Stanovenie echinakozidu vo vodnom extrakte Cistanche Herba pomocou HPLC

Abstrakt:

Cieľ Bola vytvorená metóda HPLC prestanovenie echinakoziduvvodný extrakt z Cistancheherba.

Metódy Echinakozid sa stanovil pomocou HPLC. Separácia sa uskutočnila na kolóne Inertsil ODS-SP C18 s mobilnou fázou pozostávajúcou z acetonitrilu (A) a 0,4 % roztoku kyseliny fosforečnej (B), gradientovou elúciou. Detekčná vlnová dĺžka bola nastavená na 333 nm a teplota kolóny bola 30 stupne. Prietok bol 1,0 ml.min-1 a vstrekovaný objem bol 10 μl. Výsledky Lineárny vzťah echinakozidu v rozsahu koncentrácií 44.{11}}.276 4 ug ·mL- 1 bol dobrý(r=0.999 8). Návratnosť bola 94,59 %-105,31 % (RSD= 2,93 %, n=9). Obsah echinakozidu vo vodných extraktoch z Cistanche herba bol 15,527, 7,347, 12,267 mg·g-1. Záver Zavedená metóda HPLC s dobrou opakovateľnosťou je presná, jednoduchá a realizovateľná. Je vhodný na stanovenie echinakozidu vo vodnom extrakte Cistanche herba.

kľúčové slová:HPLC;vodný extrakt z Cistanche herba; echinakozid; určenie obsahu

Cistanche deserticola je tonikum tradičnej čínskej medicíny bežne používané v klinickej praxi a je známe ako „púštny ženšen“ [1]. Cistanche deserticola zaznamenaná vo vydaní Čínskeho liekopisu z roku 2015 je sušená dužinatá stonka so šupinatými listami Cistanche deserticola YC Ma alebo Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Je teplý, sladký a slaný a vracia sa do meridiánov obličiek a hrubého čreva. Má účinky ako vyživuje jang obličiek, dopĺňa esenciu a krv a zvlhčuje črevá a preháňadlá [2]. "Shen Nong's Materia Medica," hovorí, že môže "tonizovať stred, vyživovať päť vnútorných orgánov, posilňovať jin a vyživovať esenciu". Cistanche deserticola obsahuje najmä fenyletanoidové glykozidy, iridoidy a ich glykozidy, lignany a ich glykozidy, polysacharidy, esterové zlúčeniny a alkaloidy [3]. Fenyletanolové glykozidy sú hlavnými aktívnymi zložkami Cistanche deserticola. Medzi nimi sú echinakozid a verbascozid uvedené v Cistanche deserticola v Čínskom liekopise.

Indikatívne zložky na identifikáciu a určenie obsahu. Farmakologické štúdie [4] ukazujú, že Cistanche deserticola má rôzne farmakologické účinky, ako je laxatívum, ochrana pečene, antiosteoporóza, antioxidant, starnutie a únava. Vodný extrakt Cistanche deserticola môže podporovať expresiu génu kostného morfogenetického proteínu 2 v potkaních osteoblastoch, kyslej fosfatázy rezistentnej na vínan, osteokalcínu v sére myší po ovariektómii a génov Smad1, mad5, transformujúceho rastového faktora- atď. v kostnej dreni. , má účinky proti osteoporóze [5-6].

Echinacea môže podporovať proliferáciu osteoblastov a podporovať diferenciáciu mezenchymálnych kmeňových buniek kostnej drene kultivovaných in vitro na osteoblasty [7-9]. V posledných rokoch sa objavilo veľa výskumných správ o stanovení obsahu echinakozidu a verbascozidu v etanolovom extrakte Cistanche deserticola a jeho zložených prípravkoch [10-12], ale existuje len málo správ o stanovení obsahu zložiek indexu v Cistanche deserticola vodný extrakt. V tejto štúdii bola na stanovenie obsahu echinaceasidu vo vodnom extrakte z Cistanche deserticola použitá vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

1 materiál

1.1 Nástroje

LC-20AT vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, SPD-20detektor, SIL-20autosampler, CTO-10stĺpcová pec ASvp, pracovná stanica LC roztokovej kvapalinovej chromatografie, Shimadzu Corporation of Japonsko; MES125P-OCE-DU elektronické analytické váhy, Sartorius Company, Nemecko; SHZ-D (Ⅲ) cirkulačná vodná viacúčelová vákuová pumpa, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Cirkulačný chladiaci systém rotačného výparníka RC2B SO25, rotačný výparník RV 10 D S96, spoločnosť IKA, Nemecko; DK-S26

Elektrický vodný kúpeľ s konštantnou teplotou, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Stroj na ultračistú vodu série UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Liečivé materiály a činidlá

Liečivý materiál Cistanche deserticola bol zakúpený od Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., číslo šarže: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, hlavný tradičný čínsky lekárnik v tretej pridruženej nemocnici Guangzhou University of Chinese Medicine, ho identifikoval ako sušená dužinatá stonka so šupinatými listami Cistanche deserticola YCMa. Vzorka je uložená v liekovej testovacej miestnosti tretej pridruženej nemocnice Guangzhou University of Chinese Medicine; Referenčná látka Glycoside Echinacea, obsah 89,7 %, Čínsky inštitút pre kontrolu potravín a liečiv, číslo šarže: 111670-

201706; acetonitril je chromatograficky čistý (Merck, Nemecko); metanol a kyselina fosforečná sú analyticky čisté (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); voda je ultračistá voda.

