a 1:3), každé počas 30 minút. Pelety boli infiltrované čerstvým médiom LR (100 percent) cez noc pred polymerizáciou. Pelety infiltrované médiom LR sa inkubovali v sušiarni pri 60 stupňoch počas 2 dní, aby sa umožnila polymerizácia živice. Bloky obličiek a HS-NP boli narezané na rezy s hrúbkou 70–100 nm pomocou mikrotómu Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Nemecko). Tkanivové rezy boli zafarbené 4 percentami uranylacetátu pred vizualizáciou pod transmisným elektrónovým mikroskopom JEM 1230 (JEOL, Tokio, Japonsko) prevádzkovanom pri 100 kV. Obrazce elektrónovej difrakcie sa získali použitím rovnakého systému. Ako podpora boli použité niklové mriežky.

Na analýzu EDX boli tenké rezy tkanív obličiek zafarbené uranylacetátom a premyté ddH20 ako je uvedené vyššie, potom nasledovalo sušenie v skrini elektronického exsikátora. Vzorky boli pozorované pod transmisným elektrónovým mikroskopom JEM 2100 (JEOL) s vysokým rozlíšením pracujúcim pri 120 kV. EDX spektrá sa získali trojmo s použitím systému INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Tenké rezy HS-NP boli pozorované bez farbenia.

Príprava minerálno-organických NP.Všetky východiskové roztoky sa upravili na pH 7,4 a pred použitím sa sterilizovali filtráciou cez 0,2μm membrány. HS sa získal od zdravých ľudských dobrovoľníkov pomocou konvenčnej techniky venepunkcie. Použitie ľudských biologických tekutín v tejto štúdii schválila Inštitucionálna kontrolná rada nemocnice Linko Chang Gung Memorial Hospital a od dobrovoľníkov sa získal písomný informovaný súhlas. HS-NP boli pripravené pridaním 3 mM CaCl2 a Na2HP04 každý do DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) obsahujúceho 10 percent HS, po čom nasledovala inkubácia počas jedného týždňa v podmienkach bunkovej kultúry (37 stupňov, 5 percent CO2, zvlhčený vzduch). Častice sa peletovali centrifugáciou pri 16, 000 x g počas 15 minút pri 4 stupňoch a dvakrát sa premyli HEPES pufrom (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HP04, 150 mM NaCI) s použitím rovnakého centrifugačného postupu.

SDS-PAGE a Western blotting.Analýza SDS-PAGE a Western blot sa uskutočnila v podstate ako predtým15. Stručne, 0,2 ug (obr. 5A,D) alebo 1,2 ug (obr. 5B,C) HS proteínov, 47 ug (obr. 5A,B,D) alebo 590ug HS-NP proteínov (obr. 5C), 0,1 ug HSA (obr. 5A–D) a 0,6 ug (obr. 5A, C, D) alebo {{23} },15 ug HSF (obr. 5B) sa rozpustilo v 5x "nanášacom pufri" (0,313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 percent SDS, 0,05 percenta brómfenolová modrá, 50 percent glycerolu, 12,5 percenta - merkaptoetanol) na konečnú koncentráciu 1x, pred zahrievaním na 95 stupňov počas 5 minút a separáciou za denaturačných a redukčných podmienok na 10-percentnej SDS-PAGE s použitím minigélového systému (Hoefer, Holliston, MA). NP kontrola (použitá v dráhe 1 na obr. 5A–D) pozostávala z minerálnych NP pripravených pridaním 3 mM CaCl2 a Na2HP04 do každého DMEM (konečný objem 1 ml), po čom nasledovala inkubácia počas jedného dňa v podmienkach bunkovej kultúry; častice sa peletovali centrifugáciou pri 16, 000 x g počas 15 minút, dvakrát sa premyli HEPES pufrom a resuspendovali v 50 ul HEPES pufra. Alikvotná časť 20 ul resuspendovaných častíc sa spracovala na SDS-PAGE ako je uvedené vyššie. PVDF membrány boli blokované počas 1 hodiny v 5 % (w/v) odtučnenom mlieku pri izbovej teplote. Primárne protilátky vytvorené interne, ako je opísané vyššie25, sa použili v riedení 1:1,000 (-apo-A1 a -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , alebo 1:6,000 (-HSA). Sekundárna protilátka konjugovaná s kozou anti-králičou chrenovou peroxidázou bola použitá na základe inštrukcií poskytnutých výrobcom (Millipore, Billerica, MA). Bloty sa odhalili pomocou zvýšenej chemiluminiscencie (Amersham Biosciences, Amersham, UK) a autorádiografických filmov.

Označenie imunogold.Vzorky boli pripravené na TEM pozorovanie. Bloky HS-NP boli narezané na plátky s hrúbkou menšou ako 7 0 nm. Vzorové rezy na mriežkach boli blokované 1% rybacou želatínou (Sigma) v 0,1 M HEPES pufri (pH 8,0) počas 25 minút. Mriežky boli inkubované s nasledujúcimi primárnymi protilátkami: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Negatívna kontrola neobsahovala žiadnu primárnu protilátku (1 percento rybacej želatíny v HEPES pufri). Inkubované rezy sa premývali HEPES pufrom počas 15 minút. Opláchnuté rezy boli blokované 1 percentom rybej želatíny v HEPES pufri počas 20 minút. Vzorky boli ošetrené sekundárnym 5-nm-zlato-konjugovaným kozím anti-králičím IgG počas 1 hodiny. Vzorky sa premývali tlmivým roztokom HEPES počas 10 minút a potom sa premývali ddH20 počas 10 minút. Pozorovania TEM sa uskutočnili ako je uvedené vyššie.

Fluorescenčná mikroskopia.Histologické sklíčka s obličkovým tkanivom pripravené tak, ako je uvedené vyššie, sa blokovali 1% hovädzím sérovým albumínom počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Sklíčka boli inkubované s primárnymi polyklonálnymi protilátkami v riedení 1:4,000. Po premývacích krokoch boli vzorky inkubované so sekundárnymi protilátkami kozí anti-králičí-FITC (492/520nm) a kozí anti-králičí-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) pri 1:100 pre 1 h. Komplexy sa premývali PBST počas 15 minút. Fluorescenčné farbivo 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) sa použilo pri 10 ug/ml počas 15 minút. Vzorky zafarbené DAPI boli dehydratované 95 a 100 percentným etanolom počas 10 minút, po čom nasledovala dehydratácia v xyléne počas ďalších 10 minút. Dehydratované obličkové vzorky boli pripevnené pomocou Vectashield fluorescenčného H-1000 montážneho média (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a boli pozorované pod konfokálnym mikroskopom (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Nemecko) vybaveným kamerou Spot Flex.

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Referencie

1. Giachelli, CM Ektopická kalcifikácia: zhromažďovanie tvrdých faktov o mineralizácii mäkkých tkanív. Am J Pathol 154, 671-675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaskulárna kalcifikácia: mechanizmy a klinické dôsledky. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161-1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalcifikácia pri ateroskleróze. Nat Rev Cardiol 6, 681-688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Vzorce a rizikové faktory pre systémovú kalcifikovanú aterosklerózu. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331-336 (2004).

5. Ketteler, M. a kol. Nedostatky vápnikovo-regulačných proteínov u dialyzovaných pacientov: nový koncept kardiovaskulárnej kalcifikácie pri urémii. Kidney Int Suppl 84, S84-87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Zameranie na vaskulárnu kalcifikáciu: zmäkčenie tvrdého cieľa. Curr Opin Pharmacol 9, 84-89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Vápniková regulácia vezikúl matrix odvodených z buniek hladkého svalstva ciev. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM a kol. Kalcifikácia pri ateroskleróze: biológia kostí a chronický zápal na arteriálnej križovatke. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201 – 11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Asociácia Randallových plakov s kolagénovými vláknami a membránovými vezikulami. J Urol 187, 1094-1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biochemická charakterizácia komplexu fetuín-minerál v sére. J Biol Chem 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Sérové ​​hladiny fetuín-minerálneho komplexu korelujú s kalcifikáciou tepien u potkana. J Biol Chem 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. a kol. Hierarchická úloha fetuínu-A a kyslých sérových proteínov pri tvorbe a stabilizácii častíc fosforečnanu vápenatého. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. a kol. Nanoanalytická elektrónová mikroskopia odhaľuje základné poznatky o kalcifikácii ľudského kardiovaskulárneho tkaniva. Nat Mater 12, 576 – 583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Uvádzané nanobaktérie v ľudskej krvi ako nanočastice uhličitanu vápenatého. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549-5554 (2008).

15. Young, JD a kol. Predpokladané nanobaktérie predstavujú fyziologické zvyšky a kultivačné vedľajšie produkty normálnej vápnikovej homeostázy. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD a kol. Charakterizácia granulácií vápnika a apatitu v sére ako pleomorfných mineraloproteínových komplexov a ako prekurzorov predpokladaných nanobaktérií. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumín-minerálne komplexy pripomínajúce sérové ​​kalciové granuly a domnelé nanobaktérie: demonštrácia konceptu duálnej inhibície-očkovania. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Vzostup a pád nanobaktérií. Sci Am 302, 52-59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritické hodnotenie gama-ožiareného séra použitého ako podávač pri kultivácii a demonštrácii predpokladaných nanobaktérií a kalcifikujúcich nanočastíc. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. a kol. Komplexná proteomická analýza minerálnych nanočastíc pochádzajúcich z ľudských telesných tekutín a analyzovaných kvapalinovou chromatografiou-tandemovou hmotnostnou spektrometriou. Anal Biochem 418, 111-125 (2011).