2 Metódy a výsledky

2.1 Príprava vodného extraktu z Cistanche deserticola

Vezmite hrubý prášok liečivého materiálu Cistanche deserticola, pridajte 10-násobok množstva destilovanej vody, dvakrát zahrejte a varte pod spätným chladičom na extrakciu, zakaždým po 1 hodine, prefiltrujte, filtrát spojte a filtrát zahustite na rotačnej odparke. na obsah surovej drogy 0,100 g·mL-1 a skladujte ju pri 4 stupňoch na neskoršie použitie.

2.2 Chromatografické podmienky a vhodnosť systému

Chromatografická kolóna: kolóna Inertsil ODS SP C18 (15 0 mm x 4,6 mm, 5 um); mobilná fáza: acetonitril (A)-0,4% roztok kyseliny fosforečnej (B), gradientová elúcia: 0 ~ 5 min, 17%

A; 5 ~ 25 min, 2 0 % A; 25 ~ 30 min, 17 % A; detekčná vlnová dĺžka: 333 nm; teplota kolóny: 30 stupňov; prietok: 1,0 ml·min{10}};

Objem vstreku: 10 μL. Za týchto chromatografických podmienok je separácia medzi píkmi echinakozidu a susedných zložiek väčšia ako 1,5 a počet teoretických poschodí založených na píku echinaceazidu by nemal byť menší ako 4,000. Chromatogram je znázornený na obrázku 1.

2.3 Príprava roztoku

2.3.1 Roztok referenčnej látky Odvážte primerané množstvo referenčnej látky echinakozidu, presne ju odvážte, vložte do 10 ml odmernej banky, pridajte metanol, aby sa rozpustila, a pripravte roztok referenčnej látky s obsahom 898,794 ug echinaceazidu na ml, 4 stupne Uložte na neskoršie použitie.

2.3.2 Skúšobný roztok

Presne odmerajte 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odparte do sucha vo vodnom kúpeli, pridajte metanol, aby sa rozpustil, rozrieďte na objem v 10 ml odmernej banke, dobre pretrepte a prefiltrujte s získať 0,22 μm mikroporéznu membránu.

2.4 Skúmanie lineárneho vzťahu

Presne zmerajte {{0}},25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 ml referenčného roztoku podľa bodu 2.3.1, vložte ho do 5 ml odmernej banky, pridajte metanol na doplnenie objemu a dobre pretrepte, aby ste získali gradientovú koncentráciu 44.{17} }, 89.{19}}. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 referenčný roztok, prefiltrovaný cez 0,22 μm mikroporéznu membránu. Zmerajte podľa chromatografických podmienok podľa bodu 2.2 a zaznamenajte plochu píku. Vykonajte lineárnu regresiu s hmotnostnou koncentráciou referenčnej látky ako vodorovnou osi (X, ug·mL-1) a plochou píku na osi y (Y) a získajte regresnú rovnicu: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Výsledky ukazujú, že echinacea má dobrý lineárny vzťah v rozsahu koncentrácií 44.{41}} ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Skúška presnosti

Vezmite 539.276 4 ug ·mL- 1 referenčného roztoku, vstreknite a merajte 6-krát nepretržite podľa chromatografických podmienok podľa bodu 2.2 a zaznamenajte plochu píku. Výsledky ukázali, že RSD oblasti piku echinakozidu bola 1,81 %, čo naznačuje dobrú presnosť prístroja.

2.6 Skúška stability

Presne odmerajte 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odparte do sucha vo vodnom kúpeli, pridajte metanol, aby sa rozpustil, zrieďte do 10 ml odmernej banky, dobre pretrepte, prefiltrujte cez {{ 7}}.22 μm mikroporézna membrána, dodržujte chromatografické podmienky podľa bodu 2.2 a umiestnite na 0 a 2, v tomto poradí. , 4, 8, 12, 24 h meranie injekcie, zaznamenajte oblasť píku. Výsledky ukázali, že RSD oblasti piku echinakozidu bola 1,16 %, čo naznačuje, že testovaný roztok mal dobrú stabilitu do 24 hodín.

2.7 Skúška opakovateľnosti

Presne odmerajte 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola a pripravte paralelne 6 testovacích roztokov podľa metódy v bode 2.3.2. Nastreknite vzorky na meranie podľa chromatografických podmienok podľa bodu 2.2 a zaznamenajte plochu píku. Výsledky ukázali, že RSD zechinakozidhmotnostná koncentrácia bola 1,28 %, čo naznačuje dobrú opakovateľnosť metódy.

2.8 Test obnovy vzorky

Presne odmerajte 9 porcií 1.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, pridajte 0,8, 1.0 a 1,2 ml referenčného roztoku (1,552 mg·mL{{11 }}), odparte do sucha vo vodnom kúpeli, pridajte metanol na rozpustenie a upravte do 10ml odmernej banky; Dobre pretrepte a prefiltrujte cez 0,22 μm mikroporéznu membránu, aby ste pripravili testovacie roztoky s vysokou, strednou a nízkou koncentráciou. Pripravte paralelne 3 kópie každej koncentrácie. Zmerajte podľa chromatografických podmienok v bode 2.2. Zaznamenajte plochu píku a vypočítajte výťažnosť vzorky. ohodnotiť. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

2.9 Stanovenie obsahu vzorky

Presne odmerajte 3 dávky z 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odparte do sucha vo vodnom kúpeli, pridajte metanol, aby sa rozpustil, zrieďte do 10 ml odmernej banky, dobre pretrepte a prefiltrujte s 0,22 μm mikroporéznu membránu a merajte podľa chromatografických podmienok podľa bodu 2.2. Zaznamenajte oblasť píku a vypočítajte obsah echinaceaside. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 1 Výsledky testov obnovy echinakozidu

Tabuľka 2 Výsledky stanovenia obsahu echinakozidu vo vodnom extrakte z Cistanche herba